單細(xì)胞分析研究二氧化氯對(duì)殺蚊細(xì)菌球形賴氨酸芽胞桿菌芽胞的影響

李翠梅，王曉春，張秀娟，劉軍賢，王桂文*

（1.廣西師范大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，桂林 541004；2.廣西科學(xué)院，南寧 530007）

蚊蟲是我們生活中的?？停坏}擾我們的工作和睡眠，而且更嚴(yán)重的是傳播疾病。常用的化學(xué)殺蚊劑容易污染環(huán)境，破壞生態(tài)，長期使用還會(huì)出現(xiàn)抗藥性蚊蟲。而球形賴氨酸芽胞桿菌Lysinibacillussphaericus（Ls）是一種產(chǎn)芽胞細(xì)菌，對(duì)幼蚊有特異的毒性作用[1]；在適宜的環(huán)境下，其芽胞會(huì)在死幼蚊體內(nèi)再循環(huán)，是安全有效的生物防治殺蚊劑[2,3]。其主要毒力活性因子是由二元毒素（BinA和BinB蛋白）組成的蛋白晶體，伴隨著芽胞的形成而形成，包裹在芽胞外壁內(nèi)，對(duì)庫蚊Culexspp.、按蚊Anophelesspp.有很高的毒力，對(duì)伊蚊Aedesspp.低毒或無毒[4,5]。雖然芽胞不是殺蚊的主體，但是Ls生長繁殖的重要環(huán)節(jié)。Ls制劑的施用過程可能會(huì)遇到影響制劑活性的不利條件，影響芽胞的萌發(fā)和菌體在水體環(huán)境的繁殖生長以及死幼蚊體內(nèi)再循環(huán)，進(jìn)而影響菌劑的生防效果和持效性。

二氧化氯（ClO2）是目前國際上公認(rèn)的最新一代的殺菌劑[6,7]，也是生物制劑實(shí)際使用期間可能遇到的農(nóng)藥。ClO2可以有效殺滅大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、家蠶微孢子蟲、甲型肝炎病毒、小球藻等絕大多數(shù)微生物。張曉煜[8]用改進(jìn)的 Lowry法-二喹啉甲酸（BCA）發(fā)現(xiàn)：ClO2破壞了細(xì)菌屏障，造成胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，但不是細(xì)菌死亡的主要原因；胞內(nèi)核酸不是ClO2作用的靶位，菌體死亡與ClO2作用后引起的細(xì)胞質(zhì)凝集密切相關(guān)。Ofori等[9]研究了ClO2對(duì)大腸桿菌形態(tài)、外膜通透性、細(xì)胞膜破裂和胞內(nèi)酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)ClO2使大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)膜受損、胞內(nèi)成分泄露。

細(xì)菌芽胞作為一種休眠體，胞內(nèi)有高含量吡啶二羧酸鈣（Ca2+-DPA），能耐干燥、受熱、輻射、有毒的化學(xué)物質(zhì)等[10]。芽胞一旦萌發(fā)，就喪失原有的抵抗力。有幾種情形都可以誘發(fā)芽胞萌發(fā)，一是芽胞內(nèi)膜上受體蛋白識(shí)別營養(yǎng)物質(zhì)，觸發(fā)芽胞萌發(fā)（如GerA受體識(shí)別 L-alanine，GerB/K受體識(shí)別AGFK）[11,12]；二是非營養(yǎng)萌發(fā)劑（如十二烷胺）直接或間接打開SpoVA蛋白通道，引起DPA和芽胞內(nèi)小分子的釋放[13,14]；三是芽胞皮層肽聚糖與皮層水解酶（CwlJ和 SleB）結(jié)合，觸發(fā)芽胞萌發(fā)；或者是從一個(gè)芽胞釋放出來的CaDPA可能刺激相鄰芽胞的萌發(fā)[15,16]。Young和Setlow[17]發(fā)現(xiàn)ClO2處理沒有導(dǎo)致枯草芽胞桿菌芽胞內(nèi)核大量釋放DPA，被ClO2處理的芽胞可以啟動(dòng)芽胞萌發(fā)的最初步驟，但可能由于某種類型的膜損傷而不能進(jìn)一步發(fā)展為營養(yǎng)細(xì)胞，具體的機(jī)制尚不清楚。此外，前述研究都是基于群體分析得到的認(rèn)識(shí)，而多細(xì)胞實(shí)時(shí)微分干涉差（Differential interference contrast，DIC）顯微鏡術(shù)實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平大量分析單個(gè)細(xì)菌芽胞的萌發(fā)動(dòng)態(tài)，大大促進(jìn)了對(duì)芽胞的萌發(fā)機(jī)制及理化因子對(duì)芽胞的作用機(jī)理的認(rèn)識(shí)[14,15,18]。因此，本研究應(yīng)用單細(xì)胞分析方法，一方面探究ClO2對(duì)Ls制劑中的芽胞結(jié)構(gòu)和芽胞萌發(fā)相關(guān)蛋白的影響，另一方面分析ClO2處理造成芽胞不能進(jìn)一步生長的原因，從單細(xì)胞水平補(bǔ)充 ClO2對(duì)細(xì)菌芽胞殺滅機(jī)制的新認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株和培養(yǎng)基

菌株：球形賴氨酸芽胞桿菌采用世界衛(wèi)生組織推薦的高效殺蚊菌株 2362為研究菌株，由中國科學(xué)院武漢病毒所惠贈(zèng)。

本研究采用的基本培養(yǎng)基如文獻(xiàn)[18]所述，但采用的產(chǎn)芽胞培養(yǎng)基是NYSM[3]：蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸出粉 3.0 g/L、氯化鈉 5.0 g/L，酵母提取物 0.5 g/L，MnCl2·4H2O 0.009895 g/L，CaCl20.0777 g/L，MgCl2·6H2O 0.2033 g/L。經(jīng)121 ℃、20 min高溫滅菌備用。

1.2 芽胞制備

Ls芽胞制備與Bt芽胞制備類似[18]，取2%活化后的菌液轉(zhuǎn)入產(chǎn)芽胞培養(yǎng)基（NYSM），30 ℃，250 r/min，培養(yǎng)60～72 h，顯微鏡鏡檢芽胞率達(dá)到99%以上，離心收集芽胞，并用無菌去離子水清洗和純化6次。將純化芽胞放4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ClO2處理與芽胞萌發(fā)

1.3.1 芽胞ClO2處理 將Ls芽胞稀釋為濃度約為10–8個(gè)芽胞/mL，吸取芽胞懸液0.1 mL，加入2 mL的離心管中，5000 r/min離心機(jī)離心5 min，去上清，分別加入1 mL 0.05%、0.075%、0.1%、0.15%、0.3% ClO2，25 ℃處理5 min后加入0.5% Na2S2O31 mL，25 ℃處理5 min以終止ClO2作用；5000 r/min離心8 min，去上清，加入1 mL無菌去離子水洗3次。對(duì)照組用無菌去離子水代替ClO2做同樣處理（即0% ClO2）。

1.3.2 芽胞存活率測(cè)定 芽胞存活率檢測(cè)如文獻(xiàn)[18]所述。芽胞經(jīng)ClO2處理后做10–3～10–5梯度稀釋，吸取0.1 mL在LB固體培養(yǎng)基上，用涂布棒均勻涂布，每個(gè)梯度3個(gè)平板，在30 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，選擇0～200個(gè)菌落范圍內(nèi)的平板計(jì)數(shù)。用自編Cell Counter小程序統(tǒng)計(jì)在LB培養(yǎng)基上形成的單菌落數(shù)，計(jì)算芽胞的存活率。

1.3.3 拉曼數(shù)據(jù)采集和處理 使用自主搭建光鑷?yán)庾V系統(tǒng)（LTRS）[19]采集單個(gè)芽胞的拉曼光譜。將對(duì)照和ClO2處理過的芽胞懸浮在無菌水中，取0.1～0.2 mL放入樣品槽內(nèi)，在100倍物鏡下，光鑷隨機(jī)捕獲單個(gè)芽胞，收集芽胞拉曼光譜，信號(hào)積累時(shí)間為20 s。在相同的條件下，收集光鑷中沒有芽胞的光譜，并作為背景。每個(gè)處理共收集50個(gè)芽胞光譜和5個(gè)背景光譜。數(shù)據(jù)處理的方法如文獻(xiàn)[20]所述：將光譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為文本格式，導(dǎo)入Matlab程序扣除背景、相鄰法平滑曲線，再對(duì)光譜基線進(jìn)行校正，以峰面積法計(jì)算特征峰1017 cm-1和1652 cm-1峰的峰面積作為信號(hào)強(qiáng)度。

1.3.4 芽胞萌發(fā)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) 將Ls芽胞用無菌水稀釋到10-3梯度，經(jīng)熱激處理（80 ℃，30 min；0 ℃，15 min）后的萌發(fā)條件如下。營養(yǎng)萌發(fā)：50 mmol/L丙氨酸和25 mmol/L Hepes緩沖液，pH 7.4、37 ℃；非營養(yǎng)萌發(fā)：（1）0.8 mmol/L十二烷胺和25 mmol/L Hepes緩沖液，pH 7.4、45 ℃；（2）60 mmol/L外源CaDPA，30 ℃。

芽胞萌發(fā)監(jiān)測(cè)過程如文獻(xiàn)[18]所述。以每3 s一幀，曝光時(shí)間200 ms，連續(xù)采集120 min。Matlab自編程序，讀取芽胞圖像灰度值積分。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin 8.5，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，芽胞相對(duì)亮度為縱坐標(biāo)，繪制成芽胞萌發(fā)動(dòng)態(tài)曲線，讀取芽胞萌發(fā)參數(shù)值。將芽胞萌發(fā)經(jīng)歷的三個(gè)階段（三個(gè)時(shí)間點(diǎn)）分別定義為 Tlag（芽胞啟動(dòng)快速釋放 CaDPA），Trelease（CaDPA 完全釋放）和 Tlys（肽聚糖皮層完全水解）。ΔTrelease是CaDPA快速釋放過程（ΔTrelease＝Trelease—Tlag），ΔTlys是芽胞皮層水解的過程（ΔTlys＝Tlys—Trelease）。

2 結(jié)果與分析

2.1 ClO2處理后芽胞的存活率及拉曼光譜分析

0.05%、0.075%、0.1%、0.15%和0.3% ClO2處理5 min后芽胞的存活率分別約為64%、51%、42%、36%、14%。然而，即使是0.3% ClO2處理5 min，大多數(shù)芽胞仍然保留CaDPA（圖1A）。

圖1B是處理后單個(gè)芽胞的平均拉曼光譜，其中661 cm-1、823 cm-1、1017 cm-1、1397 cm-1、1449 cm-1和1572 cm-1是CaDPA的特征峰；1220～1290 cm-1、1630～1680 cm-1是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征峰，其中1260～1290 cm-1、1645～1655 cm-1表征α-螺旋結(jié)構(gòu)，1240～1260 cm-1和 1660～1690 cm-1表征無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[22]。處理后芽胞的CaDPA和蛋白質(zhì)的特征峰位置沒有明顯的改變，但峰強(qiáng)度有所減弱。圖1C顯示CaDPA（1017 cm-1）峰的強(qiáng)度隨處理濃度升高而有所降低，而表征蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的1652 cm-1峰和無規(guī)則卷曲的1678 cm-1峰強(qiáng)度與對(duì)照（即0% ClO2處理）相比沒有明顯變化。表明 ClO2處理后芽胞有少量CaDPA泄漏情況，但蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有明顯的改變。

圖1 不同濃度ClO2處理5 min后的Ls芽胞存活率和芽胞DPA保留率（A），單個(gè)芽胞平均拉曼光譜（B），芽胞1017和1652 cm-1峰強(qiáng)度（C）Fig.1 Spore viability and DPA retention after 5 min treatment with different concentrations of chlorine dioxide (ClO2) at 25 oC (A),the averaged Raman spectra of treated spores retained DPA and lost DPA (B), the intensities of peaks 1017 and 1652 cm-1 of treated spores and untreated spores (C)

2.2 ClO2處理對(duì)單個(gè)Ls芽胞萌發(fā)的影響

2.2.1 營養(yǎng)萌發(fā) 圖2A是Ls芽胞在50 mmol/L丙氨酸觸發(fā)下的群體萌發(fā)曲線，對(duì)照和0.05%、0.075%、0.1%、0.15%、0.3% ClO2處理的芽胞120 min內(nèi)的萌發(fā)率分別大約是97%、89%、50%、27%、17%和7%。0.05%處理對(duì)芽胞萌發(fā)影響不顯著，而ClO2濃度增加到0.075%之后，萌發(fā)率降低了一半。對(duì)照芽胞萌發(fā)迅速，大多數(shù)在10 min內(nèi)萌發(fā)，單個(gè)芽胞萌發(fā)動(dòng)態(tài)基本相同（圖2B）。而0.075% ClO2及更高濃度處理后，芽胞萌發(fā)動(dòng)力學(xué)與對(duì)照明顯不同，萌發(fā)速度變慢，CaDPA快速釋放過程延長，皮層水解過程也相應(yīng)延長，在Tlag之前，芽胞DIC圖像強(qiáng)度緩慢下降（圖2D）。

圖2C是芽胞萌發(fā)參數(shù)。ClO2處理5 min后的芽胞Tlag值顯著增加，是對(duì)照的2～7倍；ΔTrelease值是CaDPA釋放過程，隨著ClO2處理濃度增加而增大。ClO2處理5 min后，ΔTrelease值是對(duì)照的1～5倍，ΔTlys是對(duì)照的1～2倍。ClO2處理后，Tlag時(shí)芽胞的相對(duì)亮度明顯低于對(duì)照，顯示在Tlag之前已有部分CaDPA泄漏。根據(jù)相對(duì)亮度推算[23]，在CaDPA開始快速釋放前，已有約5%～31%的CaDPA已經(jīng)釋放到芽胞外，而對(duì)照僅有3%左右。

圖2 ClO2處理5 min后Ls芽胞群體的丙氨酸萌發(fā)曲線（A），8個(gè)單個(gè)芽胞的萌發(fā)動(dòng)態(tài)（B：對(duì)照；D：0.15% ClO2處理）和萌發(fā)參數(shù)對(duì)比（C）Fig.2 Germination of Ls spores treated by different concentrations of chlorine dioxide (ClO2) for 5 min (A), germination dynamics of single spores untreated (B) or treated by 0.15% ClO2 (D), and germination parameters (C)

2.2.2 非營養(yǎng)萌發(fā) 十二烷胺是一種陽離子表面活性劑，也可以觸發(fā)芽胞的非營養(yǎng)劑萌發(fā)，但不涉及芽胞的萌發(fā)劑受體（GRs），也不激活皮層水解酶，可能是通過打開DPA芽胞內(nèi)膜上的釋放通道，導(dǎo)致CaDPA釋放[24]。與營養(yǎng)萌發(fā)不同，十二烷胺萌發(fā)沒有明顯的芽胞皮層水解過程。ClO2處理同樣影響十二烷胺觸發(fā)的萌發(fā)，120 min內(nèi)的萌發(fā)率由對(duì)照的95%依次降為83%、55%、36%、26%、17%左右（圖3A）。與丙氨酸萌發(fā)相似，處理后的芽胞萌發(fā)緩慢，Tlag值增大，ΔTrelease延長，而在Tlag之前，芽胞DIC圖像強(qiáng)度緩慢下降（圖3 B、D）。萌發(fā)參數(shù)顯示（圖3C），與對(duì)照相比，處理5 min后的芽胞Tlag、ΔTrelease顯著延長，分別增加2～7倍，2～3倍左右。SD值顯示，對(duì)照組芽胞間Tlag、ΔTrelease差異小，而隨著ClO2處理強(qiáng)度的增強(qiáng)，芽胞間Tlag、ΔTrelease值異質(zhì)性增大。同樣的，處理后的芽胞，已有17%～35%左右的CaDPA在Tlag前已經(jīng)緩慢釋放到芽胞外，而對(duì)照芽胞只有12%左右。

圖3 ClO2處理5 min后Ls芽胞群體的十二烷胺萌發(fā)曲線（A），8個(gè)芽胞的萌發(fā)動(dòng)態(tài)（B：對(duì)照；D：0.15% ClO2處理5 min），萌發(fā)參數(shù)對(duì)比（C）Fig.3 Dodecylamine germination of Ls spores treated by different concentrations of chlorine dioxide (ClO2) for 5 min (A), germination dynamics of 8 individual untreated spores (B) or spores treated with 0.15% ClO2 (D), germination parameters of single spores (C)

外源CaDPA通過激活枯草芽胞桿菌B.subtilis芽胞外膜上的皮層水解酶 CwlJ、SleB而誘導(dǎo)芽胞萌發(fā)[25]。外源CaDPA也可以誘導(dǎo)Ls芽胞的非營養(yǎng)萌發(fā)。在120 min內(nèi)，對(duì)照組Ls芽胞萌發(fā)率達(dá)到97%左右，0.05%ClO2處理5 min后降為87%左右，而0.075% ClO2處理5 min后萌發(fā)率僅為6%；更高強(qiáng)度處理后的芽胞則完全失去萌發(fā)能力（圖4A）。0.05% ClO2處理后的單個(gè)芽胞萌發(fā)動(dòng)態(tài)與對(duì)照類似，只是萌發(fā)過程變慢，Tlag值是對(duì)照的2倍左右，而ΔTrelease和ΔTlys值基本不變（圖4B）。

圖4 不同ClO2濃度處理5 min后，外源CaDPA（60 mmol/L，30 ℃）觸發(fā)的Ls芽胞萌發(fā)（A：群體萌發(fā)曲線；B：對(duì)照和0.05% ClO2處理的萌發(fā)參數(shù)）Fig.4 CaDPA germination of treated or untreated Ls spores (treated by ClO2 for 5 min at 30 ℃) initialed by 60 mmol/L exogenous CaDPA (A: Germination of Ls spores; B: Germination parameters for untreated and treated spores by 0.05% ClO2 for 5 min)

3 討論

芽胞存活率顯示，Ls對(duì)ClO2有一定的抗性，0.3% ClO2處理5 min后86%的芽胞在48～60 h內(nèi)不能形成單菌落（圖1A）。0.15% ClO2處理5 min后，有少量的芽胞內(nèi)CaDPA泄漏。而拉曼數(shù)據(jù)顯示，CaDPA（1017 cm-1）、蛋白質(zhì)（1248 cm-1）的峰強(qiáng)度降低，而1652 cm-1的峰強(qiáng)度沒有明顯變化（圖1C）。表明ClO2處理沒有明顯損傷Ls芽胞內(nèi)膜。

蛋白質(zhì)在芽胞萌發(fā)過程中起著重要的作用，與芽胞萌發(fā)相關(guān)的蛋白主要有芽胞內(nèi)膜上的受體蛋白，皮層水解酶，DPA釋放通道蛋白SpoVA以及其他輔助蛋白等[13,14]。在營養(yǎng)萌發(fā)中，熱激溫度、萌發(fā)劑濃度及萌發(fā)劑的受體蛋白（GRs）數(shù)量等3個(gè)因素影響了芽胞開始快速釋放CaDPA的起始時(shí)間[26]。在本研究中，前兩個(gè)因素相同，而造成ClO2處理后芽胞Tlag值增加（圖2D）的可能性是另一個(gè)因素，即能感受萌發(fā)劑的受體蛋白數(shù)量減少了，原因是ClO2處理損傷了芽胞內(nèi)膜上的部分受體蛋白，使其失去功能。

芽胞在接到萌發(fā)信號(hào)后，觸動(dòng)芽胞打開內(nèi)膜上的通道，CaDPA開始快速釋放，這個(gè)過程與熱激處理、GRs 數(shù)量、萌發(fā)劑濃度沒有關(guān)系。萌發(fā)參數(shù)（圖2C）顯示，與對(duì)照相比，ClO2處理的芽胞ΔTrelease值放大了1～5倍，表明ClO2可能也損害了芽胞內(nèi)膜上的通道蛋白SpoVA[27]。十二烷胺萌發(fā)也印證了上述推斷。十二烷胺萌發(fā)機(jī)理是直接或間接打開DPA通道，引起芽胞內(nèi)小分子和DPA的釋放[24]，而ClO2處理后芽胞的Tlag、ΔTrelease值分別放大2～7倍和2～3倍，也表明ClO2處理影響了芽胞內(nèi)膜，CaDPA釋放通道及相關(guān)蛋白可能受損。

萌發(fā)過程需要的蛋白還有皮層水解酶CwlJ、SleB以及相鄰的GerQ、YpeB蛋白[28]。水解酶作用于芽胞皮層，使皮層水解，核內(nèi)吸水膨大，芽胞得以恢復(fù)新陳代謝，長成營養(yǎng)細(xì)胞。如果皮層水解酶的活力降低以及酶蛋白的數(shù)量減少，則皮層水解速度減緩，水解過程延長，甚至不水解。在外源CaDPA萌發(fā)中，0.05% ClO2處理后的芽胞萌發(fā)Tlag值是對(duì)照的2倍左右，而ΔTrelease和ΔTlys值基本不變；0.075% ClO2處理的芽胞萌發(fā)率6%，更高濃度或強(qiáng)度的處理，Ls芽胞完全失去萌發(fā)力（圖4），這表明ClO2處理嚴(yán)重影響了皮層水解酶。而營養(yǎng)萌發(fā)中，ClO2處理也令皮層水解過程顯著延長（圖2）。上述兩方面數(shù)據(jù)結(jié)果表明ClO2處理嚴(yán)重?fù)p傷Ls芽胞的皮層水解酶，這可能是ClO2處理的芽胞可以啟動(dòng)芽胞萌發(fā)的最初步驟，而不能進(jìn)一步發(fā)展為營養(yǎng)細(xì)胞的原因[17]。因此，環(huán)境因子或殺菌劑對(duì)Ls芽胞的不利作用，可能影響Ls菌體在水體環(huán)境的生長繁殖能力，進(jìn)而影響了菌劑的持效性。

Young等[17]在群體水平上研究了 ClO2殺死蘇云金芽胞桿菌芽胞的機(jī)制，認(rèn)為可能是由于某種類型的內(nèi)膜損傷而使萌發(fā)的芽胞不能進(jìn)一步發(fā)展為營養(yǎng)細(xì)胞，具體原因不清楚。本研究從單細(xì)胞水平分析了ClO2對(duì)Ls芽胞及其萌發(fā)的影響，揭示了ClO2的作用機(jī)制。試驗(yàn)結(jié)果表明，ClO2處理5 min后大部分芽胞不能形成新的單菌落，但營養(yǎng)和非營養(yǎng)萌發(fā)下的單芽胞萌發(fā)動(dòng)態(tài)顯示，ClO2處理不僅僅損傷萌發(fā)劑受體蛋白及其相關(guān)蛋白，使其失去功能，而且損傷芽胞內(nèi)膜的CaDPA釋放通道，受損最大的是皮層水解酶；細(xì)菌芽胞不能進(jìn)一步發(fā)展為營養(yǎng)細(xì)胞的主要原因可能是ClO2嚴(yán)重?fù)p傷芽胞皮層水解酶。因此，Ls制劑在實(shí)際使用過程要避免與ClO2混用或者接觸。