單克隆抗體及其抗感染作用的研究進展

崔樂樂， 卜 桐， 劉兆基， 張涵旭， 史 雨， 井雯雯， 李愛梅， 考文萍， 翟愛霞

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，伍連徳研究所，黑龍江省感染與免疫重點實驗室，黑龍江省普通高校病原 生物學(xué)重點實驗室，黑龍江省普通高校感染與免疫科技創(chuàng)新團隊，黑龍江 哈爾濱 150081)

1 單克隆抗體的發(fā)展歷程

B細胞由抗原刺激后可增殖分化為漿細胞，漿細胞進一步產(chǎn)生糖蛋白，即抗體(antibody, Ab)。Ab也稱為免疫球蛋白，能與相應(yīng)的抗原特異性結(jié)合，是介導(dǎo)體液免疫的主要效應(yīng)分子，大部分存在于血清中。分子生物學(xué)家Koehler和Milstein在1975年合作建立了單克隆抗體(monoclonal antibody, mAb)技術(shù)，該技術(shù)制備的第一個雜交瘤細胞株可分泌抗綿羊紅細胞特異性抗體，僅能識別一種抗原表位，并且這種細胞在體外培養(yǎng)可永久傳代[1]。這一發(fā)現(xiàn)使得抗體的研究取得了巨大進步。到目前為止，mAb經(jīng)歷了鼠源性單抗、人鼠嵌合單抗、人源化單抗和全人源單抗四個發(fā)展階段，其中全人源單克隆抗體(fully human monoclonal antibody)是目前較為先進、使用范圍較廣的一類mAb[2]。

1.1 鼠源性單抗

鼠源性單抗是免疫小鼠的B淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞所分泌的抗體，人的免疫系統(tǒng)可識別這種抗體，并產(chǎn)生嚴重的人抗鼠抗體反應(yīng)(human anti-mouse antibody, HAMA)，HAMA反應(yīng)使單抗的半衰期變短，療效減弱，引起嚴重的不良反應(yīng)[3]。并且由于制備鼠源性單抗所需時間較長，單抗的抗性易丟失。為了克服鼠源性單抗存在的一系列的缺點，制備出合適的單克隆抗體，人們對于mAb開始了進一步的研究[4]。

1.2 嵌合型單抗

嵌合型單抗是第一代人源化抗體。該種抗體的制備過程是對鼠抗體上的可變區(qū)基因與人抗體的恒定區(qū)基因進行重組后導(dǎo)入到骨髓瘤細胞中，其表達產(chǎn)生的抗體即為嵌合型單抗。然而，由于這種抗體的可變區(qū)來自小鼠基因，保留了約30%的鼠抗體特性，所以對人體有免疫原性。在臨床應(yīng)用中，用該抗體治療的患者可發(fā)生HAMA反應(yīng)[5]?；谶@一原因，研究人員對mAb進一步人源化，使抗體的免疫原性降低，減少HAMA反應(yīng)的發(fā)生。

1.3 人源化單抗

第二代人源化抗體又稱為改形抗體，移植抗體或人源化抗體。是用鼠單抗可變區(qū)中的互補決定簇(complementarity determiningregion, CDR)序列取代人抗體可變區(qū)中的相應(yīng)位置，人源化可達90%以上[6]。這種抗體既有鼠源性單抗特異性，又保持與人體內(nèi)的親和力，可最大程度上降低抗體的異源性。但該抗體只是對CDR序列進行簡單的移植，沒有考慮到抗體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變會對抗體抗原的結(jié)合產(chǎn)生怎樣的影響。而且人源化單抗中仍包含鼠源抗體的結(jié)構(gòu)，所以不可避免地會發(fā)生HAMA反應(yīng)[3,7]。同時在人源化抗體制備過程中有很多難點，比如制備過程復(fù)雜，需要進行結(jié)構(gòu)設(shè)計，并需反復(fù)檢測與抗原的親和力大小等等。

1.4 全人源單抗

全人源單克隆抗體是治療性單克隆抗體中最理想的抗體。這種mAb可以消除人對異源性抗體的不良反應(yīng)，避免了異源抗體重組的復(fù)雜性[3]。制備全人源單抗的技術(shù)主要包括噬菌體抗體庫技術(shù)、核糖體展示技術(shù)、轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)等[8]。

1.4.1 噬菌體抗體庫技術(shù) 噬菌體抗體庫技術(shù)是對人抗體結(jié)構(gòu)中的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因逆轉(zhuǎn)錄，將人抗體轉(zhuǎn)染到噬菌體載體上并以融合蛋白的形式表達。通過這一技術(shù)可得到含有抗體基因并且能夠成功表達抗體的噬菌體[9]。該技術(shù)利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點對全人源抗體可變區(qū)基因進行篩選，確定目的基因后進行擴增[10]。目前已知該技術(shù)有兩種類型：免疫抗體庫和非免疫抗體庫[9]。

1.4.2 核糖體展示技術(shù) 核糖體展示技術(shù)是對編碼蛋白的DNA在體外進行轉(zhuǎn)錄和翻譯，具體來說是對DNA進行特殊的加工并修飾，去除3′末端的終止密碼子，使核糖體翻譯到 mRNA 的3′末端不會脫離下來從而形成蛋白質(zhì)-核糖-mRNA三聚體，再將目標蛋白配基固相化，篩選得到復(fù)合物。將得到的mRNA進行RT-PCR，其產(chǎn)物進入下一輪循環(huán)。經(jīng)過多次循環(huán)，對目標蛋白及其編碼的基因序列進行富集和分離[11]。

1.4.3 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù) 轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)是將人染色體轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)，用人IgG基因代替轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的相應(yīng)基因，使小鼠能分泌人IgG。但是由于基因片段較小，不足以應(yīng)對抗原多樣性[12]?；谶@一原因，研究人員用基因打靶技術(shù)將長度約為18 Mb編碼人抗體的輕重鏈基因片段全部導(dǎo)入到已滅活的小鼠自身抗體的基因位點上，挑選合適的基因片段，建立穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。這種轉(zhuǎn)基因小鼠可產(chǎn)生高親和力的人源抗體。并且小鼠體內(nèi)分泌特異性抗體的B細胞與骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞可分泌人源抗體[13]。

無論如何，單抗對于一個個體來說是抗原，會產(chǎn)生抗抗體使其失效，或者引起病理性免疫反應(yīng)。鼠源型、嵌合型和人源化單克隆抗體都有鼠源性片段，會不可避免的產(chǎn)生HAMA反應(yīng)。全人源mAb或人源化mAb在人體中具有免疫原性，并且可以誘導(dǎo)抗藥物抗體(anti-drug antibody ADA)的產(chǎn)生，影響藥代動力學(xué)(pharmacokinetics，PK)和單抗的作用效力[14-15]有研究表明阿達木單抗治療的類風(fēng)濕患者體內(nèi)ADA滴度越高，治療失敗的可能性越大。沒有證據(jù)表明全人類單克隆抗體的免疫原性低于人源化抗體[16]。

2 單克隆抗體的作用

mAb在疾病的診斷和治療上越來越受到重視。為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，Yamanaka等研發(fā)出一種全人源單抗藥物Adalimumab，這是第一個全人源單抗藥物[17]。之后又研發(fā)出用于治療直、結(jié)腸癌的全人源單抗藥物[18]。mAb主要用于診斷和治療腫瘤、自身免疫性疾病、傳染病、炎癥和免疫失調(diào)等疾病，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、復(fù)發(fā)惡性膠質(zhì)瘤、轉(zhuǎn)移性大腸癌等疾病的治療中應(yīng)用較多。

mAb在腫瘤的治療中應(yīng)用較多，mAb抗腫瘤的機制主要是抗體與腫瘤細胞表面特異性抗原分子結(jié)合，通過抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用和補體依賴性細胞毒作用，進而殺滅腫瘤細胞[19]。利妥昔單抗和化療藥物CHOP聯(lián)合使用方案(環(huán)磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松)可有效提高淋巴瘤的治愈率，曲妥珠單抗與化療的聯(lián)合治療方案對乳腺癌有效[20-21]。此外西妥昔單抗可以治療頭頸部癌、非小細胞肺癌和結(jié)腸癌等多種腫瘤，并且有很好的療效[5,21,23]。黃晶晶等[24]建立了高效表達系統(tǒng)，制備出TR1-419單抗和TRAIL-R1。已知TRAIL-R1具有抗腫瘤作用，將TR1-419與TRAIL共同作用于HeLa細胞，TR1-419對TRAIL殺傷腫瘤細胞的功能具有促進作用，并導(dǎo)致凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。同時體內(nèi)實驗也證明了TR1-419可增強TRAIL的抑制腫瘤生長作用。

現(xiàn)在有關(guān)mAb治療腫瘤的研究仍在進行，并且取得了很多的成果。

3 單克隆抗體的抗感染作用

mAb在抗感染方面也有很大的進展。感染是指細菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原體入侵人體后使得人體局部組織或全身發(fā)生炎癥反應(yīng)。感染可引起傷寒、敗血癥、心肌炎等各種疾病。目前最常用干擾素(interferon, IFN)對病毒感染進行治療，尚無其他更有效的藥物對感染性疾病進行干預(yù)?？股氐淖饔脵C制是通過抑制或殺滅細菌生長從而達到治療的效果。但抗生素的濫用大大增加了細菌的耐藥性。針對這一現(xiàn)象，一些學(xué)者將目光投向mAb，研究具有抗感染作用的mAb。mAb在進入人體后通過人的免疫系統(tǒng)消除病原體，也可阻斷相關(guān)的發(fā)病機制，提高機體的免疫力，從而達到治療疾病的效果。目前mAb在抗感染方面仍處于研究階段。

3.1 單克隆抗體在治療病毒性心肌炎的研究進展

心肌炎是心臟發(fā)生炎癥性疾病和擴張型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)的征兆，細胞浸潤是心肌炎的主要特征[25]。其中病毒性心肌炎(viral myocarditis, VMC)是一種由T細胞介導(dǎo)自身免疫性疾病。Fairweathe等[26]用感染柯薩奇病毒(coxsackievirus, CVB)的小鼠建立疾病模型。通過實驗發(fā)現(xiàn)，患病的雄性小鼠體內(nèi)炎癥程度明顯，CD45+、CD11b、CD4+、CD8+等的表達水平都明顯增加。并且小鼠心肌發(fā)生明顯纖維化。并且Koichi等[27]對動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，Th1和Th2在擴張型心肌病的發(fā)展過程中扮演著重要的角色。其中Th2通過減少調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)和炎性細胞因子的生成，從而抑制Th1免疫反應(yīng)和急性病毒性心肌炎。Yuan等[28]發(fā)現(xiàn)IL-17 mAb處理的AVMC小鼠體內(nèi)血清CK-MB活性降低，心臟切片的病理評分有所改善，IL-17水平和血清抗ANT自身抗體降低。所以，IL-17可以作為治療病毒性心肌炎和擴張型心肌病的靶點。

3.2 單克隆抗體在巨細胞病毒感染中的研究進展

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus, hCMV)為DNA病毒，在細胞中處于休眠狀態(tài)，但可以由相關(guān)刺激因素激活。通常導(dǎo)致免疫功能低下的個體發(fā)生嚴重疾病，在心血管疾病和癌癥的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，與肝炎、單核細胞增多癥、發(fā)燒、疲勞等疾病和臨床癥狀有關(guān)。大部分hCMV的亞型可引起輕度的上呼吸道感染，也可在體內(nèi)建立持續(xù)感染而不產(chǎn)生任何臨床癥狀[29]。hCMV可編碼多種蛋白，其中編碼的囊膜糖蛋白為主要抗原，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體。囊膜糖蛋白主要包括 gB(UL155)、gH(UL75)、gL(UL115)、gO(UL74)、gM(UL100)和 gN(UL73)等，其中g(shù)B含量最高，參與病毒的吸附與融合[30]。MSL-9是最早研發(fā)出來治療CMV的mAb，可高效結(jié)合gH，但臨床試驗中發(fā)現(xiàn)高劑量的MSL-9可造成患者死亡[31-32]。有研究通過雜交瘤技術(shù)和連續(xù)稀釋法制備出針對gB抗原的兩種mAb，分別為ZJU-FH6和ZJU-FE6，通過ELISA、western blotting、免疫沉淀和免疫組化對兩種mAb進行驗證，表明兩種mAb能夠準確地識別患者體內(nèi)的gB抗原[33]。在體外實驗中，ZJU-FH6和ZJU-FE6兩種抗體在實驗小鼠體內(nèi)都表現(xiàn)出了良好的免疫原性，但仍需進一步的臨床試驗。TRL345是另一種針對CMVgB中AD-2表位的單克隆抗體。它主要針對感染的內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞和原始纖維細胞起作用[34]。且有臨床試驗表明該抗體可中和CMV，并可阻止病毒感染胎盤絨毛組織，在臨床治療上有較好的前景。

3.3 單克隆抗體人類免疫缺陷病毒感染中的研究進展

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)可分為HIV-1 型和 HIV-2 型。獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)的主要病原體是 HIV-1，其包膜糖蛋白 gp160 進一步加工形成gp120 和 gp41[35]。HIV入侵人體后，病毒的外殼蛋白 gp120 三聚體與人的CD4受體、趨化因子協(xié)同受體(CCR5、CXCR4)結(jié)合，從而導(dǎo)致AIDS的發(fā)生[36]。針對該病毒的mAb還處于臨床試驗階段。目前已經(jīng)制備出一種mAb，Ibalizumab是一種抗CD4 mAb，屬于人IgG4亞型。由鼠mAb(mu5A8)衍生而來，不誘導(dǎo)免疫抑制反應(yīng)，也不降低CD4+T細胞計數(shù)，是一種特異的抗CD4 mAb[37]。Ibalizumab能選擇性地與CD4受體結(jié)構(gòu)域上的表位結(jié)合[38]，并抑制HIV的gp120、gp41與 CD4 結(jié)合，從而改變病毒構(gòu)象，阻止病毒進入細胞[39]。有研究結(jié)果表明，與單獨使用逆轉(zhuǎn)錄療法相比，Ibalizumab與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法聯(lián)合應(yīng)用于AIDS效果更好。

近年來，Huang等[40]研發(fā)出針對HIV病毒的單抗藥物35O22，這種單抗藥物可與病毒包膜糖蛋白表位結(jié)合。35O22抗體在艾滋病毒的預(yù)防、治療以及使用疫苗刺激HIV特異抗體等方面有較好的效果。35O22獨特的結(jié)合位點和對HIV病毒毒株的作用表明，它可以與被動免疫療法或病毒預(yù)防中使用的其他抗體相補充。在病毒滴度較低的情況下，35O22抗體在體內(nèi)的活性會可能持續(xù)存在。

3.4 單克隆抗體在登革熱病毒中的研究進展

登革熱(dengue fever, DF)和登革出血熱/登革休克綜合征(DHF / DSS)是通過節(jié)肢動物傳播的感染性疾病。DF發(fā)病急，癥狀嚴重，在發(fā)病早期可快速有效地對疾病進行實驗室診斷[41]。Creuza Rachel Vicente等[42]對2009年到2013年間巴西Vitória的DF病例進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)DENV-2感染病例發(fā)生嚴重DF的頻率是其他血清型的7倍。目前mAb可用于診斷血清型，并且比傳統(tǒng)檢測方法靈敏度更高，所需時間更短。Vazquez等[43-44]制備了8H8mAb，對登革熱C蛋白進行特異性酶免疫分析，結(jié)果表明8H8mAb可對早期DF進行診斷。但目前針對DF的mAb僅用于診斷登革熱病毒感染，治療DF的單抗仍處于臨床試驗階段。

3.5 單克隆抗體在肉毒桿菌感染中的研究進展

肉毒桿菌中毒是由肉毒桿菌中存在的神經(jīng)毒素引起的疾病。肉毒桿菌有7種血清型，其中C型與牛、野生鳥類、貂、馬、狐貍等動物的肉毒桿菌中毒有關(guān)[45]。肉毒桿菌的發(fā)病機理是肉毒毒素通過胞吞作用進入膽堿神經(jīng)細胞，毒素進入細胞質(zhì)后，會破壞突觸小泡，導(dǎo)致無法釋放乙酰膽堿，從而引起肌肉松弛性麻痹。當波及到呼吸肌時，可導(dǎo)致呼吸困難甚至死亡[46]。

ELISA為常用的檢測肉毒桿菌的方法。通常使用14G8 mAb作為一種捕獲抗體，可以確定活躍的細菌數(shù)量，同時也可檢測包含BoNTC(/d)的血清樣本及其特異性[47]。在小鼠的體內(nèi)實驗中，通過對小鼠注射14G8，可以延遲小鼠的死亡時間。但是14G8 mAb的不恰當使用對中毒的小鼠不起任何作用。14G8與NCTC 8264的結(jié)合可以更有效的延長小鼠的生存時間。這也表明多種抗體聯(lián)合效果更顯著。目前mAb對肉毒桿菌中毒的治療效果仍處于試驗階段。

3.6 單克隆抗體在葡萄球菌感染中的研究進展

葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins, SEs)是金黃色葡萄球菌分泌的一種毒素，在食物中廣泛存在，可導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，包括敗血癥、食物中毒和毒性休克綜合征等[48]。SEs有5種血清型：SEA、SEB、SEC、SED、SEE[49]。在單一細胞融合試驗中，通過給小鼠注射多種抗原，可對常見抗原的mAb進行篩選。通過實驗制備的mAb-4G3(IgG2b)、mAb-5G2(IgG1)和mAb-9H2(IgG1)3種mAb都能夠抑制葡萄球菌超級抗原(staphylococcal superantigens)誘導(dǎo)的人免疫細胞的增殖和細胞因子的產(chǎn)生[50]。用mAb檢測葡萄球菌腸毒素效果較為理想，并且快速、特異性強、敏感度高。mAb在小鼠體內(nèi)作用的效果較為明顯，但在人體中的作用尚在試驗階段，效果未知。

4 展 望

到目前為止，單克隆抗體的研究已經(jīng)取得較大的進展。鼠源型、嵌合型和人源化單克隆抗體都具有異源性，會對人體產(chǎn)生不同程度的HAMA反應(yīng)。單克隆抗體特異性較強且效價高，主要用于疾病的診斷和治療。其中在腫瘤和自身免疫疾病等方面應(yīng)用較多，并且單克隆抗體已經(jīng)成為某些疾病的主要治療方案。針對治療感染性疾病的單克隆抗體研究尚不成熟，多數(shù)還處于臨床試驗階段，更多的是用來檢測及診斷感染性疾病。單克隆抗體與目前抗菌和抗病毒藥物的作用機制不同，單克隆抗體可直接增強人體免疫系統(tǒng)消滅病原體，從而達到治療疾病的效果，并且靶向性強，特異性高、毒副作用低，對病毒感染有良好的抑制作用，單克隆抗體的這些優(yōu)點越來越受到科研人員的關(guān)注。目前單克隆抗體治療感染性疾病體外試驗前景較好，小鼠體內(nèi)實驗效果也較為理想，但尚未應(yīng)用到臨床中。此外，全人源單克隆抗體由于消除了異源性、特異性高和最大程度上避免了不良反應(yīng)等優(yōu)點，在各種疾病的治療研究中成果顯著。在未來的研究中，全人源單克隆抗體將會越來越多的應(yīng)用于疾病的診斷及治療，在抗感染方面也會發(fā)揮著更大的作用。從第一種全人源單抗藥物Adalimumab治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎開始，在醫(yī)學(xué)研究迅猛發(fā)展的今天，全人源單克隆抗體應(yīng)用于臨床治療指日可待。