高壓熱殺菌技術(shù)滅活細(xì)菌芽胞機(jī)理研究進(jìn)展

申 瑾， 郭家俊， 陳 翔， 吳 珊， 包軍鵬， 章 中

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

1 HPTS技術(shù)簡(jiǎn)介

高壓熱殺菌技術(shù)(High-pressure Thermal Sterilization，HPTS)是指將靜態(tài)超高壓和熱耦合起來用于殺菌，通常所用壓力為400～900 MPa，通常所用溫度為50～90 ℃。HPTS殺菌技術(shù)比傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)的熱處理強(qiáng)度低，可以生產(chǎn)出質(zhì)量更高的食品[1]。隨著消費(fèi)者對(duì)天然、新鮮、安全和最少加工食品的需求日益增長(zhǎng)，HPTS引起了人們極大的興趣。HPTS是一種新興的生產(chǎn)貨架穩(wěn)定、低酸食品的技術(shù)，能滅活細(xì)菌芽胞，并使食品具有較好的感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[2]。目前，HPTS還沒有廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)中，部分原因是由于其殺滅細(xì)菌芽胞的機(jī)理尚不為人知。

2 芽胞對(duì)食品保藏與安全的影響

芽胞是細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體在缺乏營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境條件下形成的休眠態(tài)，可以休眠幾萬年以上而復(fù)活，對(duì)各種殺菌處理(如輻照、超高壓、熱、超聲波、微波、化學(xué)物質(zhì)等)有最強(qiáng)的耐受能力。在食品工業(yè)中，常因?yàn)闅⒕鷱?qiáng)度不夠而發(fā)生由芽胞導(dǎo)致的食品腐敗和食物中毒問題[3]。高抗性芽胞的殺滅是低酸性食品安全的一個(gè)關(guān)鍵問題[4]。芽胞萌發(fā)后迅速生長(zhǎng)而引起低酸性食品腐敗。有數(shù)據(jù)顯示，每年有35%的果汁污染與嗜酸芽胞桿菌有關(guān), 歐洲果汁協(xié)會(huì)2011年的調(diào)查發(fā)現(xiàn),45%的果汁生產(chǎn)企業(yè)發(fā)生過脂環(huán)酸芽胞桿菌污染引起的腐敗事件[5]。美國(guó)佛羅里達(dá)州市售的180種熱帶和亞熱帶的水果濃縮汁中,6.1%的樣品存在脂環(huán)酸芽胞桿菌污染現(xiàn)象[6]。有報(bào)道分析了新西蘭乳業(yè)超過10年的數(shù)據(jù),證實(shí)乳粉中嗜熱芽胞的數(shù)量有時(shí)<10 個(gè)/g,有時(shí)可>105個(gè)/g，對(duì)乳粉造成了很大損害[7]。同時(shí)芽胞也在對(duì)人體造成危害，芽胞桿菌和梭狀芽胞桿菌的芽胞可導(dǎo)致多種食源性疾病，從輕微的嘔吐到危及生命的毒素中毒。據(jù)報(bào)道地衣芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌與某些食源性疾病的暴發(fā)有關(guān)[8-9]。

3 細(xì)菌芽胞的結(jié)構(gòu)及其殺菌抗性

芽胞的極端殺菌抗性與其特殊結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)[8,10-12]。芽胞的結(jié)構(gòu)與其營(yíng)養(yǎng)體非常不同。芽胞從外到里有七層結(jié)構(gòu)，分別是孢外壁、芽胞衣、外膜、皮層、細(xì)胞壁、內(nèi)膜、內(nèi)核[13]。孢外壁是芽胞的最外層，由碳水化合物和蛋白質(zhì)組成，不同類型的芽胞，孢外壁的大小差異很大，而且這層結(jié)構(gòu)與芽胞的抗性沒有任何作用[14]。芽胞衣主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，它使得芽胞對(duì)許多化學(xué)物質(zhì)有抗性，也能保護(hù)芽胞免受外源皮層裂解酶的攻擊。芽胞衣之下是外膜，它之下是芽胞的皮層(cortex)。皮層占芽胞體積36%～60%，皮層的滲透壓為2.0 MPa左右，含水量70%，略低于營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞(80%)，但比芽胞整體的平均含水量高出許多,芽胞的皮層對(duì)其抗壓性有關(guān)鍵影響。皮層之下是芽胞的細(xì)胞壁，由肽聚糖構(gòu)成，接下來是芽胞的內(nèi)膜，它是完整的，是生長(zhǎng)中的細(xì)胞胞質(zhì)膜的類似物，具有很強(qiáng)的滲透性屏障，阻礙了損傷DNA的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入，芽胞萌發(fā)后內(nèi)膜成為營(yíng)養(yǎng)體的細(xì)胞膜。

芽胞內(nèi)核的一個(gè)重要生物化學(xué)特性就是其水分含量極低，僅有25%～50%，而營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞水分含量為80%左右，芽胞核心含水量低是導(dǎo)致其休眠和耐熱性的關(guān)鍵因素之一[11]。皮層通過擠壓核心來促進(jìn)水分的流失，這伴隨著DPA的積累。芽胞中的DPA含量高，DPA含量約占內(nèi)核干重的20%，其鈣鹽是細(xì)菌芽胞殺菌抗性的原因之一[15]。小分子酸溶性蛋白(Small acid-soluble protein, SASP)占芽胞內(nèi)核總蛋白的3%～6%。缺乏a/β SASP的突變芽胞對(duì)紫外線、熱、過氧化物、電離輻射和其他殺菌處理的敏感性提高。

4 HPTS對(duì)細(xì)菌芽胞的殺滅作用

4.1 HPTS對(duì)細(xì)菌芽胞的殺滅效果

Ahn等[16]報(bào)道了HPTS處理下牛奶中嗜硬脂熱芽胞的數(shù)量減少了6個(gè)對(duì)數(shù)值。Ates等[17]報(bào)道HPTS(650 MPa、65 ℃、10 min)能殺滅4.5個(gè)對(duì)數(shù)的枯草芽胞桿菌芽胞。Evelyn等[18]報(bào)道HPTS處理下牛肉泥中蠟樣芽胞桿菌芽胞減少了4.9個(gè)對(duì)數(shù)值。Evelyn等[19]研究了芽胞對(duì)熱、高壓熱處理和單獨(dú)熱處理的抗性差異的比較發(fā)現(xiàn)HPTS(600 MPa、75 ℃)處理蠟樣芽胞桿菌芽胞具有顯著效果。Izabela等[20]發(fā)現(xiàn)在300 MPa、50 ℃、15 min條件下處理蘋果汁，能有效殺滅蘋果汁中的酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌芽胞，且蘋果汁濃度會(huì)影響殺滅效果。隨著殺菌壓力和溫度的升高，芽胞萌發(fā)和失活也在增強(qiáng)。L. Reverter-Carrióna等[21]發(fā)現(xiàn)在壓力為200、300 MPa，溫度為50、70 ℃都能有效殺滅芽胞。Maier MB等[22]報(bào)道HPTS(600 MPa,100 ℃)處理下肉毒梭狀芽胞桿菌減少了6個(gè)對(duì)數(shù)值。

4.2 HPTS處理下細(xì)菌芽胞滅活動(dòng)力學(xué)

預(yù)測(cè)HPTS滅活芽胞的數(shù)學(xué)模型可以讓制造商預(yù)測(cè)和控制食品的安全性和貨架穩(wěn)定性。Zhu等[23]研究了HPTS殺滅生芽胞梭狀芽胞桿菌PA3679芽胞的動(dòng)力學(xué)，對(duì)于壓力從700 MPa到900 MPa、溫度為80 ℃時(shí)，D值為15.8到7.0 min。Gao等[24]研究了食品成分對(duì)HTPS處理下嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞死亡程度的影響，建立了二次模擬方程來預(yù)測(cè)食品成分和pH值對(duì)HPTS處理下芽胞死亡的影響。得出大豆蛋白質(zhì)、豆油等和食品的pH值能顯著地影響該菌芽胞對(duì)HPTS的抗性。Silva等[25]用一階Bigelow模型很好地描述了HPTS對(duì)酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌芽胞的殺滅效果。Wang等[26]報(bào)道嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞對(duì)HPTS的耐受力比凝結(jié)芽胞桿菌芽胞強(qiáng)，Log-logistic模型對(duì)芽胞死亡曲線的擬合效果最好，Weibull模型次之。Luu-Thi等[27]報(bào)道HPTS(300～600 MPa、60～100 ℃)能殺滅蠟樣芽胞桿菌芽胞，HPTS處理下芽胞死亡初期較快、后期較慢，但兩個(gè)階段均可用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型描述。Evelyn等[28]報(bào)道HPTS(400～600 MPa、70 ℃)能殺滅牛奶中的蠟樣芽胞桿菌芽胞，Weibull模型能很好地描述芽胞死亡動(dòng)力學(xué)。Uchida[29]報(bào)道HPTS(600 MPa、65 ℃)能殺滅酸土脂環(huán)酸芽胞桿菌芽胞，隨著芽胞懸浮液中可溶性固形物濃度升高，殺菌動(dòng)力學(xué)曲線的D值增大。

5 HPTS殺滅芽胞的機(jī)理

目前，HPTS對(duì)細(xì)菌芽胞的良好殺滅作用已得到公認(rèn)，但對(duì)HPTS殺滅芽胞的機(jī)理尚不完全明確。當(dāng)前主要有兩種觀點(diǎn)，第一種觀點(diǎn)認(rèn)為HPTS直接破壞了芽胞結(jié)構(gòu)或鈍化了芽胞的酶，從而殺滅芽胞。第二種觀點(diǎn)認(rèn)為HPTS先導(dǎo)致芽胞萌發(fā)，芽胞萌發(fā)后失去極端抗性而被殺滅。

5.1 HPTS直接破壞芽胞結(jié)構(gòu)或鈍化芽胞內(nèi)源酶

曾慶梅等[30]研究了HPTS對(duì)枯草桿菌芽胞超微結(jié)構(gòu)的影響，采用透射電鏡進(jìn)行觀察，觀察結(jié)果表明：超高壓處理后枯草芽胞桿菌的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞壁皺縮，出現(xiàn)缺口，胞漿泄漏，結(jié)構(gòu)層次感消失，出現(xiàn)大片透電子區(qū)；其芽胞外殼被破壞，出現(xiàn)缺口，芽胞內(nèi)含物結(jié)構(gòu)紊亂，泄漏，出現(xiàn)部分透電子區(qū)，甚至內(nèi)含物質(zhì)完全泄漏，出現(xiàn)細(xì)胞壁或孢子外殼殘留，芽胞大量被殺滅。高瑀瓏等[31]采用比色法研究了HPTS對(duì)枯草芽胞桿菌與嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞的影響，結(jié)果表明，HPTS處理芽胞能夠顯著提高芽胞DPA的泄漏率(P<0.05)，能夠破壞芽胞的結(jié)構(gòu)，芽胞內(nèi)膜通透性屏障被破壞，顯著提高了芽胞DPA的泄漏率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明HPTS殺滅枯草芽胞桿菌與嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞的原因可能是其物理結(jié)構(gòu)被破壞。劉潔等[32]使用了HPTS處理芽胞，研究了連續(xù)式施壓和間歇式施壓兩種不同方式對(duì)枯草桿菌芽胞的滅活作用。結(jié)果表明，經(jīng)掃描電鏡觀察，芽胞外殼出現(xiàn)凹陷、皺褶等形態(tài)變化，這種間歇式的施壓產(chǎn)生強(qiáng)烈的機(jī)械剪切力，造成芽胞結(jié)構(gòu)損傷及內(nèi)容物的泄漏，甚至死亡。Black等[33]研究高壓和nisin對(duì)牛乳中芽胞桿菌芽胞萌發(fā)和滅活的共同作用，經(jīng)過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)HPTS處理后，芽胞的結(jié)構(gòu)有明顯損壞，出現(xiàn)凹陷和空洞，并且核心內(nèi)容物似乎不存在。2013年章中等人研究乙醇協(xié)同HPTS處理后枯草芽胞桿菌芽胞，通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)處理的芽胞光滑且圓潤(rùn)，皮層清晰，皮層和芽胞核區(qū)都沒有電子透射區(qū)，在HPTS 處理后，有些芽胞的皮層被水解，芽胞內(nèi)出現(xiàn)了大面積的電子透射區(qū)，芽胞被壓垮，芽胞的核心出現(xiàn)紊亂。Wang等[34]研究高壓和微酸性電解水對(duì)蠟樣芽胞桿菌芽胞結(jié)構(gòu)的影響，采用掃描電鏡、透射電鏡、超分辨多光子共聚焦顯微鏡等研究了芽胞的生理反應(yīng)，結(jié)果表明，HPP-SAEW處理蠟樣芽胞桿菌，芽胞形態(tài)有部分損傷，芽胞壁不完整，芽胞表面有不規(guī)則的突起，甚至有嚴(yán)重的變形。芽胞的殺滅主要是不依賴于萌發(fā)，而是直接被殺滅。Akasaka等[35]首次將高分辨率高壓核磁共振光譜應(yīng)運(yùn)于枯草芽胞桿菌芽胞懸浮液中，并直接實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了DPA在 200 MPa、20 ℃壓力下的泄漏過程。發(fā)現(xiàn)在200 MPa、20 ℃下，三分之一的DPA立即泄漏，其余的只有在減壓時(shí)才緩慢泄漏，而且一旦DPA從內(nèi)核中耗盡，在80 ℃左右，它們的蛋白質(zhì)很容易變性，且芽胞衣、內(nèi)外膜和皮層等芽胞特有結(jié)構(gòu)基本被破壞，從而導(dǎo)致芽胞失活。

5.2 HPTS導(dǎo)致芽胞萌發(fā)而被殺滅

芽胞萌發(fā)是指在某種條件下芽胞從休眠態(tài)轉(zhuǎn)變成營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的過程。芽胞一旦萌發(fā)后殺菌抗性就會(huì)大大降低[36-38]。Setlow[39]報(bào)道芽胞萌發(fā)被劃分為兩個(gè)階段，第一階段會(huì)有陽離子釋放、DPA釋放、芽胞核心的部分水化、部分殺菌抗性的散失。第二階段會(huì)有皮層的水解、芽胞核心的進(jìn)一步水化、芽胞核心的膨脹、殺菌抗性的完全散失。兩階段完成后，芽胞的新陳代謝開始恢復(fù)，SASP被降解，大分子物質(zhì)開始合成，新的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞從芽胞衣中脫離出來。很多報(bào)道稱芽胞萌發(fā)過程中殺菌抗性的散失與以下因素有關(guān)，即DPA的釋放、芽胞內(nèi)膜通透性的增加，SASP的降解和皮層的水解等。

5.2.1 HPTS處理下芽胞DPA釋放導(dǎo)致其萌發(fā)進(jìn)而被殺滅 許多報(bào)告認(rèn)為DPA釋放是在HPTS條件下滅活細(xì)菌芽胞的關(guān)鍵步驟。Paidhungat等[40]發(fā)現(xiàn)550 MPa的壓力處理打開了芽胞DPA的釋放通道而導(dǎo)致芽胞萌發(fā)。Margosch等[41]研究了細(xì)菌芽胞的殺菌抗性，得出在600～800 MPa和60 ℃以上的溫度下，DPA主要是通過物理化學(xué)過程而不是生理過程釋放的，發(fā)現(xiàn)HPTS處理下芽胞的滅活和DPA的釋放密切相關(guān)。Clery-Barraud等[42]將突變衍生體RP42菌株的炭疽桿菌芽胞暴露于HPTS處理下(280～500 Mpa、10～360 min、20～75 ℃)，測(cè)定芽胞的失活動(dòng)力學(xué)，研究表明，HPTS能完全殺滅炭疽桿菌芽胞，可能是HPTS處理下DPA釋放，而誘導(dǎo)了芽胞萌發(fā)，萌發(fā)后的炭疽桿菌芽胞殺菌抗性降低。Black等[43]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌芽胞在500 MPa、50 ℃下能快速萌發(fā)，這個(gè)過程是通過超高壓直接引起DPA的釋放，隨后引起芽胞的萌發(fā)而不是通過作用于芽胞的營(yíng)養(yǎng)萌發(fā)受體引起芽胞萌發(fā)。得出誘導(dǎo)芽胞釋放DPA并萌發(fā)的最佳溫度約60 ℃。并推測(cè)VHP可能作用于芽胞內(nèi)膜而導(dǎo)致DPA釋放，但作用靶點(diǎn)尚不明確。黃娟等[44]以凝結(jié)芽胞桿菌芽胞、嗜熱脂肪芽胞桿菌芽胞為研究對(duì)象，研究了HPTS的對(duì)其失活、萌發(fā)、損傷方面的影響，研究表明，當(dāng)較低壓力(≤300 MPa)和初溫(≤60 ℃)時(shí)能有效誘導(dǎo)兩種細(xì)菌芽胞的萌發(fā)；當(dāng)較高壓力(≥500 MPa)和較高溫度(≥80 ℃)時(shí)，兩種芽胞的失活率趨于接近。此外，對(duì)比常壓熱處理與HPTS處理對(duì)芽胞的不同影響發(fā)現(xiàn)，HPTS對(duì)芽胞的萌發(fā)、失活影響明顯大于常壓熱處理，但熱仍是造成芽胞損傷的一個(gè)重要因素。Vercammen等研究了HPTS對(duì)番茄醬中凝結(jié)芽胞桿菌和脂環(huán)酸芽胞桿菌芽胞萌發(fā)和失活的影響，發(fā)現(xiàn)在600～800 MPa下, 芽胞的萌發(fā)與溫度關(guān)系極大, 在60 ℃時(shí)，在所有處理壓力和時(shí)間條件下觀察到芽胞滅活，并且滅活程度幾乎等于萌發(fā)程度。Reineke等[45]通過研究芽胞特有物質(zhì)DPA釋放和芽胞熱敏感性增加的情況，認(rèn)為HPTS殺滅芽胞的機(jī)制涉及三個(gè)步驟：①休眠②激活③殺滅。隨著處理強(qiáng)度的增加，芽胞的滅活程度大大增加，當(dāng)壓力超過一定閾值時(shí)，溫度成為影響芽胞萌發(fā)的主導(dǎo)因素。Hofstetter等[46]對(duì)HPTS與reutericyclin或Nisin聯(lián)合處理下嗜熱桿菌芽胞內(nèi)膜流動(dòng)性進(jìn)行了原位測(cè)定。結(jié)果表明，在不改變內(nèi)膜高度有序狀態(tài)的情況下，芽胞可以被HPTS滅活，而且，reutericyclin 和Nisin對(duì)芽胞內(nèi)膜流動(dòng)性的不同影響有助于研究HPTS誘導(dǎo)芽胞釋放DPA和失活。Erika Georget等[47]采用原位紅外光譜(FT-IR)和熒光光譜法研究了硬脂酸桿菌芽胞在HPTS處理下萌發(fā)和失活的機(jī)理，芽胞內(nèi)膜用 Laurdan 熒光染料染色。在HPTS處理下，原位記錄了紅外光譜和熒光光譜。發(fā)現(xiàn)在200 MPa和55 ℃條件下，芽胞DPA快速且全部釋放，HPTS導(dǎo)致了芽胞萌發(fā)，萌發(fā)率可達(dá)3個(gè)對(duì)數(shù)值，從而殺滅芽胞。Robert Sevenich等[48]采用平板計(jì)數(shù)法、高效液相色譜法和流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)HPTS處理對(duì)DPA釋放、芽胞滅活及芽胞內(nèi)膜的影響，發(fā)現(xiàn)DPA的釋放對(duì)HPTS處理下的芽胞失活至關(guān)重要，DPA的釋放是芽胞滅活的限速步驟，而芽胞內(nèi)膜可能是HPTS作用于芽胞的靶結(jié)構(gòu)。

5.2.2 HPTS導(dǎo)致芽胞內(nèi)膜通透性增加而被殺滅 芽胞萌發(fā)時(shí)其內(nèi)膜通透性會(huì)增加。HPTS會(huì)導(dǎo)致芽胞內(nèi)膜通透性增加而將其殺滅，主要是由于HPTS處理下水分子穿透內(nèi)膜屏障并進(jìn)入芽胞內(nèi)核，使芽胞的抗性降低而將其殺滅。Mathys等[49]使用流式細(xì)胞儀研究了HPTS對(duì)地衣芽胞桿菌芽胞的殺滅機(jī)理,采用SYTO16和碘化吡啶對(duì)HPTS處理后的芽胞進(jìn)行染色, 研究芽胞內(nèi)膜通透性變化, 提出了一種包含三個(gè)步驟的HPTS殺滅芽胞機(jī)理, 依次為芽胞皮層水解和芽胞萌發(fā)、一個(gè)未知步驟、芽胞內(nèi)膜被破壞而失活。Zhang等[50]研究了HPTS結(jié)合不同濃度乙醇對(duì)枯草芽胞桿菌芽胞的殺滅作用。乙醇協(xié)同HPTS處理后芽胞的內(nèi)膜通透性大大增加并嚴(yán)重受損，隨著乙醇濃度的提高和水分的減少，HPTS殺滅芽胞的效果降低，進(jìn)一步表明水分子進(jìn)入芽胞內(nèi)核對(duì)HPTS殺滅芽胞有至關(guān)重要的作用。章中[51]通過透射電鏡觀察HPTS處理前后的枯草桿菌芽胞，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)HPTS處理的芽胞內(nèi)核顏色很深、內(nèi)容物致密緊湊，而經(jīng)HPTS處理的芽胞內(nèi)核顏色變淺，這個(gè)現(xiàn)象說明經(jīng)HPTS處理后，芽胞內(nèi)膜水分子通透屏障受損，水分子進(jìn)入芽胞內(nèi)核，發(fā)生了水合現(xiàn)象。Sevenich等[48]用氯化鈉和蔗糖調(diào)節(jié)芽胞懸浮液的水分活度，發(fā)現(xiàn)隨著水分活度的降低，水分通過芽胞內(nèi)膜進(jìn)入芽胞內(nèi)核的量越少，HPTS對(duì)芽胞的滅活能力下降。Rozali等[52]采用掃描電鏡對(duì)HPTS處理前后芽胞的形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)芽胞具有不可逆的體積和形狀變化。細(xì)菌芽胞的失活被認(rèn)為是從芽胞內(nèi)膜受損開始的，而芽胞內(nèi)膜通透性的增加會(huì)促進(jìn)芽胞內(nèi)核DPA的釋放和含水量的增加，進(jìn)而導(dǎo)致芽胞死亡。

5.2.3 HPTS導(dǎo)致芽胞SASP降解或皮層水解而殺滅芽胞 SASP是一個(gè)多基因族的產(chǎn)物，這個(gè)多基因族僅在出芽后期表達(dá)。SASP僅存在于芽胞的核心，占芽胞總蛋白含量的5%。SASP的關(guān)鍵功能是和芽胞DNA結(jié)合在一起，這種結(jié)合使得芽胞DNA更為穩(wěn)定并免受許多物理?yè)p害，芽胞萌發(fā)后期SASP會(huì)降解[53]。芽胞的皮層主要由肽聚糖構(gòu)成，在芽胞萌發(fā)早期就被降解。目前認(rèn)為HPTS處理下芽胞皮層肽聚糖水解機(jī)理僅有兩種可能性, 其一是HPTS激活皮層裂解酶, 其二是HPTS導(dǎo)致皮層肽聚糖的非酶水解。在休眠的芽胞中, 皮層裂解酶不表現(xiàn)出活性, 但在芽胞萌發(fā)而轉(zhuǎn)變成營(yíng)養(yǎng)體的過程中, 皮層裂解酶通過某種機(jī)制被激活并將皮層肽聚糖水解, 然后導(dǎo)致芽胞核心的完全水化，這是芽胞萌發(fā)過程中的一個(gè)重要步驟[13]。Mathys等[54]認(rèn)為,HPTS處理下芽胞內(nèi)部的DPA的釋放可能會(huì)激活皮層裂解酶, 從而將芽胞皮層水解, 進(jìn)而導(dǎo)致芽胞死亡。Reineke等[55]報(bào)道HPTS很可能會(huì)影響皮層裂解酶的活性, 在某些壓力和溫度條件下, 皮層裂解酶可能會(huì)被激活, 導(dǎo)致芽胞皮層水解而萌發(fā), 進(jìn)而使得芽胞結(jié)構(gòu)被破壞。章中[51]研究乙醇協(xié)同HPTS處理后枯草桿菌芽胞的透射電鏡觀察，高濃度的乙醇抑制了芽胞皮層裂解酶的活性，皮層肽聚糖未能被水解，而肽聚糖水解是芽胞萌發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵步驟，這一步驟被抑制導(dǎo)致芽胞萌發(fā)過程受阻，乙醇協(xié)同HPTS處理下芽胞仍然有抗熱抗壓性，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)受影響小，不易被HPTS殺滅。

6 展 望

HPTS能殺滅食品中的所有微生物，包括最難被殺滅的細(xì)菌芽胞，使得食品能在常溫下長(zhǎng)期貯藏，和傳統(tǒng)高溫?zé)釟⒕啾?，HPTS使用的溫度較低、時(shí)間較短，能更好地保持食品原有的色、香、味、質(zhì)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)素和功能性成分，受到國(guó)內(nèi)外食品科學(xué)家的廣泛關(guān)注。細(xì)菌芽胞需要高強(qiáng)度的殺菌處理以確保食品安全和保藏效果，芽胞的殺滅是食品殺菌的關(guān)鍵任務(wù)。HPTS作為一種新型殺菌技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)鮮明，然而其殺滅芽胞的機(jī)理卻遠(yuǎn)不夠清楚，研究報(bào)道較少。HPTS仍會(huì)對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)和感官品質(zhì)造成一定的影響，加深對(duì)HPTS殺滅芽胞機(jī)理的理解可有利于降低這種不利影響。通過研究，希望在殺滅食品中各種芽胞的同時(shí)盡可能地保持食品原有的營(yíng)養(yǎng)和感官品質(zhì)。

目前對(duì)HPTS殺滅細(xì)菌芽胞機(jī)理的研究主要集中在處理前后芽胞結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵物質(zhì)的變化上，而對(duì)芽胞結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵物質(zhì)在HPTS處理下的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化研究少之又少。芽胞內(nèi)膜通透性屏障的損傷是HPTS殺滅芽胞的一個(gè)關(guān)鍵原因，未來我們可以采用金剛石對(duì)頂砧技術(shù)結(jié)合拉曼光譜法、傅里葉變換紅外光譜法、落射熒光單分子顯微術(shù)、熒光分光光度法、X射線衍射、核磁共振等技術(shù)，以芽胞內(nèi)膜磷脂大分子為研究切入點(diǎn)，通過實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究HPTS處理下芽胞內(nèi)膜磷脂分子側(cè)向熱運(yùn)動(dòng)、相態(tài)和分子間氫鍵作用的變化規(guī)律，從多個(gè)層次和不同角度闡明HPTS微物理場(chǎng)中芽胞內(nèi)膜流動(dòng)性變化的原因，最終揭示HPTS微物理場(chǎng)中芽胞內(nèi)膜水分子通透屏障受損的分子機(jī)理，進(jìn)一部夯實(shí)HPTS殺菌技術(shù)的理論基礎(chǔ)，推動(dòng)HPTS技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用。