芽胞結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展

紀(jì) 芳，梁 勇

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

在遭遇逆境時(shí)，多數(shù)細(xì)菌都能以某種程度停滯生長，以等待合適條件的來臨，最常見的如芽胞桿菌屬Bacillus spp.和梭狀芽胞桿菌屬Clostridi?um spp.，其在營養(yǎng)受限的條件下可以產(chǎn)生芽胞。芽胞是一種休眠形式的細(xì)胞，能抵抗多種不利條件而存活下來，比如高溫、高寒、高壓、放射線、營養(yǎng)缺乏、殺菌劑等，少數(shù)甚至能耐受外太空的惡劣條件，一些芽胞在歷經(jīng)數(shù)百萬年以上仍能保持休眠狀態(tài)。當(dāng)環(huán)境條件改善時(shí)，休眠芽胞就會(huì)活化、萌發(fā)并且脫出外殼，細(xì)胞體積迅速增大，形成營養(yǎng)體細(xì)胞，緊接著以二分裂的方式進(jìn)行營養(yǎng)期繁殖。芽胞的高度抗逆性提高了細(xì)菌的存活力，但給食品工業(yè)帶來了麻煩，也是導(dǎo)致患者腹瀉的重要原因［1］。

芽胞具有高度的抗逆性，學(xué)者們對芽胞的結(jié)構(gòu)和組成有著濃厚的興趣，開展了大量的研究工作。目前對芽胞的了解主要來自于芽胞桿菌屬，筆者對芽胞結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 芽胞的主要結(jié)構(gòu)

芽胞有一些保護(hù)性構(gòu)造，形成一系列同心的殼層，每一層都對芽胞的耐受力起著不可缺少的作用，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。常以枯草芽胞桿菌Bs（Bacillus.subtilis）為模式菌對芽胞進(jìn)行研究，其芽胞從內(nèi)至外可分為芽胞內(nèi)核、芽胞皮層、芽胞衣3層結(jié)構(gòu)。而很多其他芽胞桿菌特別是蠟狀芽胞桿菌Bc（Bacillus.cereus）在芽胞衣外還有一層被稱為芽胞外壁的松散泡狀結(jié)構(gòu)，如圖2［2］所示。

圖1 芽胞的結(jié)構(gòu)圖

圖2 金屬投影法掃描電鏡觀察Bc的芽胞

1.1 芽胞內(nèi)核

芽胞內(nèi)核由一層薄膜包裹，里面含有與酸溶性蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA、蛋白質(zhì)、RNA、脂類、核糖體、酶，少量的糖和鹽類［3］。內(nèi)核的含水量很低，只有28%～57%，有助于抵抗高溫和化學(xué)物質(zhì)［4］，很好地保護(hù)了DNA。

1.2 芽胞皮層

芽胞皮層較厚，含黏性復(fù)合物。主要成分為肽聚糖，與營養(yǎng)體細(xì)胞的肽聚糖相似，但結(jié)構(gòu)松散，肽聚糖的交聯(lián)程度很低，且不含營養(yǎng)體細(xì)胞的多聚糖磷壁酸。皮層維持著芽胞內(nèi)核的形態(tài)，使其保持干燥狀態(tài)并具耐熱性能［5］。

1.3 芽胞衣

芽胞衣是一種緊密覆蓋在皮層外的多層次蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，其層次數(shù)量和表面形態(tài)的復(fù)雜性依種的不同有明顯差異［1］。傳統(tǒng)上，Bs的芽胞衣可分為兩層：一個(gè)染色較深的外層和一個(gè)染色較淺的內(nèi)層。外層由交叉的桿狀物組成，內(nèi)層由六角形的穿孔物組成，孔位于六角形的中央，并常有一等同直徑的顆粒狀填充物。最近一項(xiàng)精細(xì)的研究把Bs的芽胞衣結(jié)構(gòu)根據(jù)蛋白的種類分為4層［6］。

芽胞衣的大部分成分是蛋白質(zhì)，含少量的糖類（6%）。最近一項(xiàng)研究［7］發(fā)現(xiàn)，在芽胞桿菌的芽胞衣里還沉積著一層硅元素，可以提高芽胞的抗酸性。硅元素在土壤和水中是天然存在的，這意味著細(xì)菌可以自然地?cái)z入硅。當(dāng)細(xì)菌遇到酸性環(huán)境時(shí)，比如動(dòng)物的胃液，芽胞中沉積的硅鹽層將有助于細(xì)菌的存活。

芽胞衣形態(tài)學(xué)上的復(fù)雜性反映了其蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜性。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過70種芽胞衣蛋白［6］，學(xué)者們對其中一些已做了精細(xì)的分析［8-10］。芽胞衣蛋白有可溶性和不可溶型兩類，前者大概占70%。不可溶的芽胞衣蛋白多具有二硫鍵，其他的交聯(lián)方式包括二酪氨酸的交聯(lián)和賴氨酸的交聯(lián)。芽胞衣的化學(xué)性質(zhì)和抗性機(jī)制很可能與蛋白質(zhì)的重度交聯(lián)有關(guān)。組成芽胞衣的蛋白中既有結(jié)構(gòu)蛋白，也有起控制裝配作用的蛋白。在實(shí)驗(yàn)室條件下研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)芽胞衣蛋白對于發(fā)揮芽胞衣的屏障功能無關(guān)緊要，因?yàn)槿笔渲腥魏我粋€(gè)基因都檢測不到異常。但是兩個(gè)關(guān)鍵的蛋白除外，即SpoIVA和CotE。SpoIVA位于芽胞衣和皮層之間，將芽胞衣與芽胞表面相連接，如果沒有SpoIVA，芽胞衣可以形成，但不能附著于芽胞。CotE則定位于外芽胞衣和內(nèi)芽胞衣之間的交界面，它負(fù)責(zé)整個(gè)外芽胞衣以及幾個(gè)內(nèi)芽胞衣蛋白的裝配。另外有幾種蛋白也有介導(dǎo)裝配的功能，研究較多的是SpoVID和SafA，它們在芽胞裝配的早期發(fā)揮一定的作用。研究表明，SpoVID和CotE在芽胞衣的形成過程中直接發(fā)生相互作用［11］。在Bs中，對芽胞衣裝配起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)通常也影響萌發(fā)。一項(xiàng)研究［6］結(jié)果顯示，大多數(shù)芽胞衣蛋白在一個(gè)主要的與形態(tài)發(fā)生有關(guān)的蛋白質(zhì)的控制下進(jìn)行裝配。

1.4 芽胞外壁

與Bs不同，Bc和其他一些種在芽胞衣外多了一層芽胞外壁。芽胞外壁不與芽胞衣直接相連，中間被暫名為衣壁空間（interspace）的區(qū)域隔開，如圖1所示。處于衣壁空間中物質(zhì)的性質(zhì)仍然未知。芽胞外壁對芽胞抗性所起的作用還未見報(bào)道，它在諸如Bs等一些種中是缺乏的，而這些菌種同樣能經(jīng)受環(huán)境壓力?？赡苎堪獗谠谔厥獾男∩郴蛏芷谥屑胺且话阈缘谋Ｗo(hù)或萌發(fā)中發(fā)揮一定的作用。因?yàn)檠堪芯康哪Ｊ骄鶥s缺乏芽胞外壁，所以對芽胞外壁的研究尤其在分子細(xì)節(jié)方面相對較薄弱。

Bc的芽胞外壁比較相似，在電子顯微鏡下觀察可分為兩層，內(nèi)層為基質(zhì)層，外層為著生在基質(zhì)層上的絨毛樣層（如圖3［12］所示）。芽胞外壁含有蛋白質(zhì)、脂類和糖類物質(zhì)，各占干重的43%～52%、15%～18%以及23%。

如前文所述，因?yàn)檠芯垦堪l(fā)育的模式菌Bs沒有芽胞外壁，所以對芽胞外壁的研究在分子水平上與芽胞衣相比相對不足。近年來不斷發(fā)生的恐怖襲擊活動(dòng)，使人們對生物武器有了更多的關(guān)注，從而也加強(qiáng)了研究相關(guān)細(xì)菌及其芽胞的緊迫性。最近的研究主要集中在炭疽芽胞桿菌Ba（Bacillus anthracis）芽胞和哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)之間的相互作用和發(fā)展更準(zhǔn)確快捷的芽胞檢測手段。這兩方面的研究都需要清楚了解Ba芽胞的最外層即芽胞外壁的分子細(xì)節(jié)。因?yàn)檫@層囊泡樣的芽胞外壁是芽胞直接接觸外部環(huán)境或宿主細(xì)胞的部分。初步分析芽胞外壁至少含有12種不同的蛋白質(zhì)和糖蛋白［13］。

圖3 芽胞外壁結(jié)構(gòu)圖

現(xiàn)在已經(jīng)在Ba芽胞外壁的絨毛層中鑒定出兩種糖蛋白：BclA和 BclB［14-15］，是主要結(jié)構(gòu)蛋白。BclA在細(xì)胞中以糖基化形式存在，且具有一個(gè)CLR（collagen-like region，類似膠原蛋白的區(qū)域），這兩項(xiàng)特征在原核生物的蛋白質(zhì)中都是罕見的。而另一種絨毛樣外層的結(jié)構(gòu)蛋白BclB，也是一種類似膠原蛋白的糖蛋白，與BclA相比含量較少，但對芽胞外壁結(jié)構(gòu)的裝配與保持也起重要作用［14］。

芽胞外壁的基質(zhì)內(nèi)層也由數(shù)種不同蛋白質(zhì)所組成［13，16］。2005 年 C.T.Steichen 等［13］首先對其中的BxpB進(jìn)行了深入研究，其結(jié)果顯示BxpB是基質(zhì)層的組成蛋白之一，與BclA、潛在的基質(zhì)層蛋白ExsY及其他幾種蛋白質(zhì)一起組成一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合體，并且它對BclA附著到芽胞外壁是必須的，還對芽胞的萌發(fā)有一定的抑制。bxpB基因缺失突變株的芽胞外壁雖然失去了絨毛樣外層，但基質(zhì)層的外觀沒有明顯變化，說明是另外幾種蛋白質(zhì)決定了基質(zhì)層的外觀性質(zhì)。2006年，M.J.Johnson等［17］以 B.cereus為 研 究 對 象 ，J.A.Boydston等［18］以B.anhracis為研究對象，分別發(fā)表論文闡述了基質(zhì)層中的另一種蛋白質(zhì)ExsY于芽胞外壁形成中所起的作用。兩人的研究結(jié)果都顯示ExsY對于芽胞外壁的正常裝配是不可缺少的。如果exsy缺陷，則在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生的芽胞會(huì)失去芽胞外壁，在固體培養(yǎng)基中的芽胞僅在一極具有帽子樣的芽胞外壁片段。2011年又定位了一種基質(zhì)層蛋白BetA，也具有類似膠原的結(jié)構(gòu)域，與芽胞外壁的組裝有關(guān)［19］。

多位學(xué)者的研究都顯示芽胞外壁不正?；蛲耆笔У腂a突變株其原有的毒力不受影響，說明芽胞外壁與病原菌的致病性無關(guān)，但仍然對芽胞有其他影響，比如導(dǎo)致萌發(fā)效率下降等。弄清楚芽胞外壁在芽胞的抗性、致病性以及在環(huán)境中的維持能力方面所起的作用是未來研究的一個(gè)重要方向。

2 芽胞的其他特殊構(gòu)造

對芽胞桿菌屬中的蘇云金芽胞桿菌Bt（Bacil?lus.thuringiensis）來說，芽胞的形成是其正常生活周期的一個(gè)階段，而不僅是對不良環(huán)境的簡單反應(yīng)［20］，其完整生命循環(huán)包括營養(yǎng)體細(xì)胞和芽胞的交替形成。Bt在芽胞形成的過程中會(huì)形成一種特殊成分，稱為伴胞晶體，是一類毒殺昆蟲的活性物質(zhì)，能夠在昆蟲堿性的腸道中溶解致昆蟲死亡。由于這類伴胞晶體能高效殺蟲且對人畜無毒，現(xiàn)已成為生物農(nóng)藥的主要成分之一。

不同Bt的伴胞晶體在大小、形狀和數(shù)量上各有差異。晶體形成的位置通常有兩種，游離型和粘聯(lián)型。多數(shù)晶體形成于芽胞外壁以外，芽胞成熟時(shí)母細(xì)胞會(huì)破裂，釋放出游離晶體，稱為游離型（圖4A［21］）；少數(shù)形成于衣壁空間（interspace），芽胞成熟釋放后不與芽胞分離，稱為粘聯(lián)型（圖4B［21］），目前已有報(bào)道的有粘聯(lián)型晶體的菌種僅有近10種，如蘇云金芽胞桿菌幕蟲亞種幕蟲亞種B.thuringiensis subsp.finitimus和華中亞種B.thuringiensis subsp.huazhongensis。而通過基因克隆技術(shù)，一個(gè)細(xì)胞內(nèi)甚至可以同時(shí)出現(xiàn)兩種晶體，如圖 4C［21］所示。

圖4 芽胞與伴胞晶體的薄層透射電鏡照片

在某些Bt的芽胞外壁表面還出現(xiàn)單根菌毛結(jié)構(gòu)，它由芽胞外壁底部伸出，鄰近伴胞晶體，如圖5［22］所示，且在芽胞萌發(fā)為營養(yǎng)體時(shí)也會(huì)繼續(xù)附著在細(xì)胞上。

而在不產(chǎn)晶體的Bc的芽胞外壁內(nèi)側(cè)也可經(jīng)?？吹奖∑瑯拥牟贿B續(xù)的伴胞包涵體，如圖6［2］中箭頭所指，其成分和功能尚有待進(jìn)一步研究。

3 芽胞的動(dòng)態(tài)變化

圖5 有菌毛結(jié)構(gòu)的蘇云金芽胞桿菌Bt2-56的電子顯微鏡照片

圖6 Bc的完整芽胞的透射電鏡照片

芽胞保護(hù)性構(gòu)造的一個(gè)最關(guān)鍵的功能就是牢牢鎖住DNA，使其保持一種穩(wěn)定干燥的結(jié)晶態(tài)，將其與有害分子隔離開。芽胞的這種休眠特性，以及干燥堅(jiān)硬以保護(hù)DNA的特點(diǎn)很容易讓人以為它是非常穩(wěn)固的，沒有可運(yùn)動(dòng)變化的部分?？墒?，研究發(fā)現(xiàn)Bt芽胞的大小能根據(jù)相對濕度的變化發(fā)生明顯改變，如圖7所示，其改變幅度甚至可達(dá)到平均30%。而相對濕度是芽胞存在的自然環(huán)境如土壤中最易改變的一個(gè)參數(shù)。前面已提到，芽胞皮層主要是松散交聯(lián)的肽聚糖，其交聯(lián)程度是可以發(fā)生變化的。這種變化能改變皮層的彈性，同時(shí)改變其膨脹或收縮以應(yīng)對離子濃度變化的能力。而在以前，這種變化被認(rèn)為是芽胞核脫水所致。Dricks等在用原子力顯微鏡AFM對芽胞進(jìn)行觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)芽胞衣呈現(xiàn)出眾多的嵴狀突起，如圖8［23］所示，這正是芽胞衣折疊的表現(xiàn)。這種折疊說明了芽胞衣還有相當(dāng)大的膨脹擴(kuò)展空間，以適應(yīng)于不同的濕度環(huán)境和芽胞萌發(fā)。在環(huán)境濕度和溫度恒定的條件下測量芽胞的大小，或觀察比較芽胞表面嵴狀突起的差異，可以作為區(qū)分不同種的參考依據(jù)。

4 結(jié)語

圖7 相對濕度的變化引起芽胞形態(tài)變化的結(jié)果

圖8 對B.subtilis芽胞的AFM分析照片

芽胞是很多細(xì)菌在不利環(huán)境條件下產(chǎn)生的休眠體，能夠抵抗多種極端的環(huán)境壓力，在保存自身、頑強(qiáng)存活的同時(shí)，也給人類的生活和健康帶來了不利的影響。芽胞強(qiáng)大的耐受能力顯然與其特殊的構(gòu)造有關(guān)。芽胞的結(jié)構(gòu)一般可分為內(nèi)核、皮層、芽胞衣這3個(gè)大的層次，有的在芽胞衣外還有一層芽胞外壁。每一層結(jié)構(gòu)的形成與裝配都受到嚴(yán)格的調(diào)控。通常認(rèn)為主要由前3種的特殊組成和性質(zhì)來提供芽胞的抗逆性。但是對于一些病原菌來說，芽胞外壁是其與宿主直接接觸的部分，因此也得到學(xué)者們的關(guān)注。

對芽胞的研究不僅有助于消除芽胞的抗逆性帶來的不利影響，同時(shí)芽胞作為一種研究細(xì)胞復(fù)雜結(jié)構(gòu)的裝配與調(diào)控的理想模型，也具有重要的理論研究意義。

［1］Higgins D，Dworkin J.Recent progress in Bacillus subti?lis sporulation［J］.FEMS Microbiol Rev，2012，36（1）：131-148.

［2］Gerhardt P，Ribi E.Ultrastructure of the exosporium en?veloping spores of Bacillus cereus［J］.J Bacteriol，1964，88：1774-1789.

［3］Setlow P.I will survive：DNA protection in bacterial spores［J］.Trends Microbiol，2007，15（4）：172-180.

［4］Sunde E P，Setlow P，Hederstedt L，et al.The physical state of water in bacterial spores［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（46）：19334-19339.

［5］Leggett M J，McDonnell G，Denyer S P，et al.Bacteri?al spore structures and their protective role in biocide resistance［J］.J Appl Microbiol，2012，113（3）：485-498.

［6］McKenney P T，Driks A，Eskandarian H A，et al.A dis?tance-weighted interaction map reveals a previously un?characterized layer of the Bacillus subtilis spore coat［J］.Curr Biol，2010，20（10）：934-938.

［7］Hirota R，Hata Y，Ikeda T，et al.The silicon layer sup?ports acid resistance of Bacillus cereus spores［J］.J Bac?teriol，2010，192（1）：111-116.

［8］Kodama T，Matsubayashi T，Yanagihara T，et al.A novel small protein of Bacillus subtilis involved in spore germination and spore coat assembly［J］.Biosci Biotech?nol Biochem，2011，75（6）：1119-1128.

［9］Masayama A，Kato S，Terashima T，et al.Bacillus sub?tilis spore coat protein LipC is a phospholipase B［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2010，74（1）：24-30.

［10］Kuwana R，Takamatsu H，Watabe K.Expression，lo?calization and modification of YxeE spore coat protein in Bacillus subtilis［J］.J Biochem，2007，142（6）：681-689.

［11］Qiao H，Krajcikova D，Xing C，et al.Study of the inter?actions between the key spore coat morphogenetic pro?teins CotE and SpoVID［J］.J Struct Biol，2013，181（2）：128-135.

［12］Henriques A O，Moran C P Jr.Structure，assembly，and function of the spore surface layers［J］.Annu Rev Microbiol，2007，61：555-588.

［13］Steichen C T，Kearney J F，Turnbough C L Jr.Charac?terization of the exosporium basal layer protein BxpB of Bacillus anthracis［J］.J Bacteriol，2005，187（17）：5868-5876.

［14］Thompson B M，Hoelscher B C，Driks A，et al.Assem?bly of the BclB glycoprotein into the exosporium and evi?dence for its role in the formation of the exosporium"cap"structure in Bacillus anthracis［J］.Mol Microbi?ol，2012，86（5）：1073-1084.

［15］Thompson B M，Waller L N，F(xiàn)ox K F，et al.The BclB glycoprotein of Bacillus anthracis is involved in exospo?rium integrity［J］.J Bacteriol，2007，189（18） ：6704-6713.

［16］Swiecki M K，Lisanby M W，Shu F，et al.Monoclonal antibodies for Bacillus anthracis spore detection and functional analyses of spore germination and outgrowth［J］.J Immunol，2006，176（10）：6076-6084.

［17］Johnson M J，Todd S J，Ball D A，et al.ExsY and CotY are required for the correct assembly of the exospo?rium and spore coat of Bacillus cereus［J］.J Bacteriol，2006，188（22）：7905-7913.

［18］Boydston J A，Yue L，Kearney J F，et al.The ExsY protein is required for complete formation of the exospo?rium of Bacillus anthracis［J］.J Bacteriol，2006，188（21）：7440-7448.

［19］Thompson B M，Hoelscher B C，Driks A，et al.Local?ization and assembly of the novel exosporium protein BetA of Bacillus anthracis［J］.J Bacteriol，2011，193（19）：5098-5104.

［20］喻子牛.蘇云金桿菌［M］.北京：科學(xué)出版社，1990.

［21］Ji F，Zhu Y，Ju S，et al.Promoters of crystal protein genes do not control crystal formation inside exosporium of Bacillus thuringiensis ssp.finitimus strain YBT-020［J］.FEMS Microbiol Lett，2009，300（1）：11-17.

［22］Rampersad J，Khan A，Ammons D.A Bacillus thuringi?ensis isolate possessing a spore-associated filament［J］.Curr Microbiol，2003，47（4）：355-357.

［23］Chada V G，Sanstad E A，Wang R，et al.Morphogene?sis of bacillus spore surfaces［J］.J Bacteriol，2003，185（21）：6255-6261.