郝 昕,鄧 振,陳 潔,刁 健,李 洋,王欣然,馬 玲
(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,哈爾濱 150040)
松材線蟲Bursaphelechusxylophilus引起的松樹萎蔫?。ㄓ址Q松材線蟲病)是世界森林生態(tài)系統(tǒng)中具有極大危險(xiǎn)性和破壞性的森林病害。該病害對(duì)亞洲和歐洲的松林造成毀滅性破壞,對(duì)森林生態(tài)安全造成嚴(yán)重威脅。自 1982年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲至今,雖全力防治,但全國(guó)由于松材線蟲引起的破壞仍造成了數(shù)十億株松樹的損失,造成的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)價(jià)值損失更是高達(dá)千億元[1,2]。截至2021年,松樹萎蔫病已在全國(guó)19個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市)、742個(gè)縣級(jí)行政區(qū)發(fā)生,占縣級(jí)行政區(qū)總數(shù)的26.1%。累計(jì)發(fā)生面積180.92萬hm2,同比上升62.40%,造成病死松樹1407.92萬株,并且表現(xiàn)出由點(diǎn)狀分布向片狀發(fā)展及向西和向北快速擴(kuò)散的態(tài)勢(shì)[3,4]。松材線蟲對(duì)我國(guó)松林破壞巨大,嚴(yán)重影響我國(guó)的森林生態(tài)系統(tǒng)安全,阻礙了我國(guó)生態(tài)文明建設(shè)進(jìn)程。
熱激蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)是一類廣泛存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)植物中的蛋白質(zhì)分子家族。當(dāng)生物體暴露于高溫時(shí),就會(huì)通過熱激發(fā)合成此種蛋白,以保護(hù)有機(jī)體自身。按照蛋白的質(zhì)量大小,熱激蛋白共分為五個(gè)亞族,分別為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 以及小分子熱激蛋白(small Heat Shock Proteins,sHSPs)[5]。許多熱激蛋白具有分子伴侶活性,可以協(xié)助細(xì)胞內(nèi)分子組裝和蛋白質(zhì)折疊發(fā)揮功能[6]。在秀麗線蟲Caenorhabditiselegans中的研究表明熱激蛋白不僅可以調(diào)節(jié)生物體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力,延長(zhǎng)生物體的壽命,還會(huì)激活生物體提高對(duì)重金屬及藥物的抗性[7,8]。因此HSP基因是近年來對(duì)生物耐熱機(jī)制等研究最多的蛋白之一[9]。對(duì)松材線蟲Bx-HSPs基因家族成員的研究有助于了解松材線蟲的擴(kuò)散機(jī)制,進(jìn)而為宏觀把控和防治松材線蟲的擴(kuò)散和蔓延提供理論指導(dǎo)。
本研究基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的秀麗線蟲HSPs基因和相關(guān)文獻(xiàn),利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)松材線蟲基因組數(shù)據(jù),鑒定得到松材線蟲中HSPs基因23個(gè)。利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)獲得的Bx-HSPs基因進(jìn)行生物信息學(xué)特性分析,預(yù)測(cè)分析Bx-HSPs基因的具體功能。通過對(duì)Bx-HSPs基因特性及功能的具體分析,為研究松材線蟲HSPs家族基因功能奠定基礎(chǔ),也為尋找潛在靶標(biāo)基因,利用生物技術(shù)防治松材線蟲病提供了理論支持。
為了解松材線蟲Bx-HSPs家族成員信息,本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了秀麗線蟲全部 HSPs基因。隨后,以秀麗線蟲 HSPs氨基酸序列作為檢索序列在 Wormbase(https://wormbase.org)[10]上與松材線蟲基因組[11]數(shù)據(jù)進(jìn)行 BLAST比對(duì),得到松材線蟲 HSPs同源序列18個(gè)。加上文獻(xiàn)已報(bào)道的5個(gè)松材線蟲Bx-hsp基因Bx-hsp12(BXY_1656400.1)、Bx-hsp20(BXY_1035800.1)、Bx-hsp70(BXY_0013600.1)、Bx-hsp75(BXY_1666100.1)和Bx-hsp90(BXY_0009200.1),共23個(gè)HSPs基因[12,13]。
通過理化性質(zhì)分析,可以為目標(biāo)蛋白功能機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。在生物學(xué)中進(jìn)化樹用來表明物種之間的進(jìn)化關(guān)系。通過進(jìn)化樹的構(gòu)建,可以為預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白的功能提供線索。應(yīng)用蛋白分析(Expert Protein Analysis System,ExPASy)網(wǎng)站[14]中 ProtParam 工具(https://web.expasy.org/protparam/)[15]對(duì)Bx-HSPs蛋白的理化性質(zhì),如氨基酸數(shù)、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)、分子結(jié)構(gòu)式、原子總數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等進(jìn)行分析。通過Clustal X將得到的松材線蟲Bx-HSPs基因進(jìn)行序列比對(duì)分析[16],并通過CDD工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)Bx-HSPs保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)[17],隨后通過Mega 7軟件中的鄰位連接(neighbor-joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,自展重復(fù)抽樣檢驗(yàn)1000次[18]。
通過MEME(https://meme-suite.org/meme/)方法對(duì)蛋白質(zhì)序列的基序進(jìn)行分析[19],隨后通過Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)[20]和 InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)[21]獲得基序注釋信息。
蛋白質(zhì)親疏水性對(duì)蛋白的穩(wěn)定性和功能具有重要的意義,而分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域可以對(duì)目的蛋白屬于何種功能蛋白做出研判,對(duì)預(yù)測(cè)蛋白的功能和作用有著重大意義。運(yùn)用 ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行蛋白疏水性分析[22],運(yùn)用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和PSORTb(http://www.psort.org/psortb/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜螺旋區(qū)(Transmem-Brane helical segments, TMHs)[23]。使用Protter網(wǎng)站(http://wlab.ethz.ch/protter/start/)對(duì)蛋白質(zhì)的拓?fù)洚悩?gòu)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)[24]。
蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍,也是最重要的機(jī)制。它與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、生長(zhǎng)發(fā)育等諸多生物學(xué)問題有著密不可分的關(guān)系,研究蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)闡明蛋白質(zhì)功能具有重要的生物學(xué)意義。應(yīng)用NetPhos 3.1 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[25]預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)。分析絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)量。
通過對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的分析,可以解釋酶的催化機(jī)理或預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的突變位點(diǎn),從而推斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。研究蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),有利于了解蛋白質(zhì)的執(zhí)行功能,確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)于生物學(xué)研究是非常重要的。本研究通過SOPMA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測(cè)Bx-HSPs蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[26],運(yùn)用 SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)Bx-HSPs蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模[27]。
從松材線蟲基因組中鑒定得到23個(gè)松材線蟲Bx-HSPs基因家族成員(表1)。這23個(gè)松材線蟲Bx-HSPs基因相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸組成數(shù)量與相對(duì)分子質(zhì)量具有顯著性差異(表 2)。氨基酸組成數(shù)量為 111~770,平均氨基酸數(shù)量為373.91。相對(duì)分子質(zhì)量為12631.16~88459.08,平均為42107.39。這些蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)為 4.67~8.89,脂肪系數(shù)為 47.01~97.92。由此可見,這些蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性發(fā)生了明顯變化。蛋白質(zhì)親水性系數(shù)為-1.246~-0.101,蛋白質(zhì)的親水系數(shù)均為負(fù)值,表明上述23種熱激蛋白均為疏水蛋白。這些蛋白質(zhì)均由C、H、N、O和S五種原子組成。原子總數(shù)為1766~12464個(gè)不等。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)區(qū)間為26.22~62.90,共有12個(gè)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)大于40,其中有9個(gè)為小熱激蛋白,表明小熱激蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定可能性更高,而其他11種蛋白質(zhì)的系數(shù)小于40,其中有6個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果為HSP70,表明HSP70 的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。
表1 Bx-HSPs家族成員與秀麗線蟲HSPs家族成員對(duì)照表Table 1 Comparison table of Bx-HSPs and Ce-HSPs
表2 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果Table 2 Results of physicochemical properties of Bx-HSPs
通過構(gòu)建 NJ系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖 1)初步揭示了松材線蟲 HSPs家族成員的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系,以bootstrap多重采樣檢測(cè)作為結(jié)果的可靠性基礎(chǔ)。由表3可知,與預(yù)期相同,Bx-HSPs 家族蛋白質(zhì),特別是那些具有相似進(jìn)化關(guān)系的蛋白質(zhì),均含有相同或相似的蛋白質(zhì)基序。通過MEME對(duì)序列的詳細(xì)分析,得到了15個(gè)保守的蛋白質(zhì)序列基序(圖2)。隨后,通過Pfam和InterProScan對(duì)蛋白質(zhì)基序進(jìn)行分析,結(jié)果表明,基序8和基序9為HSP20結(jié)構(gòu)域,其他基序?yàn)镠SP70結(jié)構(gòu)域。
圖1 Bx-HSPs家族成員系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Bx-HSPs.
圖2 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)基序示意圖Fig.2 The motifs analysis of Bx-HSPs
表3 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)基序分析Table 3 The motifs analysis of Bx-HSPs.
根據(jù) Pfam 和 InterProScan分析各蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)可知,BXY_0210400.1、BXY_1656600.1、BXY_HSP12、BXY_0289500.1、BXY_1365700.1、BXY_1274600.1、BXY_0957900.1、BXY_0586000.1、BXY_0165400.1、BXY_0750300.1、BXY_1552700.1和BXY_ HSP20為small HSP亞家族成員,而BXY_1563600.1、BXY_0768000.1、BXY_0640100.1、BXY_0312700.1、BXY_1651000.1、BXY_1076000.1、BXY_0218300.1、BXY_0318200.1、BXY_HSP70為HSP70亞家族成員。隨后對(duì)沒有通過MEME分析得到蛋白質(zhì)基序的BXY_HSP75和BXY_HSP90進(jìn)行Conserved Domains Search分析研究發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)蛋白屬于HSP90亞家族成員。
蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果以BXY_1563600.1為例對(duì)Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果進(jìn)行說明。BXY_1563600.1蛋白中的第531位精氨酸(R)具有-3.944的低疏水性評(píng)分,由此可知它具有很高的親水性。相反,第395位的天冬氨酸(D)具有2.022的較高疏水性得分,表明其更具有疏水性。表4中列出了該家族氨基酸序列的疏水性分析結(jié)果,由該結(jié)果可知,該家族中的蛋白質(zhì)包含多個(gè)親水性和疏水性區(qū)域,但是他們的分布和聚集現(xiàn)象并不顯著。而通過TMHMM和PSORTb對(duì)蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn),該家族成員除BXY_1076000.1和 BXY_HSP90存在跨膜結(jié)構(gòu)外,其余家族成員均屬于胞內(nèi)蛋白。
表4 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)疏水性分析Table 4 Protein hydrophobicity analysis of Bx-HSPs
蛋白質(zhì)糖基化修飾除了影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運(yùn)輸和定位,還在分子識(shí)別、細(xì)胞通信、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程中發(fā)揮著重要的作用,因此糖基化位點(diǎn)分析具有十分重要的意義。Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明(表5),該家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上含有0~7個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。其中BXY-HSP70具有最多的N-糖基化位點(diǎn)個(gè)數(shù),共計(jì)有7個(gè)。研究表明,N-糖基化位點(diǎn)的存在對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊和運(yùn)輸非常重要。因此,該預(yù)測(cè)結(jié)果可以從另一個(gè)角度證實(shí)Bx-HSPs家族成員的分子伴侶特性。
表5 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析Table 5 Protein topological structure analysis of Bx-HSPs
蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含局部殘基之間由氫鍵所調(diào)節(jié)的相互作用。最普遍的二級(jí)結(jié)構(gòu)就是α-螺旋及β-折疊,此外還有β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲。Bx-HSPs家族成員二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明(表6),Bx-HSPs家族成員α-螺旋占比為15.00%~58.61%,其中sHSPs的成員α-螺旋占比均小于40%;Bx-HSPs家族成員β-折疊占比為10.93%~27.93%;Bx-HSPs家族成員β-轉(zhuǎn)角占比為2.46%~12.90%;Bx-HSPs家族成員無規(guī)卷曲占比為27.21%~55.00%,其中sHSPs的成員無規(guī)卷曲占比均大于40%。三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果表明(圖3),Bx-HSP70亞家族、Bx-HSP90亞家族及Bx-sHSP亞家族三級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯的形態(tài)學(xué)區(qū)別,因此執(zhí)行著不同的生物學(xué)功能。
表6 Bx-HSPs家族成員中構(gòu)成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)量分析Table 6 The number of amino acids that constitute the secondary structure in BX-HSPs.
圖3 Bx-HSPs家族成員三級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.3 The results of tertiary structure by Swiss-MODEL.
松材線蟲是世界多國(guó)公認(rèn)的外來入侵生物,由其引起的松樹萎蔫病導(dǎo)致松屬和杉屬等針葉樹種植物大量萎蔫死亡,危害極其嚴(yán)重[28]。隨著社會(huì)的進(jìn)步和發(fā)展,人類活動(dòng)對(duì)自然界的影響日益加劇,而如松材線蟲等外來生物的入侵風(fēng)險(xiǎn)也日益受到廣泛關(guān)注[29]。外來生物發(fā)揮自身潛能是在新環(huán)境下形成入侵和擴(kuò)散的關(guān)鍵[12]。本研究從生物信息學(xué)水平上分析熱激蛋白家族成員結(jié)構(gòu)與功能,為今后進(jìn)一步在分子水平上開展松材線蟲對(duì)溫度適應(yīng)性的研究打下了基礎(chǔ)。
本研究對(duì)松材線蟲Bx-HSPs家族成員進(jìn)行了多種形式的生物信息學(xué)分析。首先運(yùn)用ProtParam工具對(duì)Bx-HSPs家族成員的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,為目標(biāo)蛋白功能機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。隨后運(yùn)用鄰接法(NJ method)構(gòu)建了Bx-HSPs家族成員的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,從而比較Bx-HSPs家族中各成員的序列相似性。由于親疏水性在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中起著至關(guān)重要的作用,因此本研究通過對(duì)蛋白質(zhì)疏水性分析,分析了 Bx-HSPs家族成員的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。N-糖基化位點(diǎn)的數(shù)量對(duì)蛋白質(zhì)的折疊和運(yùn)輸起著重要作用,因此本研究對(duì)Bx-HSPs家族成員拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,結(jié)果證明了Bx-HSPs家族成員的分子伴侶特性。
截至目前,盡管有研究指出松材線蟲HSPs家族成員中有部分基因的變化使線蟲表現(xiàn)出對(duì)溫度改變的適應(yīng)性,但還沒有關(guān)于松材線蟲HSPs家族成員系統(tǒng)化報(bào)道。本研究的結(jié)果分析了松材線蟲HSPs家族成員調(diào)控線蟲響應(yīng)溫度適應(yīng)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而該家族基因調(diào)控松材線蟲響應(yīng)溫度適應(yīng)性的調(diào)控機(jī)制還有待后續(xù)研究進(jìn)行進(jìn)一步探索與發(fā)現(xiàn)。本研究的目的在于為探索松材線蟲擴(kuò)散的分子機(jī)制提供基礎(chǔ),從而為松材線蟲的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供理論支持。