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    飼養(yǎng)溫度對(duì)蠋蝽胰蛋白酶活性的影響及消化器官形態(tài)初步觀察

    2022-07-09 10:00:46朱艷娟殷焱芳陳紅印劉晨曦
    關(guān)鍵詞:口器中腸唾液腺

    朱艷娟,殷焱芳,王 震,陳紅印,劉晨曦*

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/中美生物防治實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;2.張北縣自然資源和規(guī)劃局,張北 076450)

    捕食性蝽使用口外消化作為一種捕食策略,攝食前用細(xì)長(zhǎng)的針尖狀口器刺穿獵物組織,分泌強(qiáng)有力的水解唾液,注入消化酶,同時(shí)保持獵物角質(zhì)層的完整,這種高效的食物攝取和利用系統(tǒng),對(duì)于肉食性昆蟲(chóng)尤為重要[1]。在口外完成初步消化后,吮吸液化的獵物組織到消化道內(nèi)[2,3],進(jìn)一步消化和吸收[4]。消化酶活性直接影響著昆蟲(chóng)對(duì)食物消化、吸收的能力,消化酶的相關(guān)研究是營(yíng)養(yǎng)學(xué)和飼料學(xué)研究的主要內(nèi)容之一,是了解昆蟲(chóng)消化生理的重要內(nèi)容。根據(jù)消化物質(zhì)不同,消化酶被分為淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶和纖維素酶等。其中,蛋白酶是一種極為重要的消化酶,能將食物中大量的蛋白質(zhì)進(jìn)行催化分解為小分子氨基酸被細(xì)胞吸收,從而用于昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育[5]。與植食性昆蟲(chóng)相比,肉食性昆蟲(chóng)分泌更多的蛋白酶[6,7]。胰蛋白酶(trypsin)是肉食昆蟲(chóng)中最重要的一種水解蛋白酶[1,6],是絲氨酸蛋白酶的一種,以裂解堿性氨基酸羧基側(cè)蛋白鏈的形式進(jìn)行水解蛋白,參與了多種生理生化的過(guò)程,包括食物蛋白的消化,激素活化和免疫反應(yīng)[8],在捕食性蝽的口外消化和腸道消化中起著關(guān)鍵作用,對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要[9]。

    蠋蝽ArmachinensisFallou隸屬于半翅目Hemiptera蝽科Pentatomidae,可捕食鞘翅目、鱗翅目等多種農(nóng)林害蟲(chóng),捕食范圍較廣,是一種控害能力很強(qiáng)的天敵昆蟲(chóng)。我國(guó)南北地區(qū)緯度跨度較大,氣溫差異顯著,蠋蝽在我國(guó)東北、華北、華中、華東和西南等地區(qū)均有分布[10],環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)。目前主要圍繞蠋蝽的生物學(xué)特性[11-18]、室內(nèi)擴(kuò)繁[19-25]及捕食范圍[26-27]等方面做了大量研究,而蠋蝽消化酶活性的研究尚缺少報(bào)道。有研究表示,昆蟲(chóng)的消化道是昆蟲(chóng)體內(nèi)與外界環(huán)境接觸的最主要的區(qū)域,蝽的消化酶起源于唾液腺?gòu)?fù)合體而不是中腸[28]。鑒于此,本試驗(yàn)圍繞蠋蝽的唾液腺和中腸兩個(gè)消化部位的胰蛋白酶活性進(jìn)行研究。根據(jù)我國(guó)南北方氣溫差異特點(diǎn),設(shè)置了5個(gè)溫度梯度,測(cè)定不同溫度下蠋蝽唾液腺和中腸的胰蛋白酶活性,分析蠋蝽對(duì)飼養(yǎng)溫度的生理生化適應(yīng)性,探尋蠋蝽主要消化酶的適宜溫度,以期為蠋蝽的最適飼養(yǎng)溫度及不同地區(qū)田間釋放的最佳季節(jié)提供生理生化方面的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試?yán)ハx(chóng)

    蠋蝽飼養(yǎng)在人工氣候箱內(nèi),環(huán)境條件設(shè)置為溫度(26±1)℃,相對(duì)濕度(65±5)%,光周期16L:8D。用柞蠶蛹飼喂。柞蠶蛹購(gòu)于遼寧省西豐縣農(nóng)豐生防專業(yè)合作社。

    1.2 溫度對(duì)蠋蝽胰蛋白酶活性影響

    1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將試驗(yàn)處理溫度設(shè)置為15 ℃、20 ℃、26 ℃、30 ℃和35 ℃五個(gè)梯度。選取人工飼養(yǎng)的蠋蝽種群蛻皮后1 d的成蟲(chóng)接入直徑55 mm的硬質(zhì)塑料培養(yǎng)皿容器中,進(jìn)行單頭饑餓處理,為防止蠋蝽逃逸,培養(yǎng)皿上加蓋,蓋上打滿小孔,孔徑2 mm,增加容器內(nèi)透氣性。培養(yǎng)皿內(nèi)放置浸濕蒸餾水的脫脂棉塊為蠋蝽提供水源,在溫度(26±1)℃、光周期 16L:8D、相對(duì)濕度 65%±5%的飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi),經(jīng)饑餓處理24 h后,把蠋蝽放入300 mL硬塑料太空杯中,紗網(wǎng)封蓋杯口,用細(xì)橡皮筋固定,防止逃脫;在紗網(wǎng)上放置鮮活柞蠶蛹和一塊2 cm×2 cm方形脫脂棉浸足水分,為蠋蝽提供生長(zhǎng)充足的食物和水分。然后,分別放入預(yù)先設(shè)置好的5個(gè)溫度的培養(yǎng)箱內(nèi),每個(gè)溫度處理設(shè)置3組重復(fù),每組20頭。飼喂24 h。

    1.2.2 組織樣品準(zhǔn)備 將不同溫度處理后的蠋蝽,先用蒸餾水沖洗干凈,然后用濾紙吸取表面水分,再用75%酒精消毒后放置于盛有預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.2~7.4)的解剖盤(pán)中,剪去雙翅及足部,在解剖顯微鏡下,用精細(xì)鑷子劃開(kāi)蠋蝽前胸腹板,用鑷子夾住身體固定,另一個(gè)鑷子夾住頭部輕拉,顯露出完整的唾液腺?gòu)?fù)合體及中腸,剝除腸道外壁粘連的脂肪體,在PBS拓展液中沖洗干凈,迅速分別放入預(yù)冷的1.5 mL的離心管中。每個(gè)溫度處理的樣品包括唾液腺和中腸兩個(gè)部位,設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù),3個(gè)技術(shù)重復(fù),每個(gè)生物學(xué)重復(fù)收集20頭蠋蝽的組織。用液氮速凍,放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 酶液制備 將已備的組織樣本,分別液氮中研磨,稱取1 g,再將9 mL的PBS緩沖液(pH 7.2~7.4)加入1.5 mL的離心管中,用電動(dòng)研磨棒在冰上研磨充分成勻漿,離心20 min(2000~3000 r/min),吸取上清液作酶液,分裝待測(cè)。-80 ℃冰凍保存。測(cè)試前4 ℃下解凍。

    1.2.4 胰蛋白酶活性測(cè)定 使用昆蟲(chóng)胰蛋白酶 Trypsin酶聯(lián)免疫分析試劑盒,利用雙抗體夾心法,用純化的昆蟲(chóng)胰蛋白酶抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入待測(cè)樣品,再與 HRP標(biāo)記的胰蛋白酶抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下終止反應(yīng),形成最終的黃色,用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中昆蟲(chóng)胰蛋白酶活性濃度。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

    1.2.5 蠋蝽消化器官的初步觀察 從蠋蝽種群中選取新羽化24 h健康體壯的成蟲(chóng),用蒸餾水沖洗干凈,后用濾紙吸取表面水分,放入預(yù)冷PBS緩沖液中,減緩蟲(chóng)體行動(dòng),在立體顯微鏡下,將蠋蝽的口器、唾液腺及中腸完整解剖取出(解剖步驟見(jiàn)1.2.2),使用超景深三維顯微系統(tǒng)(vhx-2000)觀察及拍照口器全貌,用立體顯微鏡取出蠋蝽唾液腺觀察及拍照。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Graphpad 7.0進(jìn)行方差分析,不同處理間的顯著差異性用LSD進(jìn)行檢驗(yàn)。文中數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 溫度對(duì)胰蛋白酶活性的影響

    2.1.1 溫度對(duì)蠋蝽唾液腺胰蛋白酶活性的影響 通過(guò)方差分析得出,不同溫度下蠋蝽唾液腺胰蛋白酶活性存在顯著差異(F4,10=35.33,P<0.0001),26 ℃溫度飼養(yǎng)下的胰蛋白酶活性濃度最高,平均為1413.9 IU/L,其次濃度較高的是20 ℃,平均為863.6 IU/L,30 ℃和35 ℃溫度下的胰蛋白酶濃度略低于20 ℃,但無(wú)顯著差異,15 ℃時(shí)胰蛋白酶濃度最低,平均為289 IU/L(圖1)。

    圖1 不同溫度下蠋蝽唾液腺的胰蛋白酶活性濃度Fig.1 Trypsin activity concentration in salivary glands of A.chinensis at different temperatures

    2.1.2 溫度對(duì)蠋蝽中腸胰蛋白酶活性的影響 不同溫度下蠋蝽中腸胰蛋白酶活性存在顯著差異(F4,10=52.55,P<0.0001),26 ℃飼養(yǎng)下的胰蛋白酶活性濃度最高,平均為1029.2 IU/L,其次為20 ℃,胰蛋白酶平均濃度為711.8 IU/L,30 ℃時(shí)胰蛋白酶濃度略低于20 ℃時(shí),但無(wú)顯著差異,35 ℃時(shí)顯著下降,15 ℃飼養(yǎng)下的胰蛋白酶濃度最低,平均為231.3 IU/L(圖2)。

    圖2 不同溫度下蠋蝽中腸的胰蛋白酶活性濃度Fig.2 Trypsin activity concentration in midgut of A.chinensis at different temperatures

    2.1.3 不同溫度下蠋蝽唾液腺與中腸間胰蛋白酶活性的比較 在不同飼養(yǎng)溫度下,蠋蝽唾液腺胰蛋白酶活性均高于中腸胰蛋白酶活性,其中26 ℃溫度下,唾液腺顯著高于中腸,但在15 ℃、20 ℃、30 ℃和35 ℃溫度條件下,兩個(gè)部位的胰蛋白酶濃度無(wú)顯著差異(圖3)。

    圖3 不同溫度下蠋蝽唾液腺和中腸的胰蛋白酶活性濃度Fig.3 Trypsin activity concentration in salivary glands and midgut of A.chinensis at different temperatures

    2.2 蠋蝽口器與唾液腺形態(tài)初步觀察

    蠋蝽的口器:刺吸式,由上唇(labrum)、喙(proboscis)和口針束(stylet fascicle)三部分組成。不取食時(shí),喙通常緊貼著前胸腹板正中,長(zhǎng)度至第三對(duì)足基節(jié)中間。上唇較短,與喙的近端口重合,被半包于喙基部第一節(jié);喙呈細(xì)長(zhǎng)圓柱體狀,由4個(gè)關(guān)節(jié)組成,近端和遠(yuǎn)端都有開(kāi)口,里面包被著口針束;口針束細(xì)長(zhǎng)如絲,共4根,與喙長(zhǎng)度相近。取食時(shí),喙從胸足間抽出,遠(yuǎn)端口伸出口針束,第一節(jié)與第二節(jié)折疊呈一定角度,與上唇和口針束重合處形成三角區(qū)(圖4)。

    圖4 蠋蝽口器觀察圖Fig.4 Photos of the mouthpart of A.chinensis

    蠋蝽的唾液腺:主要包括一對(duì)主唾液腺和主唾腺管、一對(duì)副唾液腺和副唾液腺管,主腺分前葉和后葉,內(nèi)容物在立體顯微鏡下觀察整體呈透明狀(圖5A)。

    蠋蝽的消化道:從食道開(kāi)始,與之相連的是嗉囊(crop),形狀膨大,下端連接中腸(midgut),中腸呈管狀,粗壯發(fā)達(dá),可分為三部分,即中腸第一節(jié)、第二節(jié)、第三節(jié),多為淺黃色內(nèi)容物(與取食獵物有關(guān)),與中腸第三節(jié)相連的是后腸(hindgut),較為短小,不好區(qū)分回腸、結(jié)腸、直腸,末端開(kāi)口于肛門(mén)(圖5B)。

    圖5 蠋蝽消化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Structure of digestive system of A.chinensis

    3 討論

    本研究結(jié)果表明,飼養(yǎng)溫度的變化顯著影響著蠋蝽的生理代謝過(guò)程,不同溫度下蠋蝽體內(nèi)胰蛋白酶活性均不一樣,且唾液腺的酶活性均高于中腸的酶活性,26 ℃既是酶活性呈現(xiàn)最高值的溫度,又是兩個(gè)部位差異表現(xiàn)最顯著的溫度。在15~26 ℃,隨著溫度的升高蠋蝽唾液腺和中腸內(nèi)胰蛋白酶活性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì);26~35 ℃,隨著溫度的升高,胰蛋白酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在五個(gè)溫度梯度范圍內(nèi),胰蛋白酶活性表現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì),這與金銀花尺蠖Heterolochaaphaga[29]、黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor[30]等昆蟲(chóng),以及刺參Apostichopusjaponicus[31]、波紋龍蝦PanulirusHomarus[32]等變溫動(dòng)物一樣,均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。這可能是酶參與昆蟲(chóng)的新陳代謝,在一定溫度范圍內(nèi),酶在低溫時(shí)活化分子較少,催化分解作用速率低,隨著溫度上升,酶的活化分子逐漸增多,加速了催化反應(yīng),催化活性隨之增強(qiáng),超過(guò)生長(zhǎng)發(fā)育的適溫區(qū),高溫下酶蛋白發(fā)生變性,其催化活性隨之下降,昆蟲(chóng)體內(nèi)代謝失去平衡,生化機(jī)能受到明顯抑制。這一溫度范圍,與蠋蝽在我國(guó)分布區(qū)域的氣候條件相吻合,春夏季農(nóng)林作物生長(zhǎng)速率快,尤其在夏季雨季,作物和害蟲(chóng)快速生長(zhǎng),而蠋蝽主要的消化酶活性恰好在 20~26 ℃呈現(xiàn)上升,食物需求量大,在此時(shí)期進(jìn)行蠋蝽的田間釋放,食物的大量需求,促使其捕食更多獵物,可有力遏制害蟲(chóng)數(shù)量,防止蟲(chóng)害大規(guī)模發(fā)生,極大地提高了生物防治效率。

    適宜環(huán)境溫度下,蠋蝽唾液腺及中腸內(nèi)均具有較強(qiáng)的蛋白酶活性,尤其唾液腺?gòu)?fù)合體內(nèi)的胰蛋白酶活性顯著高于中腸,表明它的胰蛋白酶主要來(lái)自唾液內(nèi),通過(guò)口外消化初步利用食物中的蛋白來(lái)源。Cohen[1]曾研究得出,胰蛋白酶從唾液腺通過(guò)唾液管分泌到食物中,再與食物一起攝入,并在腸道中使用,以繼續(xù)分解蛋白質(zhì)[1]。Oliveira[33]在黑刺益蝽Podisusnigrispinus唾液腺中檢測(cè)到重要的消化性蛋白酶。由此可見(jiàn),捕食性半翅目昆蟲(chóng)具有口外消化特點(diǎn),其唾液腺體中,常有胰蛋白酶,并被認(rèn)為是捕食性昆蟲(chóng)主要的唾液蛋白酶[1,4,34]。本試驗(yàn)測(cè)定了蠋蝽體內(nèi)基本的消化酶活性,為蠋蝽消化系統(tǒng)的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為蠋蝽的人工飼料酶類添加劑的研制提供了理論依據(jù)。

    昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)由唾液腺和消化道組成,昆蟲(chóng)消化道主要由三部分組成:前腸、中腸及后腸,前腸又分為咽喉、食道、嗉囊和前胃四個(gè)部分[35];中腸具有胃盲囊和胃;后腸包括回腸、結(jié)腸和直腸[36]。研究發(fā)現(xiàn),蠋蝽消化系統(tǒng)與其他半翅目昆蟲(chóng)一樣,較為復(fù)雜,唾液腺是由不同的葉狀體及附管組成的復(fù)合體,主要包括一對(duì)主唾液腺和一對(duì)細(xì)管狀副唾液腺[34-38],這些腺體的內(nèi)容物是透明和含水的,這為它們作為水回收器官的作用提供了支持[1,39,40],副腺體可能參與消化過(guò)程的水循環(huán),保障大量的唾液流動(dòng),稀釋并初步分解被攝取的獵物,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收[1]。蠋蝽消化道大體分為食道、嗉囊、中腸和后腸,食道是一條管道,后端膨大形成的嗉囊是儲(chǔ)存場(chǎng)所,暫存著經(jīng)過(guò)口外初步消化的食物及唾液腺分泌的唾液;中腸是消化食物和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要區(qū)域[36,41,42],多呈管狀,是分泌消化酶和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所。經(jīng)解剖觀察發(fā)現(xiàn),蠋蝽的中腸較長(zhǎng),呈管狀,粗壯發(fā)達(dá),說(shuō)明蠋蝽中腸消化能力較強(qiáng)。蠋蝽中腸可分為三個(gè)部分,這與半翅目昆蟲(chóng)的中腸常劃分為 3~4段[43]相一致。第一部分消化功能最強(qiáng),其內(nèi)消化酶濃度最高;中腸第二節(jié)含有一定的消化酶,會(huì)對(duì)食糜物再次消化吸收;中腸第三節(jié)多呈膨大狀,內(nèi)容物多為食物殘?jiān)?,其?nèi)消化酶大量減少。鑒于此,在對(duì)半翅目蝽科昆蟲(chóng)的消化生理研究時(shí),可選擇中腸的第一、第二節(jié)作為重點(diǎn)研究部位,研究相關(guān)排泄系統(tǒng)時(shí),可增加中腸第三節(jié)部分。

    蠋蝽口器作為昆蟲(chóng)攝食源頭的功能器官,對(duì)其研究是理解其生態(tài)的重要途徑。Coronado等[44]也認(rèn)為,昆蟲(chóng)口器的結(jié)構(gòu)影響其取食模式及被消化的食物類型。半翅目昆蟲(chóng)是典型的刺吸式口器,特化為針狀結(jié)構(gòu),有利于口器在獵物體內(nèi)組織間穿刺,從而特異性地吸食獵物營(yíng)養(yǎng)豐富的體液[45]。觀察發(fā)現(xiàn),蠋蝽口器的喙由4個(gè)關(guān)節(jié)組成,這與其他蝽科昆蟲(chóng)的喙有3節(jié)組成不同[37]。蠋蝽的口針束同時(shí)刺入獵物體內(nèi)后,口針在獵物體內(nèi)可分散穿向不同方位進(jìn)行吸取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),能很好地反映捕食性蝽的取食機(jī)制[46-49],研究中發(fā)現(xiàn)蠋蝽更喜取食固態(tài)物質(zhì),可能因?yàn)榱髻|(zhì)食物稀釋了捕食者的口外分泌物,且很難恢復(fù)它們注入人工獵物體內(nèi)的消化酶[41],阻礙正常消化。本文通過(guò)對(duì)蠋蝽的口器進(jìn)行初步的顯微鏡觀察,探討口器結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,為探索蠋蝽口器的取食控害過(guò)程,為天敵昆蟲(chóng)的人工飼料固液形態(tài)的研發(fā)提供參考。

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