利用室內(nèi)微宇宙系統(tǒng)研究三唑酮對淡水浮游動物群落的影響

孫健，肖鵬飛，劉毅華，尹曉輝，朱國念

1. 浙江農(nóng)林大學(xué)，杭州 311300 2. 浙江農(nóng)林大學(xué)暨陽學(xué)院，諸暨 311800 3. 中國林科院亞熱帶林業(yè)研究所，富陽 311400 4. 浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州 310029

三唑酮(triadimefon)是一種甾醇合成抑制劑，因其廣譜性的殺菌作用，可用于防治水稻銹病[1]。在我國，三唑酮在農(nóng)田中被廣泛使用。施用方式的原因?qū)е氯蛲寐什桓?，最終在環(huán)境中存在殘留。根據(jù)中華人民共和國環(huán)境保護部2008年發(fā)布的《雜環(huán)類農(nóng)藥工業(yè)水污染物排放標準》，三唑酮原藥生產(chǎn)企業(yè)廢水處理設(shè)施總排放口的排放標準為5 000 μg·L-1。如果按照國家標準的臨界值濃度排放含有三唑酮的工業(yè)廢水，三唑酮有可能在環(huán)境中表現(xiàn)出短期高濃度暴露[2]。付巖[3]在農(nóng)藥使用期間檢測到稻田溝渠水中三唑酮的殘留濃度為12 μg·L-1，稻田附近池塘檢測到三唑酮濃度達到0.4 μg·L-1。三唑酮的用途廣泛，在國外，三唑酮可用于草坪防治灰斑病，Vincelli[4]模擬了高爾夫球場草地施用三唑酮后，檢測周圍地表水中農(nóng)藥的殘留情況，結(jié)果表明，水中三唑酮含量峰值可高達300 μg·L-1。除了三唑酮在施用地點的環(huán)境濃度有報道外，在江河湖口也有三唑酮檢出。游明華[5]在九龍江江口豐水期時檢測到三唑酮含量達0.173 μg·L-1，劉娜等[6]在2014—2017年于太湖流域飲用水源地檢測出三唑酮，濃度為0.002 μg·L-1。

三唑酮可以通過抑制細胞色素P-450酶系，以抑制麥角甾醇合成，使新生真菌細胞壁畸形，達到抑菌效果[7]。P-450酶系參與生物體多種內(nèi)分泌生物通路，因此，三唑酮可能會對水生動物造成影響，這個影響可能是由于甾醇合成受抑制而導(dǎo)致生物內(nèi)分泌紊亂[8]，進而對脊椎動物和無脊椎動物產(chǎn)生致畸作用。劉少穎[9]發(fā)現(xiàn)在實驗室條件下三唑酮濃度達到2 000 μg·L-1和4 000 μg·L-1時，斑馬魚胚胎出現(xiàn)畸形。三唑酮進入水體后可在非洲爪蟾體內(nèi)累積，干預(yù)神經(jīng)嵴細胞的遷移，致使爪蟾胚胎鰓弓畸變[10]。Kenneke等[11]的21 d慢性毒性研究表明，當三唑酮濃度>50 μg·L-1時可導(dǎo)致大型溞幼溞蛻皮頻率降低。有研究表明，三唑酮可以推遲大型溞的蛻皮時間，并對子代眼部造成畸形[12]。三唑酮可以抑制生物發(fā)育，進而導(dǎo)致生物種群增長受抑制。胡芳華等[13]的研究表明，三唑酮的濃度達到160 μg·L-1時，三唑酮可以影響母溞的產(chǎn)溞數(shù)量，并抑制幼溞的體長。

水環(huán)境中往往含有多種農(nóng)藥，三唑酮可以和其他殺蟲劑產(chǎn)生協(xié)同增效毒性作用。Cedergreen和Streibig[14]的研究表明，很多殺蟲劑和殺菌劑的組合存在明顯的協(xié)同增效作用，其中，大約96%屬于唑類殺菌劑(包括咪唑、吡唑和三唑類)和神經(jīng)毒劑殺蟲劑的組合。Bjergager等[15]通過聯(lián)合使用咪酰胺和高效氯氰菊酯，發(fā)現(xiàn)該協(xié)同增效作用在浮游動物群落水平上同樣存在。淡水浮游動物在水生態(tài)系統(tǒng)中起著承上啟下的作用，受到影響后會影響其他水生動物。

因此，研究三唑酮在水環(huán)境中的生態(tài)毒性十分必要。目前，三唑酮的研究主要是其對動物個體的影響，對動物的群落效應(yīng)研究不多。本文利用標準微宇宙進行試驗，評定三唑酮對淡水浮游動物種群的生態(tài)風(fēng)險。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 微宇宙試驗系統(tǒng)構(gòu)建

室內(nèi)微宇宙系統(tǒng)在投藥前14 d(記為-14 d)開始裝配，依次加入4種淡水藻類(購自中國科學(xué)院水生生物研究所)和8種浮游動物(由浙江大學(xué)農(nóng)藥與生態(tài)毒理研究所提供)，生物種類及數(shù)量如表1所示。微宇宙系統(tǒng)靜置孵育4 d后投放農(nóng)藥，投藥當日記為0 d。微宇宙系統(tǒng)構(gòu)建工作流程圖如圖1所示。整個實驗周期，微宇宙系統(tǒng)安置于大型水浴裝置上(圖3(a))。自-14～0 d，為微宇宙系統(tǒng)構(gòu)建平衡期，保持溫度24～26 ℃，光強度3 000 lux，光周期L∶D = 14 h∶10 h。自0 d起，每隔7 d向系統(tǒng)補充藻類(1×103cells·mL-1，1 mL)和浮游動物(輪蟲儲備液1 mL，甲殼綱生物5個成體)。

圖1 微宇宙系統(tǒng)構(gòu)建工作流程圖注：(a)水生微宇宙系統(tǒng)；(b)大型控溫水浴設(shè)備。Fig. 1 Aquatic microcosm system internal structure and establishment flowsheetNote: (a) Aquatic microcosm system; (b) thermostat water bath equipment.

1.2 受試化學(xué)品、濃度設(shè)置及其檢測方式

受試化學(xué)品為三唑酮原藥(純度98.5%，由江蘇劍牌股份有限公司提供)。試驗設(shè)置6個濃度，依次為0 μg·L-1(ds0)、156 μg·L-1(ds1)、315 μg·L-1(ds2)、625 μg·L-1(ds3)、1 250 μg·L-1(ds4)和2 500 μg·L-1(ds5)，每個暴露濃度重復(fù)3次。在投藥后2 h采集所有處理組的水樣，在投藥后1、3、5、7、10、14、21、28和35 d采集最高濃度處理組的水樣，檢測三唑酮在水中的殘留量。

所有水樣通過有機溶劑萃取，采用氣相色譜法檢測其濃度，色譜條件為：Agilent 6 890氣相色譜儀，HP-5色譜柱，ECD檢測器，進樣口溫度240 ℃，檢測器溫度250 ℃，柱溫初始溫度70 ℃，進樣體積1 μL，載氣為高純氮(99.999%)，恒壓180 kPa，梯度升溫程序為柱溫70 ℃保持2 min，15 ℃·min-1升至190 ℃保持1 min，5 ℃·min-1升至240 ℃。進樣模式為不分流進樣。在此檢測條件下，三唑酮的保留時間為9.4 min(圖2)。三唑酮的回收率為93.6% (SD=0.1)。

圖2 三唑酮檢測的氣相色譜圖Fig. 2 Gas chromatography of triadimefon

1.3 水質(zhì)理化參數(shù)測定

水質(zhì)理化指標包括酸堿度(pH)、電導(dǎo)率(EC)、溶解氧濃度(DO)和可溶性有機碳濃度(DOC)。酸堿度和電導(dǎo)率的測定均在每次生物樣品采集前進行。為排除采集水樣對溶解氧濃度的干擾，溶解氧濃度測定在水樣采集前一日完成(即試驗進行的第1、6、13、20、27和34天)，測定2次，分別在光周期開始前(在8:00—9:00內(nèi)完成)，定義為系統(tǒng)中溶解氧濃度最低值(DOd)；暗周期開始前(在22:00—23:00內(nèi)完成)，定義為系統(tǒng)中溶解氧濃度最高值(DOL)。計算得到每日溶氧消耗量(DOδ= DOL-DOd)。溶氧消耗量可以間接表征微宇宙系統(tǒng)整體的代謝情況。可溶性有機碳樣品采集與生物樣品采集同時進行，采集50 mL水樣經(jīng)過0.4 μm水性濾膜過濾，使用CN200TOC-VCPH FA有機碳測定儀檢測水樣中有機碳濃度。

表1 構(gòu)建標準化微宇宙的浮游動物及淡水藻類種類來源Table 1 Freshwater algae source and zooplankton for standardized microcosm

1.4 生物樣品采集與檢測

在0 d投藥前以及投藥后7、14、21、28和35 d采集上覆水，采用0.5 L深水采樣器(圖3(c))采集上覆水樣品。分3次采集水樣，共采集1.5 L上覆水，混勻后保留0.5 L分樣品用于浮游生物鏡檢。向樣品中滴加2 mL魯哥氏液(Lugol’s solution)固定染色，靜置48 h后用虹吸管(管頭包有孔徑為25 μm絹紗)排去上清液，濃縮至20 mL左右，用10%甲醛溶液定容至30 mL。濃縮樣品裝入棕色塑料樣品瓶，4 ℃冷藏待鏡檢。體視鏡下采用5 mL和0.1 mL生物技術(shù)框(圖3(b))鏡檢計數(shù)浮游動物。

圖3 自制的微宇宙系統(tǒng)設(shè)備注：(a)大型控溫水浴設(shè)備；(b)浮游生物計數(shù)板；(c)深水采樣器。Fig. 3 Microcosmic test equipmentNote: (a) thermostat water bath equipment; (b) plankton counting chamber; (c) water sampler.

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0對水質(zhì)參數(shù)、浮游動物數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計分析。對浮游動物群落結(jié)構(gòu)變化采用Canoco?5.0軟件分析，分析內(nèi)容包括(1)對微宇宙系統(tǒng)內(nèi)的浮游動物組成進行主成分分析PCA[16-18]，獲得浮游動物在微宇宙內(nèi)的第一排序軸取值(CaseRZ.)；(2)對0～35 d內(nèi)浮游動物豐度的變化進行主效應(yīng)曲線分析PRC[19-22]，并進行蒙特卡洛置換檢驗(Monte Carlo permutation test)，隨機置換599次，置信限為95%，以驗證標準化微宇宙中浮游動物隨時間變化的顯著性。浮游動物種群的最大無作用劑量(NOECspecies)的計算方法為通過方差分析得到與對照組差異不顯著的最大濃度；浮游動物群落的最大無作用劑量(NOECcommunity)的計算方法為：按照PCA分析得到2個獨立的統(tǒng)計變量CaseR1.和CaseR2.，將三唑酮濃度和取樣時間設(shè)為自變量，各處理組及不同采樣日樣品的CaseR1.和CaseR2.設(shè)為因變量，取每個取樣樣品與對照組在95%置信限水平下無顯著性差異的最高濃度。

2 結(jié)果(Results)

2.1 三唑酮在水體中的濃度變化

投藥后2 h水中三唑酮濃度的分析結(jié)果顯示，三唑酮實際暴露濃度為名義濃度的65.3%～86.1%(表2)。最高濃度處理組的三唑酮消解動態(tài)結(jié)果如圖4所示。三唑酮的消解動力學(xué)方程為cDT= 2705.5e-0.12t，cDT為時間為t時的三唑酮濃度，t為時間，R2= 0.9782，半衰期DT1/2為8.28 d。

表2 三唑酮處理組的理論和實際濃度Table 2 Nominal and actual concentrations of triadimefon treatment

圖4 三唑酮在標準化微宇宙上覆水中的消解動力學(xué)曲線注：cDT為時間為t時的三唑酮濃度，t為時間。Fig. 4 Kinetics curve of triadimefon in standardized aquatic microcosm overlying waterNote: When the time is t, the concentration of triadimefon is cDT.

2.2 三唑酮對水質(zhì)參數(shù)的影響

在試驗周期內(nèi)測定了所有微宇宙系統(tǒng)的光周期和暗周期的溶解氧濃度，并在根據(jù)溶氧檢測數(shù)據(jù)計算微宇宙系統(tǒng)中暗周期溶解氧消耗量(DOc)。三唑酮處理組的DOc變化趨勢與對照組一致(P>0.05，Duncan test)。各個微宇宙系統(tǒng)的pH值始終在7.08～7.65，保持中性。方差分析顯示，各系統(tǒng)酸堿度在處理組和時間上沒有顯著性差異(P>0.05，Duncan test)。各個微宇宙系統(tǒng)的電導(dǎo)率(EC)在694～794 μS·cm-1范圍內(nèi)無顯著性差異(P>0.05，Duncan test)。各微宇宙系統(tǒng)的可溶性有機碳濃度(DOC)范圍在39.40～44.09 mg·L-1，方差分析顯示無顯著性差異(P>0.05，Duncan test)。由此判斷三唑酮在(119.06 ± 11.16)～(2 078.88 ± 153.18) μg·L-1濃度下對標準微宇宙系統(tǒng)水質(zhì)指標沒有影響。

2.3 三唑酮對單物種豐度的影響

試驗開始(0 d)時，各微宇宙系統(tǒng)間8種浮游動物數(shù)量無顯著性差異，平均豐度分別為：無節(jié)幼蟲(327 ± 126.4) ind·L-1、鋸緣真劍水蚤(107 ± 41.4) ind·L-1、中華薄殼介(5 ± 2.9) ind·L-1、隆線溞(10 ± 7.2) ind·L-1、低額溞(7 ± 3.2) ind·L-1、平突船卵溞(10 ± 6.0) ind·L-1、盤腸溞(9 ± 5.7) ind·L-1、萼花臂尾輪蟲(45 ± 32.2) ind·L-1和單趾輪蟲(52 ± 25.5) ind·L-1。隨著暴露時間的延長，三唑酮對枝角類生物的影響比較明顯，三唑酮處理組中的枝角類生物豐度大多低于同期對照組(表3)，當三唑酮濃度>104.97 μg·L-1(實際暴露濃度，下同)，在7～21 d時，處理組枝角類生物豐度與對照組差異顯著。

表3 三唑酮對枝角類豐度的影響Table 3 Effects of triadimefon on Cladocerans secies abundance

2.4 三唑酮對浮游動物種群的影響

對照組和各三唑酮處理組中浮游動物組成變化經(jīng)PRC分析的結(jié)果如圖5所示。置換檢驗結(jié)果表明，三唑酮處理組中浮游動物組成隨時間變化達到顯著水平(Pseudo-F = 12.9，P= 0.002)。圖5中Resp.1反映的是不同物種對三唑酮的敏感性差異。本研究中浮游生物對三唑酮的敏感性依次為：盤腸溞>平突船卵溞>隆線溞>萼花臂尾輪蟲>低額溞≥鋸緣真劍水蚤≥無節(jié)幼蟲≥單趾輪蟲≥中華薄殼介。三唑酮處理對單趾輪蟲以及介蟲沒有明顯的作用(Resp.1接近0)；鋸緣真劍水蚤與其無節(jié)幼蟲受到三唑酮輕微的影響；三唑酮對枝角類生物具有顯著的負效應(yīng)(Resp.1為1～4.8)。

圖5 三唑酮對浮游動物組成結(jié)構(gòu)的影響注：圖例中的濃度值為三唑酮理論濃度/實際濃度。Fig. 5 Effects of triadimefon on zooplankton assemblageNote: The concentration is theoretical concentration/actual concentration in legend.

筆者研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮對室內(nèi)標準微宇宙試驗的浮游動物群落沒有出現(xiàn)崩潰式的影響[23]。三唑酮暴露下的浮游動物群落演替過程可分為：演替前期(表現(xiàn)農(nóng)藥直接效應(yīng))、演替后期(表現(xiàn)農(nóng)藥間接效應(yīng))和平衡期[24]。在試驗初期(即0～7 d)三唑酮對枝角類生物產(chǎn)生明顯的負效應(yīng)，對橈足類生物則產(chǎn)生輕微的負效應(yīng)。三唑酮對浮游動物群落的影響逐漸減小。試驗開始14 d后，三唑酮對浮游動物群落的影響不明顯。在試驗21 d后除了最高濃度處理組，其余的處理組生物豐度有顯著的回升。

三唑酮對整個室內(nèi)微宇宙的顯著效應(yīng)主要在試驗初期，在該時間段三唑酮對隆線溞的NOEC為537.98 μg·L-1(實際濃度，下同)；對低額溞、平突船卵溞和盤腸溞的NOEC均為1 042.97 μg·L-1。其他階段，三唑酮對其他生物的NOEC均>2 078.88 μg·L-1。經(jīng)過PCA分析得到統(tǒng)計變量CaseR1.和CaseR2.。CaseR1.體現(xiàn)了輪蟲物種豐度信息，CaseR2.主要體現(xiàn)了三唑酮對其他甲殼類浮游生物的影響。兩者所代表的生物變量組成接近，對變量總體的解釋能力分布為30.87%和20.02%。各物種對CaseR1.和CaseR2.排序軸的貢獻度如表4所示。對CaseR1.和CaseR2.進行方差分析，結(jié)果表明，在浮游動物水平上三唑酮僅在試驗早期7 d內(nèi)有明顯作用，其NOECcommunity為537.98 μg·L-1，對三唑酮處理組浮游動物主成分分析如圖6所示。三唑酮整個試驗周期NOECcommunity>2 078.88 μg·L-1(表5)

圖6 三唑酮處理組中浮游動物組成結(jié)構(gòu)主成分分析注：(a)和(b)象限內(nèi)物種種群數(shù)量與三唑酮濃度呈正相關(guān)；(c)和(d)象限內(nèi)的呈負相關(guān)。Fig. 6 Principal component analysis of triadimefon treated zooplankton communityNote: Species in (a) and (b) quadrants are positive correlation with concentration of triadimefon, and those in (c) and (d) quadrants are negative correlation.

3 討論(Discussion)

三唑酮對微宇宙系統(tǒng)的直接效應(yīng)主要表現(xiàn)在施藥后的0～7 d。從PRC圖分析可以看出，浮游動物對三唑酮的敏感程度排序主要是枝角類>橈足類≥輪蟲類≥介形蟲。其中，枝角類為最敏感的動物，這與Yin等[25]對咯菌腈暴露的室外微宇宙研究的結(jié)果類似。三唑酮對整個室內(nèi)微宇宙的顯著效應(yīng)主要在試驗初期(即0～7 d)，在該時間段三唑酮對隆線溞的NOEC為537.98 μg·L-1(實際濃度，下同)；對低額溞、平突船卵溞和盤腸溞的NOEC均為1 042.97 μg·L-1。其他階段三唑酮對其他生物的NOEC均>2 078.88 μg·L-1。方差分析表明，三唑酮僅在試驗早期7 d內(nèi)對微宇宙系統(tǒng)的生物群落有明顯作用，其NOECcommunity為537.98 μg·L-1，這個值與三唑酮對大型溞的NOEC值相同，表明三唑酮對微宇宙系統(tǒng)的NOECcommunity與系統(tǒng)內(nèi)最敏感浮游動物的NOECspecies有關(guān)。其余時間段三唑酮對微宇宙試驗系統(tǒng)的NOECcommunity均>2 078.88 μg·L-1。根據(jù)文獻報道，在三唑酮使用期間，稻田附近溝渠水三唑酮濃度為12 μg·L-1，這個值低于本實驗三唑酮暴露初期的NOECcommunity(即537.98 μg·L-1)。因此，三唑酮對浮游動物群落產(chǎn)生的生態(tài)效應(yīng)很小。

表4 三唑酮處理組浮游動物對主成分排序軸的貢獻度及相關(guān)性Table 4 Species contribution and correlation for PCA axis in triadimefon treatment

表5 三唑酮對浮游動物物種及其群落的最大無作用濃度(NOEC)Table 5 The no observed effect concentration (NOEC) of triadimefon to zooplankton species and its community (μg·L-1)

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