澤瀉白斑病防治藥劑篩選及藥材安全風(fēng)險評價

余振懷，肖婕妤，鄧秋林，文秋姝，巫 蔚，鄭 滔，張亞琴，劉 江，陳興福

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西南作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實驗室，成都 611130）

澤瀉為常用大宗藥材，是利水滲濕之要藥。澤瀉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《本草綱目》中記載：“神農(nóng)書列澤瀉于上品……其繆可知”之句?！吨袊幍洹罚?020年版，一部）記載藥材澤瀉為澤瀉科植物東方澤瀉Alismaorientate(Sam.) Juzep.或澤瀉Alismaplantago-aquaticaLinn.的干燥塊莖。澤瀉味甘、淡，性寒，有利水滲濕，泄熱，化濁降脂的功效[1]。藥理學(xué)研究表明其醇提物、水提物具有利尿、抗結(jié)石及腎臟保護(hù)、降血脂及保肝、降血糖、抗氧化損傷、抗炎、抗補(bǔ)體等多種藥理活性[2]。

澤瀉白斑病的防治措施影響澤瀉產(chǎn)量與安全性。隨著福建改革開放的不斷深入與臺海經(jīng)濟(jì)圈建設(shè)，建澤瀉生產(chǎn)的比較效益降低，造成了種植面積大幅度下降，川澤瀉種植面積不斷擴(kuò)大，年產(chǎn)量 9500噸，占全國總產(chǎn)量的85%以上。白斑病主要危害澤瀉葉片、莖，造成葉片變黃變枯，在整個生育期均可發(fā)生，每年造成的產(chǎn)量損失為25%～35%[3]，有效防治可保證澤瀉高產(chǎn)高效。澤瀉生產(chǎn)上白斑病防治缺乏科學(xué)指導(dǎo)，濫用農(nóng)藥現(xiàn)象突出，農(nóng)殘超標(biāo)的情況時有發(fā)生，鄭雙雙等[4]對11個地區(qū)澤瀉中7種農(nóng)藥的殘留量進(jìn)行檢測，不合格率為40%。中藥材的農(nóng)殘超標(biāo)是中藥材安全性關(guān)注的重點(diǎn)，而澤瀉白斑病防治目前僅有一些藥劑使用研究，生物農(nóng)藥春雷霉素和多抗霉素對澤瀉白斑病有較好的防治效果[5]，但關(guān)于澤瀉白斑病田間藥劑防效及其殘留變化規(guī)律研究較少。

以化學(xué)藥劑為主的防治技術(shù)已不符合當(dāng)下生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展趨勢。使用化學(xué)藥劑易導(dǎo)致藥材質(zhì)量降低和環(huán)境質(zhì)量下降，違背了“中藥材無公化栽培”的發(fā)展方向[6]。我國逐漸推出政策控制化學(xué)農(nóng)藥的使用，提出持續(xù)推進(jìn)農(nóng)藥減量增效，積極開展生物農(nóng)藥替代行動[7]。因此，本研究選用生產(chǎn)上常用的化學(xué)農(nóng)藥與生物農(nóng)藥開展防治澤瀉白斑病的藥效比較試驗，探究農(nóng)藥殘留的變化規(guī)律，評價對澤瀉藥材安全性的影響，為澤瀉白斑病的防治提供理論參考和應(yīng)用技術(shù)，促進(jìn)澤瀉產(chǎn)業(yè)的綠色發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：試驗植株經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)陳興福教授鑒定為澤瀉Alismaplantago-aquaticaLinn.。試驗藥劑：15%三唑酮可濕性粉劑（江蘇省鹽城利民農(nóng)化有限公司）、80%波爾多液可濕性粉劑（通州正大農(nóng)藥化工有限公司），2%春雷霉素水劑（日本北興），10%多抗霉素可濕性粉劑（日本科研制藥株式會社）。

試驗地點(diǎn)：在樂山市夾江縣青州鄉(xiāng)海濱農(nóng)場基地實施，該基地采用水稻-澤瀉輪作，試驗地土壤類型為紫泥土，肥力中等。

儀器與試劑：Agilent 1260 Ⅱ型高效液相色譜儀；島津LC-20A高效液相色譜儀；TAS-990原子吸收分光光度計；色譜柱：Symmetry C18250 mm×4.6 mm×5 μm；Synergy-超純水機(jī)；ALLgraX-30R-臺式冷凍離心機(jī)；5424R-離心機(jī)；超聲波清洗機(jī)（SB25-12DTD）；三唑酮標(biāo)準(zhǔn)品（中科質(zhì)檢有限公司）；春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品（邁迪嘉科技有限公司）；銅標(biāo)準(zhǔn)溶液（國標(biāo)檢驗認(rèn)證有限公司）；甲醇（色譜純 Fisher）；乙腈（色譜純 Fisher）；QuEChERS-凈化管2 mL（150 mg MgSO4+50 mg PSA）；無水乙酸鈉（分析純）；無水硫酸鎂（分析純）；庚烷基硫酸鈉（分析純）。

1.2 田間藥效試驗

采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。15%三唑酮可濕性粉劑、80%波爾多液可濕性粉劑、2%春雷霉素水劑和10%多抗霉素可濕性粉劑施用濃度分別為1000、1000、400、400倍液，用水量30 L/667 m2，對照噴施等量清水，共5個處理，設(shè)置3次重復(fù)。試驗小區(qū)面積14.4 m2（2 m×7.2 m），試驗小區(qū)總面積216 m2。8月底選用長勢一致的澤瀉幼苗移栽，株行距為25 cm×30 cm。在病害發(fā)生初期（澤瀉地上部分快速成長期）進(jìn)行第1次噴藥，隔7 d噴1次，共2次，使用手動噴霧器均勻噴施到各小區(qū)澤瀉植株上。調(diào)查藥前和藥后7 d的病葉數(shù)，每小區(qū)選5個點(diǎn)，每點(diǎn)選5株，計算病情指數(shù)和校正防效。病情指數(shù)＝∑（各級病葉數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值）×100；校正防效（%）＝[1－（處理區(qū)防治后病情指數(shù)/處理區(qū)前防治病情指數(shù)）×（對照區(qū)防治前病情指數(shù)/對照區(qū)防治后病情指數(shù)）]×100。

第2次噴藥后15 d后開始取樣，每15 d取樣1次直至采收，共取5次。采用五點(diǎn)取樣法，每小區(qū)取5株，將澤瀉塊莖用作農(nóng)藥殘留檢測。澤瀉采收時每小區(qū)按五點(diǎn)取樣法另取30株，將塊莖烘干測其產(chǎn)量。

1.3 澤瀉塊莖藥劑殘留分析

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱量適量三唑酮、春雷霉素和銅標(biāo)液，三唑酮和春雷霉素用乙腈稀釋配置成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋成0.01～1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；銅標(biāo)液用2%硝酸溶液0.05～1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。以濃度μg/mL為橫坐標(biāo)x，以峰面積為縱坐標(biāo)y，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.2 樣品前處理 三唑酮和春雷霉素樣品前處理：采用 QuECHERS前處理方法，取澤瀉粉末，過三號篩，取約5.0 g，精密稱定，置50 mL聚苯乙烯具塞離心管中，加入5 mL超純水，精密加乙腈溶液10 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，加入無水硫酸鎂與無水乙酸鈉的混合粉末（4:1）2.5 g，立即搖散，置振蕩器上2000 r/min振蕩培養(yǎng)10 min，8000 r/min離心5 min。取上清液2 mL，置已預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管（無水硫酸鎂150 mg，N-丙基乙二胺（PSA）50 mg）中，立即用使凈化完全，5000 r/min離心5 min，精密量取上清液1 mL用0.22 μm微孔濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中，作為HPLC供試品溶液。

銅樣品前處理：精密稱取澤瀉藥材粉末0.5 g置于四氟乙烯罐中，加硝酸-高氯酸（4:1）混合溶液5 mL，混勻，瓶口加一小漏斗，放置于通風(fēng)櫥內(nèi)，浸泡過夜。置電熱板上，加熱至微沸，若變棕黑色，再加硝酸-高氯酸（4:1）混合溶液適量，持續(xù)加熱至溶液澄明后升高溫度，繼續(xù)加熱至冒濃煙，直至白煙散盡，消解液呈無色透明或略帶黃色，放冷，轉(zhuǎn)入50 mL量瓶中，用2%硝酸溶液洗滌容器，洗液合并于量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。同法制備試劑空白溶液。

1.3.3 測定條件 春雷霉素使用島津LC-20A參考張清鵬[8]方法檢測：Symmetry C18250 mm×4.6 mm×5 μm；柱溫25 ℃；流動相：V（甲醇）:V（10 mmol/L的庚烷磺酸鈉緩沖液，pH=3）=1:9；流速1 mL/min；檢測波長215 nm；進(jìn)樣量20 μL，運(yùn)行時間15 min。

三唑酮使用Agilent 1260 Ⅱ參考楊石有[9]方法檢測：Symmetry C18250 mm×4.6 mm×5 μm；柱溫40℃；流動相甲醇：水（85:15）；流速1 mL/min；檢測波長230 nm；進(jìn)樣量20 μL，運(yùn)行時間6 min。

銅殘留按照《中國藥典》（2020年版，四部）火焰法檢測[10]：檢測波長324.7 nm，采用空氣-乙炔火焰，使用空白試驗進(jìn)行背景校正后檢測。

1.3.4 添加回收率試驗 選用澤瀉空白樣品，稱取5 g于50 mL離心管中。向其中添加0.05、0.10和0.5 mg/kg 3個水平，其中添加銅標(biāo)液為0.5、1和5 mg/kg這3個水平，每個添加水平設(shè)6次平行。在上述測定條件下進(jìn)行檢測，計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel 2010和DPS7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 白斑病防治藥效比較

4種藥劑防治澤瀉白斑病的結(jié)果表明，按推薦劑量和次數(shù)噴施后選用藥劑對澤瀉白斑病均有一定的防治效果，各處理小區(qū)產(chǎn)量存在差異（表1）。

表1 不同殺菌劑對澤瀉白斑病的防治效果Table 1 Control effect of different fungicides on Alisma orientalis white spot

1次藥后7 d病情指數(shù)相對與對照有所下降，說明病害得到了初步控制。15%三唑酮表現(xiàn)出理想的控制效果，與其余農(nóng)藥防效差異顯著。80%波爾多液和 2%春雷霉素防效較好，二者防效差異不顯著，與 10%多抗霉素防效差異顯著。

第2次藥后7 d空白病情指數(shù)更高，處理小區(qū)病情指數(shù)下降，說明病害進(jìn)一步得到了控制。空白病情指數(shù)為16.53，各處理病情指數(shù)為空白的9.92%～20.15%，說明試驗所有藥劑在連續(xù)使用2次后能夠有效防治澤瀉白斑病。2%春雷霉素防效最好為64.59%，與其他農(nóng)藥差異顯著，10%多抗霉素防效、15%三唑酮和80%波爾多液防效在45.27%～48.47%，差異不顯著。

對澤瀉產(chǎn)量的調(diào)查結(jié)果表明：各藥劑處理能夠防治澤瀉白斑病保證產(chǎn)量。處理小區(qū)與空白小區(qū)產(chǎn)量差異顯著，每公頃增產(chǎn)7.6%～22.3%，其中三唑酮處理小區(qū)產(chǎn)量最高，春雷霉素、三唑酮和波爾多液產(chǎn)量差異不顯著。

2.2 澤瀉藥材安全風(fēng)險評價

2.2.1 分析方法驗證 從檢測結(jié)果可以看出，在一定線性范圍內(nèi)，3種藥劑的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系（圖1，表2）。目前《中國藥典》（2020年版，四部）并未規(guī)定澤瀉中春雷霉素和三唑酮的最大殘留限量，參考食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品中農(nóng)藥最大殘留限量（GB 2763-2019）谷物中春雷霉素和三唑酮最大殘留限量，春雷霉素檢測限為0.05 mg/kg，低于規(guī)定中最大殘留限量0.1 mg/kg；三唑酮檢測限為0.02 mg/kg，低于規(guī)定中最大殘留限量0.2～0.5 mg/kg。銅檢測限為0.5 mg/kg，低于《中國藥典》（2020年版，四部）規(guī)定中銅最大殘留限量20 mg/kg。

圖1 三唑酮和春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（左為春雷霉素，右為三唑酮）Fig.1 Standard chromatograms of trizodone and riminomycin (Left for Triadimefon, Right for Kasugamycin)

表2 3種農(nóng)藥的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equation, correlation coefficient and detection limit of 3 fungicides

添加回收結(jié)果表明，在0.05～0.5 mg/kg添加水平下，三唑酮和春雷霉素的回收率在77%～91%，RSD在2.2%～6.7%（n=6）之間；在0.5～5 mg/kg添加水平下，銅的回收率在92%～102%，RSD在3.2%～4.7%（n=6）之間（表3），方法具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，滿足農(nóng)藥殘留檢測分析的要求[11]。

表3 3種農(nóng)藥在澤瀉中的添加回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n=6)Table 3 Recoveries and RSD of three fungicides in Alisma orientalis (n=6)

2.2.2 澤瀉藥材安全風(fēng)險比較 殘留分析結(jié)果表明，不同殺菌劑施用后在澤瀉塊莖中的動態(tài)殘留變化不同（多抗霉素產(chǎn)量相對最低，未作農(nóng)藥殘留分析）。從各藥劑在澤瀉塊莖中殘留量趨勢圖可以看出，三唑酮和春雷霉素總體呈下降趨勢，波爾多液呈先上升后下降趨勢。2%春雷霉素2次施藥后15 d沉積量為0.42 mg/kg，高于其最大殘留限量0.1 mg/kg，藥后30 d后已降解90.47%，低于最大殘留限量，到45 d時已檢測不出。15%三唑酮藥后15 d沉積量為0.91 mg/kg，高于其最大殘留限量0.2 mg/kg，藥后45 d低于最大殘留限量，采收時已降解95.04%。80%波爾多液在施藥后15 d到60 d都呈上升趨勢，到60 d時達(dá)到最高殘留量3.90 mg/kg，到采收時殘留量約為藥后15 d的3倍，均低于最大殘留限量20 mg/kg，銅為重金屬元素，不可降解，塊莖中含量升高，可能是從莖葉轉(zhuǎn)移到了塊莖中（圖2）。

圖2 澤瀉塊莖中農(nóng)藥殘留Fig.2 Pesticide residues in rhizome of Alisma orientalis

3 討論

試驗藥劑對澤瀉白斑病的防治效果存在差異?；瘜W(xué)農(nóng)藥15%三唑酮速效性好，能迅速控制病情，但生物農(nóng)藥2%春雷霉素施藥2次后防效更好。澤瀉采收時測產(chǎn)結(jié)果表明，2%春雷霉素小區(qū)與15%三唑酮小區(qū)產(chǎn)量差異不顯著，說明生物農(nóng)藥2%春雷霉素AS能夠保證澤瀉高產(chǎn)高效。80%波爾多液作為廣譜性殺菌劑，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，楊文成通過藥效試驗發(fā)現(xiàn)病初噴施波爾多液也有較好的防治效果[12]。葛有茂等[5]在福建開展?jié)蔀a白斑病防治藥劑的篩選結(jié)果中，10%多抗霉素2次藥后5 d防效為87.96%，與本試驗結(jié)果有一定差異，可能是施藥時間和氣候差異的原因。

施用生物農(nóng)藥后澤瀉藥材安全風(fēng)險最低。春雷霉素在澤瀉塊莖中降解最快，藥后30 d已低于0.1 mg/kg，藥后45 d已檢測不出。三唑酮在藥后30 d仍高于部分谷物的最大殘留限量0.2 mg/kg，波爾多液殘留量在澤瀉塊莖中呈上升再下降的趨勢，兩種化學(xué)農(nóng)藥在澤瀉塊莖中的殘留期都較長，在采收時都有少量農(nóng)藥殘留。澤瀉作為防病、治病的中藥材，也常用于保健食品行業(yè)，對藥材質(zhì)量的要求更加嚴(yán)格，施用春雷霉素后的澤瀉藥材不僅順應(yīng)藥材鮮加工的發(fā)展趨勢，也更符合中藥注射劑原料的質(zhì)量要求。施用生物農(nóng)藥對環(huán)境安全風(fēng)險也最低，春雷霉素極易溶于水，能在水中迅速降解，難以在土壤積累，對環(huán)境安全友好[13]。三唑酮?dú)埩魰r間較長，存在安全風(fēng)險，使用不當(dāng)極易導(dǎo)致殘留超標(biāo)問題，波爾多液中銅作為重金屬，長期使用會造成土壤中重金屬的積累，使環(huán)境質(zhì)量下降。

綜上，生物農(nóng)藥 2%春雷霉素防效好，殘留期短，相較化學(xué)農(nóng)藥安全性更高，對環(huán)境友好，符合綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的生態(tài)理念，是澤瀉白斑病防治的理想藥劑，在澤瀉生產(chǎn)中可作為白斑病防治的首選藥劑。