• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    松材線蟲熱激蛋白家族成員結(jié)構(gòu)與功能分析

    2022-07-09 10:00:46王欣然
    關(guān)鍵詞:結(jié)構(gòu)分析

    郝 昕,鄧 振,陳 潔,刁 健,李 洋,王欣然,馬 玲

    (東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,哈爾濱 150040)

    松材線蟲Bursaphelechusxylophilus引起的松樹萎蔫?。ㄓ址Q松材線蟲病)是世界森林生態(tài)系統(tǒng)中具有極大危險(xiǎn)性和破壞性的森林病害。該病害對(duì)亞洲和歐洲的松林造成毀滅性破壞,對(duì)森林生態(tài)安全造成嚴(yán)重威脅。自 1982年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)松材線蟲至今,雖全力防治,但全國(guó)由于松材線蟲引起的破壞仍造成了數(shù)十億株松樹的損失,造成的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)價(jià)值損失更是高達(dá)千億元[1,2]。截至2021年,松樹萎蔫病已在全國(guó)19個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市)、742個(gè)縣級(jí)行政區(qū)發(fā)生,占縣級(jí)行政區(qū)總數(shù)的26.1%。累計(jì)發(fā)生面積180.92萬(wàn)hm2,同比上升62.40%,造成病死松樹1407.92萬(wàn)株,并且表現(xiàn)出由點(diǎn)狀分布向片狀發(fā)展及向西和向北快速擴(kuò)散的態(tài)勢(shì)[3,4]。松材線蟲對(duì)我國(guó)松林破壞巨大,嚴(yán)重影響我國(guó)的森林生態(tài)系統(tǒng)安全,阻礙了我國(guó)生態(tài)文明建設(shè)進(jìn)程。

    熱激蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)是一類廣泛存在于細(xì)菌、真菌和動(dòng)植物中的蛋白質(zhì)分子家族。當(dāng)生物體暴露于高溫時(shí),就會(huì)通過(guò)熱激發(fā)合成此種蛋白,以保護(hù)有機(jī)體自身。按照蛋白的質(zhì)量大小,熱激蛋白共分為五個(gè)亞族,分別為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 以及小分子熱激蛋白(small Heat Shock Proteins,sHSPs)[5]。許多熱激蛋白具有分子伴侶活性,可以協(xié)助細(xì)胞內(nèi)分子組裝和蛋白質(zhì)折疊發(fā)揮功能[6]。在秀麗線蟲Caenorhabditiselegans中的研究表明熱激蛋白不僅可以調(diào)節(jié)生物體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力,延長(zhǎng)生物體的壽命,還會(huì)激活生物體提高對(duì)重金屬及藥物的抗性[7,8]。因此HSP基因是近年來(lái)對(duì)生物耐熱機(jī)制等研究最多的蛋白之一[9]。對(duì)松材線蟲Bx-HSPs基因家族成員的研究有助于了解松材線蟲的擴(kuò)散機(jī)制,進(jìn)而為宏觀把控和防治松材線蟲的擴(kuò)散和蔓延提供理論指導(dǎo)。

    本研究基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的秀麗線蟲HSPs基因和相關(guān)文獻(xiàn),利用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool,https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對(duì)松材線蟲基因組數(shù)據(jù),鑒定得到松材線蟲中HSPs基因23個(gè)。利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)獲得的Bx-HSPs基因進(jìn)行生物信息學(xué)特性分析,預(yù)測(cè)分析Bx-HSPs基因的具體功能。通過(guò)對(duì)Bx-HSPs基因特性及功能的具體分析,為研究松材線蟲HSPs家族基因功能奠定基礎(chǔ),也為尋找潛在靶標(biāo)基因,利用生物技術(shù)防治松材線蟲病提供了理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 Bx-HSPs基因家族成員進(jìn)化關(guān)系及理化特性測(cè)定

    為了解松材線蟲Bx-HSPs家族成員信息,本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了秀麗線蟲全部 HSPs基因。隨后,以秀麗線蟲 HSPs氨基酸序列作為檢索序列在 Wormbase(https://wormbase.org)[10]上與松材線蟲基因組[11]數(shù)據(jù)進(jìn)行 BLAST比對(duì),得到松材線蟲 HSPs同源序列18個(gè)。加上文獻(xiàn)已報(bào)道的5個(gè)松材線蟲Bx-hsp基因Bx-hsp12(BXY_1656400.1)、Bx-hsp20(BXY_1035800.1)、Bx-hsp70(BXY_0013600.1)、Bx-hsp75(BXY_1666100.1)和Bx-hsp90(BXY_0009200.1),共23個(gè)HSPs基因[12,13]。

    通過(guò)理化性質(zhì)分析,可以為目標(biāo)蛋白功能機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。在生物學(xué)中進(jìn)化樹用來(lái)表明物種之間的進(jìn)化關(guān)系。通過(guò)進(jìn)化樹的構(gòu)建,可以為預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白的功能提供線索。應(yīng)用蛋白分析(Expert Protein Analysis System,ExPASy)網(wǎng)站[14]中 ProtParam 工具(https://web.expasy.org/protparam/)[15]對(duì)Bx-HSPs蛋白的理化性質(zhì),如氨基酸數(shù)、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)、分子結(jié)構(gòu)式、原子總數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)等進(jìn)行分析。通過(guò)Clustal X將得到的松材線蟲Bx-HSPs基因進(jìn)行序列比對(duì)分析[16],并通過(guò)CDD工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)Bx-HSPs保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)[17],隨后通過(guò)Mega 7軟件中的鄰位連接(neighbor-joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,自展重復(fù)抽樣檢驗(yàn)1000次[18]。

    1.2 蛋白質(zhì)序列基序分析

    通過(guò)MEME(https://meme-suite.org/meme/)方法對(duì)蛋白質(zhì)序列的基序進(jìn)行分析[19],隨后通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.xfam.org/)[20]和 InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)[21]獲得基序注釋信息。

    1.3 疏水性和跨膜螺旋區(qū)域分析

    蛋白質(zhì)親疏水性對(duì)蛋白的穩(wěn)定性和功能具有重要的意義,而分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域可以對(duì)目的蛋白屬于何種功能蛋白做出研判,對(duì)預(yù)測(cè)蛋白的功能和作用有著重大意義。運(yùn)用 ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行蛋白疏水性分析[22],運(yùn)用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和PSORTb(http://www.psort.org/psortb/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜螺旋區(qū)(Transmem-Brane helical segments, TMHs)[23]。使用Protter網(wǎng)站(http://wlab.ethz.ch/protter/start/)對(duì)蛋白質(zhì)的拓?fù)洚悩?gòu)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)[24]。

    1.4 磷酸化位點(diǎn)分析

    蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍,也是最重要的機(jī)制。它與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、生長(zhǎng)發(fā)育等諸多生物學(xué)問(wèn)題有著密不可分的關(guān)系,研究蛋白質(zhì)磷酸化對(duì)闡明蛋白質(zhì)功能具有重要的生物學(xué)意義。應(yīng)用NetPhos 3.1 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[25]預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)。分析絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸磷酸化位點(diǎn)數(shù)量。

    1.5 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及三級(jí)結(jié)構(gòu)建模

    通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的分析,可以解釋酶的催化機(jī)理或預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的突變位點(diǎn),從而推斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。研究蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),有利于了解蛋白質(zhì)的執(zhí)行功能,確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對(duì)于生物學(xué)研究是非常重要的。本研究通過(guò)SOPMA(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)預(yù)測(cè)Bx-HSPs蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[26],運(yùn)用 SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)Bx-HSPs蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模[27]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Bx-HSPs基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

    從松材線蟲基因組中鑒定得到23個(gè)松材線蟲Bx-HSPs基因家族成員(表1)。這23個(gè)松材線蟲Bx-HSPs基因相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)氨基酸組成數(shù)量與相對(duì)分子質(zhì)量具有顯著性差異(表 2)。氨基酸組成數(shù)量為 111~770,平均氨基酸數(shù)量為373.91。相對(duì)分子質(zhì)量為12631.16~88459.08,平均為42107.39。這些蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)為 4.67~8.89,脂肪系數(shù)為 47.01~97.92。由此可見,這些蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性發(fā)生了明顯變化。蛋白質(zhì)親水性系數(shù)為-1.246~-0.101,蛋白質(zhì)的親水系數(shù)均為負(fù)值,表明上述23種熱激蛋白均為疏水蛋白。這些蛋白質(zhì)均由C、H、N、O和S五種原子組成。原子總數(shù)為1766~12464個(gè)不等。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)區(qū)間為26.22~62.90,共有12個(gè)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)大于40,其中有9個(gè)為小熱激蛋白,表明小熱激蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定可能性更高,而其他11種蛋白質(zhì)的系數(shù)小于40,其中有6個(gè)預(yù)測(cè)結(jié)果為HSP70,表明HSP70 的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

    表1 Bx-HSPs家族成員與秀麗線蟲HSPs家族成員對(duì)照表Table 1 Comparison table of Bx-HSPs and Ce-HSPs

    表2 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果Table 2 Results of physicochemical properties of Bx-HSPs

    2.2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹及蛋白質(zhì)基序

    通過(guò)構(gòu)建 NJ系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖 1)初步揭示了松材線蟲 HSPs家族成員的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系,以bootstrap多重采樣檢測(cè)作為結(jié)果的可靠性基礎(chǔ)。由表3可知,與預(yù)期相同,Bx-HSPs 家族蛋白質(zhì),特別是那些具有相似進(jìn)化關(guān)系的蛋白質(zhì),均含有相同或相似的蛋白質(zhì)基序。通過(guò)MEME對(duì)序列的詳細(xì)分析,得到了15個(gè)保守的蛋白質(zhì)序列基序(圖2)。隨后,通過(guò)Pfam和InterProScan對(duì)蛋白質(zhì)基序進(jìn)行分析,結(jié)果表明,基序8和基序9為HSP20結(jié)構(gòu)域,其他基序?yàn)镠SP70結(jié)構(gòu)域。

    圖1 Bx-HSPs家族成員系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of Bx-HSPs.

    圖2 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)基序示意圖Fig.2 The motifs analysis of Bx-HSPs

    表3 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)基序分析Table 3 The motifs analysis of Bx-HSPs.

    根據(jù) Pfam 和 InterProScan分析各蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)可知,BXY_0210400.1、BXY_1656600.1、BXY_HSP12、BXY_0289500.1、BXY_1365700.1、BXY_1274600.1、BXY_0957900.1、BXY_0586000.1、BXY_0165400.1、BXY_0750300.1、BXY_1552700.1和BXY_ HSP20為small HSP亞家族成員,而BXY_1563600.1、BXY_0768000.1、BXY_0640100.1、BXY_0312700.1、BXY_1651000.1、BXY_1076000.1、BXY_0218300.1、BXY_0318200.1、BXY_HSP70為HSP70亞家族成員。隨后對(duì)沒(méi)有通過(guò)MEME分析得到蛋白質(zhì)基序的BXY_HSP75和BXY_HSP90進(jìn)行Conserved Domains Search分析研究發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)蛋白屬于HSP90亞家族成員。

    2.3 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)疏水性和跨膜螺旋區(qū)分析

    蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果以BXY_1563600.1為例對(duì)Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果進(jìn)行說(shuō)明。BXY_1563600.1蛋白中的第531位精氨酸(R)具有-3.944的低疏水性評(píng)分,由此可知它具有很高的親水性。相反,第395位的天冬氨酸(D)具有2.022的較高疏水性得分,表明其更具有疏水性。表4中列出了該家族氨基酸序列的疏水性分析結(jié)果,由該結(jié)果可知,該家族中的蛋白質(zhì)包含多個(gè)親水性和疏水性區(qū)域,但是他們的分布和聚集現(xiàn)象并不顯著。而通過(guò)TMHMM和PSORTb對(duì)蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn),該家族成員除BXY_1076000.1和 BXY_HSP90存在跨膜結(jié)構(gòu)外,其余家族成員均屬于胞內(nèi)蛋白。

    表4 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)疏水性分析Table 4 Protein hydrophobicity analysis of Bx-HSPs

    2.4 拓?fù)洚悩?gòu)模型預(yù)測(cè)

    蛋白質(zhì)糖基化修飾除了影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、生物活性、運(yùn)輸和定位,還在分子識(shí)別、細(xì)胞通信、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,因此糖基化位點(diǎn)分析具有十分重要的意義。Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明(表5),該家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上含有0~7個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。其中BXY-HSP70具有最多的N-糖基化位點(diǎn)個(gè)數(shù),共計(jì)有7個(gè)。研究表明,N-糖基化位點(diǎn)的存在對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊和運(yùn)輸非常重要。因此,該預(yù)測(cè)結(jié)果可以從另一個(gè)角度證實(shí)Bx-HSPs家族成員的分子伴侶特性。

    表5 Bx-HSPs家族成員蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析Table 5 Protein topological structure analysis of Bx-HSPs

    2.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)建模

    蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含局部殘基之間由氫鍵所調(diào)節(jié)的相互作用。最普遍的二級(jí)結(jié)構(gòu)就是α-螺旋及β-折疊,此外還有β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲。Bx-HSPs家族成員二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明(表6),Bx-HSPs家族成員α-螺旋占比為15.00%~58.61%,其中sHSPs的成員α-螺旋占比均小于40%;Bx-HSPs家族成員β-折疊占比為10.93%~27.93%;Bx-HSPs家族成員β-轉(zhuǎn)角占比為2.46%~12.90%;Bx-HSPs家族成員無(wú)規(guī)卷曲占比為27.21%~55.00%,其中sHSPs的成員無(wú)規(guī)卷曲占比均大于40%。三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果表明(圖3),Bx-HSP70亞家族、Bx-HSP90亞家族及Bx-sHSP亞家族三級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯的形態(tài)學(xué)區(qū)別,因此執(zhí)行著不同的生物學(xué)功能。

    表6 Bx-HSPs家族成員中構(gòu)成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)量分析Table 6 The number of amino acids that constitute the secondary structure in BX-HSPs.

    圖3 Bx-HSPs家族成員三級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.3 The results of tertiary structure by Swiss-MODEL.

    3 討論

    松材線蟲是世界多國(guó)公認(rèn)的外來(lái)入侵生物,由其引起的松樹萎蔫病導(dǎo)致松屬和杉屬等針葉樹種植物大量萎蔫死亡,危害極其嚴(yán)重[28]。隨著社會(huì)的進(jìn)步和發(fā)展,人類活動(dòng)對(duì)自然界的影響日益加劇,而如松材線蟲等外來(lái)生物的入侵風(fēng)險(xiǎn)也日益受到廣泛關(guān)注[29]。外來(lái)生物發(fā)揮自身潛能是在新環(huán)境下形成入侵和擴(kuò)散的關(guān)鍵[12]。本研究從生物信息學(xué)水平上分析熱激蛋白家族成員結(jié)構(gòu)與功能,為今后進(jìn)一步在分子水平上開展松材線蟲對(duì)溫度適應(yīng)性的研究打下了基礎(chǔ)。

    本研究對(duì)松材線蟲Bx-HSPs家族成員進(jìn)行了多種形式的生物信息學(xué)分析。首先運(yùn)用ProtParam工具對(duì)Bx-HSPs家族成員的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,為目標(biāo)蛋白功能機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。隨后運(yùn)用鄰接法(NJ method)構(gòu)建了Bx-HSPs家族成員的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,從而比較Bx-HSPs家族中各成員的序列相似性。由于親疏水性在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中起著至關(guān)重要的作用,因此本研究通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)疏水性分析,分析了 Bx-HSPs家族成員的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。N-糖基化位點(diǎn)的數(shù)量對(duì)蛋白質(zhì)的折疊和運(yùn)輸起著重要作用,因此本研究對(duì)Bx-HSPs家族成員拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析,結(jié)果證明了Bx-HSPs家族成員的分子伴侶特性。

    截至目前,盡管有研究指出松材線蟲HSPs家族成員中有部分基因的變化使線蟲表現(xiàn)出對(duì)溫度改變的適應(yīng)性,但還沒(méi)有關(guān)于松材線蟲HSPs家族成員系統(tǒng)化報(bào)道。本研究的結(jié)果分析了松材線蟲HSPs家族成員調(diào)控線蟲響應(yīng)溫度適應(yīng)性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。而該家族基因調(diào)控松材線蟲響應(yīng)溫度適應(yīng)性的調(diào)控機(jī)制還有待后續(xù)研究進(jìn)行進(jìn)一步探索與發(fā)現(xiàn)。本研究的目的在于為探索松材線蟲擴(kuò)散的分子機(jī)制提供基礎(chǔ),從而為松材線蟲的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供理論支持。

    猜你喜歡
    結(jié)構(gòu)分析
    《形而上學(xué)》△卷的結(jié)構(gòu)和位置
    隱蔽失效適航要求符合性驗(yàn)證分析
    論結(jié)構(gòu)
    新型平衡塊結(jié)構(gòu)的應(yīng)用
    模具制造(2019年3期)2019-06-06 02:10:54
    電力系統(tǒng)不平衡分析
    電子制作(2018年18期)2018-11-14 01:48:24
    電力系統(tǒng)及其自動(dòng)化發(fā)展趨勢(shì)分析
    論《日出》的結(jié)構(gòu)
    創(chuàng)新治理結(jié)構(gòu)促進(jìn)中小企業(yè)持續(xù)成長(zhǎng)
    中西醫(yī)結(jié)合治療抑郁癥100例分析
    在線教育與MOOC的比較分析
    亚洲av成人精品一二三区| 99久久人妻综合| 美女福利国产在线| 色哟哟·www| 日韩三级伦理在线观看| 国产av精品麻豆| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费人妻精品一区二区三区视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲成人一二三区av| 精品久久久久久电影网| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 午夜福利在线免费观看网站| 色网站视频免费| 欧美在线黄色| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品久久久久成人av| 性色avwww在线观看| 国产成人av激情在线播放| 精品国产一区二区久久| 交换朋友夫妻互换小说| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产在线一区二区三区精| 美女视频免费永久观看网站| 婷婷色av中文字幕| 欧美日韩成人在线一区二区| 在线观看免费视频网站a站| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久精品国产自在天天线| 夫妻性生交免费视频一级片| kizo精华| 一级爰片在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久热在线av| 国产男女内射视频| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲,欧美精品.| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产成人av激情在线播放| av片东京热男人的天堂| 这个男人来自地球电影免费观看 | 最近手机中文字幕大全| 中文字幕最新亚洲高清| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久久久视频综合| 久久精品亚洲av国产电影网| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| a级片在线免费高清观看视频| 日日啪夜夜爽| 国产老妇伦熟女老妇高清| 人妻人人澡人人爽人人| 国产精品久久久久久av不卡| 久久国产亚洲av麻豆专区| 少妇的丰满在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲成人av在线免费| 超色免费av| 欧美中文综合在线视频| 一级片'在线观看视频| 国产精品免费大片| www.熟女人妻精品国产| 波多野结衣一区麻豆| 在线观看免费视频网站a站| 中文字幕制服av| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久99热这里只频精品6学生| 看非洲黑人一级黄片| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品 国内视频| 中文天堂在线官网| 香蕉丝袜av| 一区二区三区精品91| 免费在线观看黄色视频的| 性少妇av在线| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久精品亚洲av国产电影网| 青草久久国产| 久久精品亚洲av国产电影网| 男女边摸边吃奶| 日韩中字成人| 美女主播在线视频| 久久这里只有精品19| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 少妇精品久久久久久久| 男女午夜视频在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 秋霞在线观看毛片| 午夜激情av网站| 久久午夜福利片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久ye,这里只有精品| 久久久久人妻精品一区果冻| 在线观看免费高清a一片| av福利片在线| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美日韩成人在线一区二区| 午夜日本视频在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲av中文av极速乱| 久久久久久久久久人人人人人人| 91精品三级在线观看| 熟女av电影| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲伊人色综图| 久久久久久人人人人人| 国产亚洲一区二区精品| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲欧美一区二区三区久久| 一本久久精品| 一级a爱视频在线免费观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费观看无遮挡的男女| 男女高潮啪啪啪动态图| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 男女高潮啪啪啪动态图| 9191精品国产免费久久| 秋霞在线观看毛片| 最近的中文字幕免费完整| 男人爽女人下面视频在线观看| 一二三四在线观看免费中文在| 妹子高潮喷水视频| 在线观看人妻少妇| 精品一区二区三卡| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲av综合色区一区| av电影中文网址| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久婷婷青草| 18禁国产床啪视频网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 老女人水多毛片| 中文字幕制服av| 老女人水多毛片| 在线观看免费视频网站a站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲人成77777在线视频| 一级片免费观看大全| 国产精品成人在线| 日本色播在线视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品久久蜜臀av无| xxx大片免费视频| 看免费av毛片| www日本在线高清视频| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产乱来视频区| 国产又爽黄色视频| 免费大片黄手机在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 欧美日韩综合久久久久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 老司机影院毛片| av.在线天堂| 国产精品 国内视频| 国产黄频视频在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一本色道久久久久久精品综合| 五月伊人婷婷丁香| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 又大又黄又爽视频免费| 男人操女人黄网站| av免费观看日本| 欧美bdsm另类| 免费在线观看黄色视频的| 免费在线观看黄色视频的| 又大又黄又爽视频免费| 精品国产一区二区久久| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 搡女人真爽免费视频火全软件| 一区在线观看完整版| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲美女视频黄频| 久久这里只有精品19| av网站在线播放免费| 免费观看性生交大片5| 男人爽女人下面视频在线观看| 女性被躁到高潮视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 午夜免费鲁丝| 超碰成人久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲国产精品国产精品| 国产精品国产av在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲情色 制服丝袜| 日日摸夜夜添夜夜爱| 老司机亚洲免费影院| 少妇 在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 只有这里有精品99| av免费在线看不卡| av天堂久久9| 热re99久久国产66热| 水蜜桃什么品种好| 久久精品国产a三级三级三级| 熟女av电影| 亚洲成人av在线免费| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产有黄有色有爽视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 90打野战视频偷拍视频| 国产极品天堂在线| 精品午夜福利在线看| 男男h啪啪无遮挡| 卡戴珊不雅视频在线播放| av国产久精品久网站免费入址| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 天天影视国产精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一区二区三区精品91| 成年女人毛片免费观看观看9 | 男女啪啪激烈高潮av片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 免费观看无遮挡的男女| 在现免费观看毛片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久这里有精品视频免费| 尾随美女入室| 大陆偷拍与自拍| 视频在线观看一区二区三区| 美女主播在线视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 一二三四中文在线观看免费高清| 9热在线视频观看99| 久久久久久久国产电影| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产黄色免费在线视频| 多毛熟女@视频| 免费日韩欧美在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产日韩欧美在线精品| 黄色配什么色好看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 美女国产视频在线观看| 色播在线永久视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 人体艺术视频欧美日本| 亚洲一区二区三区欧美精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| av电影中文网址| videos熟女内射| 欧美最新免费一区二区三区| 麻豆av在线久日| 最新中文字幕久久久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品少妇内射三级| 美女视频免费永久观看网站| 国产伦理片在线播放av一区| 边亲边吃奶的免费视频| 日本午夜av视频| 国产男人的电影天堂91| 国产成人免费无遮挡视频| av女优亚洲男人天堂| tube8黄色片| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在线观看三级黄色| 国产精品嫩草影院av在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产av一区二区精品久久| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲美女视频黄频| av一本久久久久| 亚洲国产色片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 成人国语在线视频| 久久97久久精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 男人舔女人的私密视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | av网站免费在线观看视频| 亚洲国产av新网站| 久久久久久久久免费视频了| 美女国产高潮福利片在线看| 成人免费观看视频高清| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一边亲一边摸免费视频| 国产在视频线精品| 自线自在国产av| 国产精品二区激情视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产视频首页在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 日本91视频免费播放| 国产熟女欧美一区二区| 日韩中文字幕视频在线看片| 免费日韩欧美在线观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲第一青青草原| 边亲边吃奶的免费视频| 国产成人91sexporn| 天美传媒精品一区二区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 18+在线观看网站| 天堂中文最新版在线下载| 久久久久精品久久久久真实原创| 中国国产av一级| 国产精品99久久99久久久不卡 | 自线自在国产av| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 正在播放国产对白刺激| 又黄又爽又免费观看的视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 在线免费观看的www视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 伦理电影免费视频| 欧美日韩精品网址| av欧美777| 久久精品成人免费网站| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 91精品三级在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 在线国产一区二区在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产一区二区在线av高清观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 天天影视国产精品| 亚洲黑人精品在线| 精品久久久久久成人av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| av中文乱码字幕在线| 免费高清在线观看日韩| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 久久久久国内视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品99久久99久久久不卡| 久热这里只有精品99| 日本免费a在线| 精品无人区乱码1区二区| 黄片播放在线免费| 亚洲欧美激情在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 一区在线观看完整版| 欧美大码av| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产xxxxx性猛交| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 男男h啪啪无遮挡| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 中文欧美无线码| 久久影院123| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲国产精品999在线| 免费高清在线观看日韩| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品久久久精品久久久| 99国产极品粉嫩在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 91老司机精品| 国产99白浆流出| 男女床上黄色一级片免费看| 在线观看午夜福利视频| www.精华液| 欧美激情久久久久久爽电影 | 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美日韩黄片免| 国产精品国产av在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲免费av在线视频| 亚洲午夜理论影院| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久久久国内视频| 成人影院久久| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产野战对白在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 成熟少妇高潮喷水视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 中文字幕人妻丝袜制服| 桃色一区二区三区在线观看| 一本综合久久免费| 男人舔女人下体高潮全视频| 18美女黄网站色大片免费观看| av天堂久久9| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产三级黄色录像| 午夜老司机福利片| 国产1区2区3区精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日本免费a在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产区一区二久久| 国产亚洲精品一区二区www| 一a级毛片在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 看免费av毛片| a在线观看视频网站| 亚洲色图综合在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| www.www免费av| 黑人操中国人逼视频| 亚洲国产看品久久| 成年人黄色毛片网站| 咕卡用的链子| 午夜免费观看网址| 两人在一起打扑克的视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日韩av在线大香蕉| 国产成人精品久久二区二区免费| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 9色porny在线观看| 久久人人精品亚洲av| a在线观看视频网站| 午夜福利影视在线免费观看| 国产欧美日韩一区二区三| 后天国语完整版免费观看| 精品久久久久久成人av| 最新美女视频免费是黄的| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久午夜亚洲精品久久| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 两性夫妻黄色片| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产成人系列免费观看| 国产精品成人在线| 成人精品一区二区免费| 亚洲国产看品久久| 精品国产一区二区久久| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品日韩av在线免费观看 | 中文字幕人妻熟女乱码| 一本综合久久免费| 久久精品国产清高在天天线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 午夜福利,免费看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 欧美激情久久久久久爽电影 | 1024香蕉在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美精品亚洲一区二区| 日本黄色日本黄色录像| 少妇的丰满在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 久久久久久久午夜电影 | 村上凉子中文字幕在线| 国产成人影院久久av| 黑人操中国人逼视频| 一进一出好大好爽视频| 国产国语露脸激情在线看| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩三级视频一区二区三区| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久99一区二区三区| 可以在线观看毛片的网站| 国产又爽黄色视频| 欧美乱妇无乱码| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 在线播放国产精品三级| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久狼人影院| aaaaa片日本免费| 亚洲精品国产区一区二| 一级,二级,三级黄色视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| avwww免费| 免费不卡黄色视频| 999精品在线视频| 一级,二级,三级黄色视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品国产一区二区精华液| 18禁观看日本| 国产成人影院久久av| av电影中文网址| 99热只有精品国产| av网站在线播放免费| 久久久国产欧美日韩av| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av网站免费在线观看视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品国产高清国产av| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 男女午夜视频在线观看| 国产精品成人在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品日韩av在线免费观看 | 正在播放国产对白刺激| 村上凉子中文字幕在线| 99久久国产精品久久久| 三上悠亚av全集在线观看| 国产色视频综合| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美日韩乱码在线| 亚洲精品在线美女| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美日韩精品网址| 人成视频在线观看免费观看| 午夜福利影视在线免费观看| 视频区欧美日本亚洲| 黄片播放在线免费| 在线观看一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 精品人妻1区二区| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 999久久久精品免费观看国产| 午夜福利在线观看吧| 一级a爱视频在线免费观看| 国产伦人伦偷精品视频| 黄色怎么调成土黄色| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲国产精品sss在线观看 | 亚洲男人天堂网一区| 多毛熟女@视频| 国产真人三级小视频在线观看| 精品久久久久久电影网| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产三级黄色录像| 一级毛片精品| 国产黄a三级三级三级人| 久久影院123| 丰满的人妻完整版| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 丁香欧美五月| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产高清激情床上av| 久久影院123| 91精品三级在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产激情久久老熟女| 国产一区在线观看成人免费| 在线av久久热| 91成人精品电影| 亚洲成a人片在线一区二区| 嫩草影视91久久| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成人手机av| 久久久久久免费高清国产稀缺| 午夜免费激情av| 午夜两性在线视频| 国产成人影院久久av| 亚洲五月色婷婷综合| 1024视频免费在线观看| 精品福利观看| 久久亚洲真实| 777久久人妻少妇嫩草av网站| cao死你这个sao货| 国产精品一区二区精品视频观看| 在线看a的网站| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 亚洲国产精品合色在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 嫁个100分男人电影在线观看| 超碰97精品在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 色哟哟哟哟哟哟| 麻豆国产av国片精品| 少妇粗大呻吟视频| 欧美日韩一级在线毛片| www.自偷自拍.com| 99热国产这里只有精品6| 日本五十路高清| 精品日产1卡2卡| 精品人妻在线不人妻| 精品第一国产精品| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲国产欧美网| 欧美成人性av电影在线观看| a级毛片黄视频| 久久精品91无色码中文字幕| 又紧又爽又黄一区二区| 国产精品成人在线| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 免费在线观看亚洲国产| 日本欧美视频一区|