鮑曼不動桿菌碳青霉烯耐藥性與生物膜形成及O-甘露糖蛋白相關性研究

鄧國英， 楊淑鳳， 任 峰， 崔 明， 隋韶光*

(1.大連醫(yī)科大學 微生物學教研室，遼寧 大連 116044；2.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 檢驗科， 遼寧 大連 116023； 3.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 急診醫(yī)學科，遼寧 大連 116023)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)廣泛分布于土壤和水等環(huán)境中，也存在于健康人的皮膚粘膜及腔道中，目前是引起醫(yī)院感染的常見的機會性致病菌[1]，該細菌易通過基因組變異獲得耐藥性并通過遺傳物質的轉移和重組進行傳播[2]。在美國，臨床分離到的鮑曼不動桿菌約45%為多重耐藥菌，在拉丁美洲和中東地區(qū)，則高達70%[3]。碳青霉烯類如亞胺培南曾經是治療該菌感染的首選抗菌藥物，但是臨床分離株對此類藥物已經失去敏感性，多個耐藥基因參與耐藥性的形成[4]。鮑曼不動桿菌臨床分離株對外界抵抗力強，容易在機體或無生命材料表面形成生物膜[5]，生物膜作為細菌重要的致病機制之一，可以幫助細菌抵抗外界壓力如抗菌藥物，并有利于耐藥性的傳遞。此外，在鏈球菌[6]、結核分枝桿菌[7]等致病菌的研究中，O-甘露糖蛋白在細菌耐藥中發(fā)揮重要作用，是重要的毒力因子。為了探討鮑曼不動桿菌耐藥性與生物膜形成及O-甘露糖的關系，從大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院收集24株鮑曼不動桿菌，用藥物敏感試驗觀察這些菌株對常用抗菌藥物的敏感性，針對耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌，采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)檢測耐藥基因碳青霉烯酶基因OXA-23的有無，分析細菌耐藥性與生物膜形成的相關性，并探討耐藥性與O-甘露糖蛋白表達的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)臨床分離株均來自大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院住院病人的痰標本。

1.1.2 培養(yǎng)基 哥倫比亞血平板及肉湯培養(yǎng)基，分別用于細菌的分離培養(yǎng)及增菌培養(yǎng)。

1.1.3 材料與儀器 細菌鑒定及藥敏分析儀為梅里埃VITEK 2 Compact，抗菌藥物的E-test試紙條來自法國梅里埃生物公司，基因擴增儀購自美國Bio-RAD公司，DNA提取試劑盒、DNA Marker DL2000及PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖為美國Thermo Fisher Scientific公司產品， 瓊脂糖凝膠電泳儀來自大連捷邁科貿公司，結晶紫、刀豆蛋白凝集素A (Concanavalin A, Con A)、ProteoSilverTMPlus銀染試劑盒及ConA瓊脂糖層析柱購自Sigma公司，高速冷凍離心機為日本日立公司生產。使用的質譜儀器為基質輔助激光飛行時間質譜儀5800 MALDI-TOF/TOF，為AB SCIEX生產。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養(yǎng)、鑒定及藥物敏感試驗 細菌培養(yǎng)嚴格按照無菌操作進行，VITEK2 Compact分析儀作細菌種屬鑒定，質控菌株為霍氏腸桿菌(ATCC700323)。VITEK 2 Compact 分析儀也用于氨芐西林/舒巴坦等12種抗菌藥物敏感試驗，測定最小抑菌濃度值(minimal inhibitory concentration, MIC)。頭孢哌酮、米諾環(huán)素及替加環(huán)素藥物敏感試驗則采用紙片擴散法。藥敏試驗質控菌株為大腸埃希菌(ATCC25922)和銅綠假單胞菌(ATCC27853)。

1.2.2 碳青霉烯酶OXA-23基因檢測 鮑曼不動桿菌DNA提取按照試劑盒說明進行，OXA-23基因擴增所使用引物為F：5′-AAGCATGATGAGCGCAAAG-3′，R：5′-AAAAGGCCCATTTATCTCAAA-3′，OXA-58基因引物為F：5′- GGTTAGTTGGCCCCCTTAAAPCR-3′，R：5′-AGTTGAGCGAAAAGG-GGATT-3′，反應體系50 μL，包括10 × Pfu PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP mixture 5 μL，PfuDNA聚合酶0.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL，滅菌ddH2O 36.5 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min，1個循環(huán)；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，共30個循環(huán)；延伸溫度為72 ℃，1個循環(huán)，時間15 min。PCR反應結束后，用含0.5 μL/mL溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。

1.2.3 生物膜形成試驗 培養(yǎng)鮑曼不動桿菌至OD值為0.5，取200 μL培養(yǎng)物加入微孔板，培養(yǎng)8 h，PBS清洗3次，1%結晶紫染色30 min，雙蒸水清洗去除多余染液，乙醇洗脫，570 nm測定OD值，每組設3復孔，僅含有培養(yǎng)基孔為對照組。

1.2.4 O-甘露糖蛋白的獲得及確證 ①膜蛋白的提取及定量：離心收獲耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌及非耐藥菌，超聲碎菌后，再次離心，取上清，4 ℃ 100 000×g超速離心1 h，沉淀膜蛋白，Bradford法定量蛋白。②ConA瓊脂糖親和層析獲得O-甘露糖基化蛋白:用緩沖液(1mol/L NaCl, 5 mmol/L MgCl2,5 mmol/L MnCl2和 5 mmol/L CaCl2)沖洗ConA瓊脂糖層析柱，然后進行層析柱的平衡。膜蛋白配成濃度為1 mg/mL，流經層析柱。應用平衡緩沖液沖洗。最后用200 mmol/L甘露糖苷洗脫目的蛋白，收獲洗脫液并濃縮。③O-甘露糖蛋白的確證和解析：將蛋白進行12% SDS-PAGE，然后轉移至PVDF膜，封閉后，用1∶ 5 000的辣根過氧化物酶標記的ConA(Sigma)室溫孵育16 h后，洗膜后化學發(fā)光顯色。同時電泳后的蛋白條帶銀染，切下質譜分析，并使用在線甘露糖基化位點預測軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)NetOGlyc 4.0 Server進行蛋白質的糖基化位點預測。

2 結果與分析

2.1 鮑曼不動桿菌的樣本來源及臨床分布

本研究收集的24株鮑曼不動桿菌均來自痰液的分離培養(yǎng)，其中21株來自重癥醫(yī)學科，其余3株分別來自神經外科、兒科和腎內科。標本來源以重癥肺炎患者居多(16株)。

2.2 標本分離株的藥物敏感試驗結果

24株臨床分離的鮑曼不動桿菌對15種抗菌藥物耐藥情況見表1。

表1 分離菌株對抗菌藥物的耐藥率

從表1可以看出，24株鮑曼不動桿菌對頭孢他啶、頭孢曲松、慶大霉素及哌拉西林均耐藥，對亞胺培南的耐藥率為83.33%，替加環(huán)素耐藥率最低，為12.50%。

2.3 碳青霉烯酶基因OXA-23的檢測

針對20株耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌，檢測了碳青霉烯酶基因OXA-23。PCR結果顯示，13株檢測到OXA-23基因片段，基因片段長度為1 066 bp(圖1)，檢出率為65%。

圖1 鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶 基因OXA-23 PCR結果Fig.1 PCR products of A. baumannii carbapenemase gene OXA-23M：DNA 分子標記；1～13：PCR產物 20株耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌中，13株檢測到碳青霉烯酶基因OXA-23 M：DNA Marker；1-13：PCR products OXA-23 gene was detected in 13 of 20 carbapenem resistant A. baumannii strains

2.4 鮑曼不動桿菌耐藥性與生物膜相關性

結晶紫染色法顯示，耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌生物膜形成能力比非耐藥菌更強(圖2)，這可能是因為細菌形成生物膜后耐藥基因更容易傳遞，因而形成生物膜的菌株更易獲得耐藥性。

圖2 鮑曼不動桿菌碳青霉烯耐藥性 與生物膜形成的相關性Fig.2 The correlation between carbapenem resistance and biofilm formation in A.baumannii *P<0.05

2.5 鮑曼不動桿菌碳青霉烯耐藥性與O-甘露糖蛋白表達的關系及糖基化位點預測

親和層析獲得的蛋白經SDS-PAGE、轉膜及ConA識別，耐藥菌株為5個條帶，非耐藥菌為4個條帶(圖3A)，電泳及銀染后，將蛋白條帶(圖3B)切除作質譜分析，結果顯示，5個蛋白分別為OmpA/MotB、A1S_ 2371、A1S_ 0556、A1S_ 3744和A1S_ 3626，其中非耐藥菌株缺少A1S_ 3626。糖基化位點位于Ser和Thr上，位點總數(shù)從7個到28個不等 (表2)。

圖3 親和層析洗脫液ConA結合試驗(A)及銀染結果(B)Fig.3 The binding assay of ConA with elutes of affinity chromatography (A) and silver stain (B) a～e:檢測到的糖蛋白條帶 a-e:The detected protein bands

表2 鮑曼不動桿菌O-甘露糖基化蛋白質譜結果和糖基化位點預測

Table 2 MS analysis of O-mannosylated proteins and prediction of glycosylated sites inA.baumannii

條帶序號質譜結果蛋白名稱甘露糖基化位點位點總數(shù)aA1S_ 1193OmpA/MotB151Ser/152Ser/153Thr/161Thr/163Thr/320Thr/339Ser7bA1S_ 2371Putative uncharacterized protein23Ser/24Thr/25Thr/35Ser/51Ser/52Thr/62Thr/73Ser/74Thr/75Thr/89Ser/94Ser/95Thr/99Thr/102Thr/103Thr/104Thr/106Thr/108Ser/109Thr/111Thr/112Ser/117Thr/119Thr/122Ser/165Thr/188Thr27cA1S_ 0556Putative uncharacterized protein 4Ser/31Ser/53Thr/56Ser/238Ser/305Ser/306Thr7dA1S_ 3744Putative uncharacterized protein26Thr/37Thr/52Ser/55Ser/58Thr/76Thr/79Thr/80Thr/81Thr/87Thr/92Ser/95Ser/96Ser/98Thr/106Ser/108Thr/132Ser/139Thr/144Thr/157Thr20eA1S_ 3626Putative uncharacterized protein43Thr/55Ser/61Thr/65Ser/79Thr/86Thr/89Thr/94Thr/97Thr9

3 討 論

近年來，鮑曼不動桿菌成為醫(yī)院重癥患者感染常見的致病菌，一方面是由于細菌對外界因素有較強的抵抗力，易于在醫(yī)院環(huán)境及醫(yī)療器械上存活，另一方面，由于該細菌耐藥菌株甚至多重耐藥菌株的感染迅速增多，給治療增加了難度[8]。

本研究從臨床分離24株鮑曼不動桿菌，這些患者多為重癥肺炎，部分伴有其他慢性疾病。對這些臨床株進行抗菌藥物敏感試驗，發(fā)現(xiàn)耐藥嚴重(表1)。碳青霉烯類抗菌藥物屬于β-內酰胺類，但是對細菌產生的β-內酰胺酶穩(wěn)定，曾經是治療鮑曼不動桿菌感染的重要藥物，如今耐藥率不斷上升，藥物敏感試驗結果顯示耐藥率為83.33%。鑒于此，世界衛(wèi)生組織已經將耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌列為嚴重威脅人類健康的細菌，借此提醒醫(yī)務工作者及患者防范該細菌[9]。OXA類碳青霉烯酶分為四個類別，分別是OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58，是鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物產生耐藥性最主要的原因[10]。 OXA-23介導的耐藥性最為多見，它由質粒編碼，耐藥性可隨質粒在細菌間擴散[11]。用PCR方法在基因水平檢測OXA-23基因的有無，結果顯示在20株耐碳青霉烯菌中13株為陽性，可見產生這一基因位于多數(shù)耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌的遺傳物質上。生物膜形成是細菌致病機制之一，細菌通過這種“群體行為”抵抗外界的壓力，引起醫(yī)院感染的常見細菌如肺炎克雷伯菌等耐藥基因與生物膜有關[12]。鮑曼不動桿菌臨床分離株在病人體內形成生物膜可能更有利于耐藥基因在菌株間傳遞，所以結晶紫染色法顯示耐藥菌株形成生物膜的能力更強。

蛋白O-甘露糖修飾研究主要見于真核細胞，近些年，包括分枝桿菌屬在內的多個種屬細菌蛋白也存在O-甘露糖修飾[13]。O-甘露糖蛋白被認為是細菌重要的毒力因子，將鮑曼不動桿菌O-甘露糖基轉移酶敲除，將大大減弱細菌形成生物膜的能力，提示蛋白連接的甘露糖在生物膜形成中的重要作用[14]。OmpA是目前已知的可增強細菌耐藥性的O-甘露糖蛋白[15]，在本研究中，耐藥菌株和非耐藥菌株O-甘露糖蛋白的區(qū)別主要體現(xiàn)在A1S_ 3626上，提示這一O-甘露糖基化蛋白可能在細菌耐藥及生物膜形成中有重要作用。O-甘露糖蛋白提高細菌耐藥性的機制還不是很清楚，已有的研究提示糖鏈可能在此功能上很重要[14]，通過糖基化位點預測，5種蛋白的糖基化位點共7～28個不等，下一步將對檢測到的5種糖蛋白的糖鏈進行解析，進一步探討包括A1S_3626在內的O-甘露糖蛋白在耐藥性及生物膜形成中的作用。