三唑酮降解菌SM3的降解特性及其應(yīng)用研究

趙素霞，史森磊，胡 芃，王 瑩，林鳳翔，岳星雨，施艷紅

三唑酮降解菌SM3的降解特性及其應(yīng)用研究

趙素霞，史森磊，胡 芃，王 瑩，林鳳翔，岳星雨，施艷紅*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，合肥 230036)

以課題組前期篩選到的1株三唑酮高效降解菌SM3為研究對(duì)象，對(duì)其降解特性、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用潛力進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明：在純培養(yǎng)條件下，溫度30 ℃、pH 7.0、接菌量5%、鹽濃度10 g·L-1及葡萄糖含量1%為高效降解菌株SM3最適培養(yǎng)條件；通過(guò)對(duì)降解酶定位發(fā)現(xiàn)，降解三唑酮關(guān)鍵酶為胞內(nèi)酶，且酶促降解最適pH為7.0，最適溫度為30 ℃；室內(nèi)模擬三唑酮污染土壤分別設(shè)置了0.4、2和5 mg·kg-13個(gè)濃度，同時(shí)添加菌劑，于1、5、10、15、20和25 d后取樣測(cè)定土壤中的三唑酮含量。25 d后，3個(gè)濃度污染土壤中三唑酮降解率分別達(dá)到99.7%，79.1%和58.1%，降解過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。結(jié)果可為三唑類(lèi)殺菌劑三唑酮的生物降解和環(huán)境治理提供優(yōu)良的菌株資源。

三唑酮；降解菌；酶學(xué)性質(zhì)；一級(jí)動(dòng)力學(xué)

三唑酮（Triadimefon）殺菌劑由于其廣譜活性高、殺菌速度快，作用持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。但隨著不合理施藥量和施藥次數(shù)，大量殘留的三唑酮會(huì)進(jìn)入水體和土壤環(huán)境，對(duì)水體和土壤環(huán)境造成污染[1]。有研究者在九龍江、太湖和白洋湖水體中均檢測(cè)到三唑酮，其中最高檢出濃度為12 μg·L-1[2-5]；Han等[6]也在堅(jiān)果種植土壤檢出三唑酮，最高檢出濃度為193.7 μg·kg-1。殘留在水體和土壤環(huán)境中的三唑酮通過(guò)生物富集的方式對(duì)生物體產(chǎn)生毒性，進(jìn)而影響人類(lèi)的健康。根據(jù)以往研究發(fā)現(xiàn)，三唑酮對(duì)哺乳胚胎產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致胚胎畸形[7-10]；還可誘導(dǎo)嚙齒動(dòng)物的腫瘤發(fā)生[11]；在成年青鳉魚(yú)中，三唑酮增強(qiáng)了與腫瘤發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞色素P450酶活性[12]，被歸類(lèi)為“可能的人類(lèi)致癌物”。且環(huán)境中的三唑酮主要通過(guò)水解和光解進(jìn)行降解，降解過(guò)程受外部環(huán)境影響較大，降解效果不理想，不能解決其帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題，因此需要找到合理有效的方法去除或減少三唑酮在環(huán)境中的殘留。

微生物修復(fù)因具有成本低、效率高、無(wú)二次污染、易操作等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已成為環(huán)境污染治理的研究熱點(diǎn)。目前已有較多文獻(xiàn)報(bào)道分離篩選出對(duì)農(nóng)藥有降解作用的菌株，并對(duì)其降解特性及相關(guān)機(jī)理進(jìn)行研究[13-15]。菌株降解農(nóng)藥主要是酶促反應(yīng)過(guò)程，且降解目標(biāo)污染物的種類(lèi)不同，降解酶在微生物細(xì)胞中分布的位置也會(huì)不同[16-17]。且隨著微生物研究的日趨深入，降解農(nóng)藥的微生物種類(lèi)不斷被發(fā)現(xiàn)，降解效果穩(wěn)定提高，一些微生物已被應(yīng)用于土壤污染修復(fù)中[18-19]。國(guó)內(nèi)外對(duì)農(nóng)藥的微生物降解進(jìn)行了較為廣泛的研究，降解農(nóng)藥的類(lèi)型多集中在除草劑、殺蟲(chóng)劑，殺菌劑的微生物降解報(bào)道較少[20]，鮮見(jiàn)關(guān)于三唑酮微生物降解的報(bào)道。

本研究以課題組前期篩選到的1株三唑酮高效降解菌SM3為對(duì)象，在實(shí)驗(yàn)室模擬條件下研究各種環(huán)境因子對(duì)三唑酮降解特性的影響，并在此基礎(chǔ)上對(duì)菌株SM3降解酶的進(jìn)行定位和酶學(xué)性質(zhì)研究，進(jìn)而將菌株SM3應(yīng)用于修復(fù)三唑酮污染土壤中，分析三唑酮在土壤中的降解動(dòng)態(tài)，確定其對(duì)三唑酮的降解效果，為進(jìn)一步利用微生物降解三唑酮污染的環(huán)境提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 課題組保藏的前期分離篩選獲得的一株三唑酮高效降解菌株，經(jīng)鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌（），命名為SM3。

1.1.2 土壤來(lái)源 采自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)萃園0～15 cm的新鮮表層土壤，過(guò)2 mm篩，去除石子、草根等雜質(zhì)備用。

1.1.3 主要儀器及試劑 儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀（北京京科瑞達(dá)科技有限公司）；HC-3018高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）； Waters ACQUITY UPLCTM超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（沃特世科技有限公司）；JYD-1200超聲波細(xì)胞破碎儀（上海之信儀器有限公司）。

試劑：三唑酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98.7%）購(gòu)于 Cayman Chemical Company；甲酸（色譜級(jí)）、乙腈（色譜級(jí)）購(gòu)于Fisher Scientific。

1.1.4 培養(yǎng)基的配制 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（g·L-1）：硝酸銨 1.0，磷酸二氫鉀 0.5，磷酸氫二鉀 1.5，氯化鈉 1.0，七水合硫酸鎂0.2，調(diào)節(jié)pH 7.2±0.1；LB培養(yǎng)基（g·L-1）：酵母粉5，胰蛋白胨10，氯化鈉10，調(diào)節(jié)pH 7.2±0.1；若配制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。所有器皿與培養(yǎng)基均于120 ℃下高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 將冷凍保藏的菌種在生化培養(yǎng)箱中活化6 h，移取菌液LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，挑取表面的單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌液離心后取沉淀洗滌渦旋，重復(fù)離心3次制成菌懸液，待降解實(shí)驗(yàn)時(shí)使用。

1.2.2 菌株SM3的降解特性 初始培養(yǎng)條件為：將5%菌懸液接入無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（三唑酮濃度10 mg·L-1、葡萄糖含量為0.5%、鹽濃度為10 g·L-1、pH為7.0）中，置于30 °C，轉(zhuǎn)速170 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)72 h，取樣測(cè)定三唑酮?dú)埩袅?，并?jì)算三唑酮降解率。以未接種菌懸液的樣品作為空白對(duì)照，每組處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。依次改變以下單一條件，研究不同單因素對(duì)菌株SM3降解的影響。

（1）培養(yǎng)溫度（℃）：10、20、30、40和50；

（2）初始pH：4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0；

（3）接菌量（%）：1、3、5、7和10；

（4）鹽濃度（g·L-1）：0、10、20、30、40和50；

（5）葡萄糖含量（%）：0、1、1.5、2和2.5。

1.2.3 菌株SM3粗酶液的制備 參考降解菌不同細(xì)胞組分分離方法[21]，將菌液離心取上清液鹽析過(guò)夜，溶液再次離心收集沉淀，用緩沖溶液溶解，透析至無(wú)SO42-，收集透析液即為胞外酶；用傳統(tǒng)的滲透休克法[22]將下層菌體溶于蔗糖溶液中，振蕩后置于低滲溶液中冰浴，釋放周質(zhì)蛋白，離心取上清液即為細(xì)胞周質(zhì)酶；將下層菌體和緩沖液按1∶3（g·mL-1）的比例制成菌懸液，于冰浴中超聲破碎，離心取上清液即為胞內(nèi)酶。

1.2.4 菌株SM3降解酶定位 將3種粗酶液分別加入三唑酮濃度為10 mg·L-1無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行，并以不加酶液為空白對(duì)照組，每隔一定的培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行取樣，測(cè)定降解酶在細(xì)胞中的分布情況。

1.2.5 降解酶酶學(xué)性質(zhì)研究 （1）粗酶液添加量對(duì)酶活的影響：分別取粗酶液0.25～1.5 mL，加入無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中（三唑酮濃度10 mg·L-1），使最終測(cè)定酶活體系為5 mL，測(cè)定不同粗酶液添加量對(duì)酶活的影響，以未添加酶液的處理作為對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)條件下，1 mL酶液1 h降解1 mg三唑酮定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

（2）最適pH：在pH 4.0～10.0 下測(cè)定酶活力，其中酶解溫度是30 ℃、三唑酮濃度為10 mg·L-1，以最高酶活力為 100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，確定粗酶液的最適pH值。

（3）最適溫度：在溫度10～50 ℃下測(cè)定酶活力，其中三唑酮濃度為10 mg·L-1、pH 7.0，以最高酶活力為 100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，確定粗酶液的最適溫度；

（4）金屬離子對(duì)酶活的影響：在粗酶液中加入金屬離子Fe2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+，使各反應(yīng)體系中金屬離子的濃度分別為1.0、5.0 和10.0 mmol·L-1，以未加金屬離子體系的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力，確定金屬離子及其濃度對(duì)粗酶液酶活力的影響。

（5）降解酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定：配制4～50 mg·L-1之間8個(gè)三唑酮濃度，在pH 7.0，溫度30 ℃條件下將粗酶液與三唑酮反應(yīng)，計(jì)算三唑酮降解速度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，采用Lin-eweaver－Burk法作圖，并計(jì)算出粗酶液對(duì)三唑酮降解的米氏常數(shù)m和最大反應(yīng)速率max。

1.2.6 菌株SM3在污染土壤中的應(yīng)用 向土壤中添加三唑酮溶液，使土壤中三唑酮的終濃度分別達(dá)到0.4、2 和5 mg·kg-1。設(shè)置3組處理，分別為處理組、對(duì)照組和空白土壤。處理組按5%接菌量向土壤中加入新鮮SM3菌懸液（600≈1），對(duì)照組加入同等體積的無(wú)菌生理鹽水，空白土壤為沒(méi)有添加任何三唑酮和降解菌的處理，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。整個(gè)培養(yǎng)周期定期稱重加水，保持含水量為最大田間持水量的60%左右，于1、5、10、15、20和 25 d取樣測(cè)定土壤中三唑酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株SM3的降解特性

2.1.1 溫度對(duì)菌株SM3降解三唑酮的影響 菌株SM3在10～30 ℃范圍內(nèi)對(duì)三唑酮的降解如圖1（a）所示，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解隨溫度的升高而增大，30 ℃時(shí)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解效果最好，降解率最高達(dá)到66.0%。當(dāng)溫度超過(guò)30 ℃時(shí)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解隨溫度升高而降低，50 ℃時(shí)，降解率僅達(dá)到25.6%，由此可見(jiàn)三唑酮降解的最適溫度為30 ℃。溫度在30～35 ℃之間，降解菌對(duì)目標(biāo)污染物的降解效果較好，且溫度過(guò)低或過(guò)高均影響降解菌的生長(zhǎng)速率，對(duì)降解過(guò)程的酶活性也有影響[23-24]。

2.1.2 pH對(duì)菌株SM3降解三唑酮的影響 菌株SM3在pH 4.0～10.0范圍內(nèi)對(duì)三唑酮的降解如圖1（b）所示，pH值在5.0～8.0范圍內(nèi)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解保持較高的活性，降解率都在55.0%以上，其中當(dāng)pH為7.0時(shí)，對(duì)三唑酮的降解效果最好，降解率最高為68.9%。而當(dāng)pH為4.0和10.0時(shí)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解率分別為34.1%和30.8%，由此可以看出三唑酮降解的最適pH為7.0。大多數(shù)降解菌在接近中性的條件下（pH 6.5～7.5）降解活性較好[25-26]，因?yàn)閺?qiáng)酸或強(qiáng)堿的環(huán)境會(huì)影響降解菌的酶活性，轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和營(yíng)養(yǎng)溶解度[27]，很大程度抑制降解菌的活性。

2.1.3 接菌量對(duì)菌株SM3降解三唑酮的影響 接菌量在1%～10%范圍內(nèi)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解如時(shí)圖1（c）所示，當(dāng)接菌量＜5%，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解隨著接菌量的增多而增大，當(dāng)接菌量為5%時(shí)，菌株SM3對(duì)三唑酮降解活性最大，降解率最高達(dá)到68.0%，而當(dāng)接菌量＞5%時(shí)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解有所下降，可能是因?yàn)榻泳窟^(guò)多，導(dǎo)致培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)消耗過(guò)快不足以支持菌株生長(zhǎng)，菌株開(kāi)始衰亡，由此可見(jiàn)最適接菌量為5%。不同的接菌量影響目標(biāo)物污染物的降解，接菌量較少導(dǎo)致菌株滯后期延長(zhǎng)，對(duì)目標(biāo)污染物降解時(shí)間延長(zhǎng)，當(dāng)接種過(guò)高時(shí)，營(yíng)養(yǎng)消耗過(guò)快不足以支持菌株生長(zhǎng)，菌株衰亡[28]。

2.1.4 鹽濃度對(duì)菌株SM3降解三唑酮的影響 NaCl濃度在0～50 g·L-1范圍內(nèi)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解如圖1（d），當(dāng)NaCl濃度在0～20 g·L-1范圍內(nèi)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解保持較高的活性，其中NaCl濃度為10 g·L-1時(shí)，對(duì)三唑酮的降解能力最強(qiáng)，降解率最高達(dá)到69.6%。當(dāng)NaCl濃度大于10 g·L-1時(shí)，菌株對(duì)三唑酮的降解活性逐漸下降，其中NaCl濃度為50 g·L-1時(shí)，對(duì)三唑酮的降解率僅36.0%，因此菌株SM3在NaCl濃度為10 g·L-1時(shí)，對(duì)三唑酮的降解效果最好。合適的鹽度是菌株正常生長(zhǎng)的條件之一，高鹽度會(huì)使細(xì)胞滲透壓及生物酶活性發(fā)生改變，而滲透壓的改變會(huì)直接影響到菌株的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致菌株的死亡[29]。

2.1.5 葡萄糖含量對(duì)菌株SM3降解三唑酮的影響

初始葡萄糖含量在0%～2.5%范圍內(nèi)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解如圖1（e）所示，初始葡萄糖含量在0%～1%，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解隨葡萄糖含量的增加而增大，當(dāng)葡萄糖含量為1%，對(duì)三唑酮的降解效果最好，降解率最高為70.9%；而當(dāng)初始葡萄糖含量＞1%時(shí)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解逐漸降低，可能是菌株SM3優(yōu)先利用了葡萄糖而對(duì)三唑酮的降解反而降低。綜上，初始葡萄糖含量為1%時(shí)，菌株SM3對(duì)三唑酮的降解效果最好。碳源可以提供微生物生命活動(dòng)所需的能量，而葡萄糖作為微生物生長(zhǎng)可利用的碳源，其合適的含量能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)和代謝，提高微生物對(duì)目標(biāo)污染物降解的能力[30]。

圖1 培養(yǎng)溫度（a）、初始pH（b）、接菌量（c）、鹽濃度（d）及葡萄糖含量（e）對(duì)菌株SM3降解三唑酮的影響

Figure 1 The influence of culture temperature (a), initial pH (b), inoculum amount (c) , salt concentration (d)and glucose content (e) on the degradation of triadimefon by strain SM3

圖2 菌株SM3對(duì)三唑酮的降解

Figure 2 Degradation of triadimefon by strain SM3 under optimum conditions

圖3 菌株SM3不同細(xì)胞組分對(duì)三唑酮的降解

Figure 3 Degradation of triadimefon by different cell components of strain SM3

2.1.6 最適條件下菌株SM3對(duì)三唑酮降解效果

單因素實(shí)驗(yàn)確定最適降解條件為溫度30℃、pH 7.0、接菌量5%、鹽濃度10g·L-1及葡萄糖含量1%，在此條件下菌株SM3對(duì)三唑酮降解測(cè)定結(jié)果如圖2所示，在0～12 h左右，降解菌對(duì)三唑酮的降解速度較為緩慢，說(shuō)明剛接入培養(yǎng)基的降解菌在含有三唑酮的環(huán)境中需要一定的適應(yīng)時(shí)間；在24～96 h范圍內(nèi)降解菌開(kāi)始表現(xiàn)出對(duì)三唑酮的降解作用，72 h時(shí)對(duì)三唑酮的降解率可達(dá)71.4%；96～168 h范圍時(shí)，對(duì)三唑酮的降解趨于平緩，可能培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)消耗過(guò)多不足以支持菌株生長(zhǎng)，菌株開(kāi)始衰亡。

2.2 菌株SM-3降解酶定位

分別測(cè)定菌株SM3不同組分，胞外酶、胞內(nèi)酶和細(xì)胞周質(zhì)酶對(duì)三唑酮降解能力。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明上清液中提取的胞外粗酶液36 h對(duì)三唑酮的降解率為25.46%；利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)處理破碎菌體，離心所得胞內(nèi)粗酶液的酶活性較強(qiáng)，其對(duì)三唑酮降解率可達(dá)62.64%；細(xì)胞周質(zhì)酶活性略微減少，三唑酮降解率為42.44%，由此推斷出降解菌產(chǎn)生降解三唑酮的關(guān)鍵酶是胞內(nèi)酶。

2.3 菌株SM3降解酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 酶濃度對(duì)降解酶活性的影響 粗酶液添加量的不同（即酶濃度不同）對(duì)三唑酮降解酶活力的影響不同，結(jié)果如圖4（a）所示。在0～0.75 mL范圍內(nèi)時(shí)，降解酶活力隨著粗酶液添加量即酶濃度的增大而增加，但增加趨勢(shì)逐漸趨于平緩；而在0.75～1.50 mL范圍內(nèi)時(shí)，降解酶活力基本穩(wěn)定有略下降趨勢(shì)，可能因?yàn)榈孜锓肿优c酶的結(jié)合已趨飽和，因受到底物濃度的限制，再增加酶濃度對(duì)酶活的提高也不明顯，因此0.75 mL為最適粗酶液添加量。

2.3.2 降解酶最適pH 菌株SM3降解酶的最適反應(yīng)pH如圖4（b）所示。在pH 4.0～10.0 范圍內(nèi)，隨著pH的升高，酶活性呈先上升后下降趨勢(shì)。在 pH 4.0～7.0 范圍內(nèi)，pH 值越高，降解酶的酶活就越高：在 pH 7.0～10.0 范圍內(nèi)，pH 值越高，降解酶的酶活就越低；當(dāng)pH為7.0時(shí)，酶活性最高，因此該酶的最適反應(yīng)pH為7.0。降解酶的活性受pH的影響較大，一般pH值在5.5～7.5范圍內(nèi)，降解酶的活性較高[31-32]。pH值過(guò)大或過(guò)小都會(huì)使酶發(fā)生變性，破壞酶的結(jié)構(gòu)，影響了酶的穩(wěn)定性，導(dǎo)致酶活性下降[33]。

(a) 粗酶液添加總量; (b) 最適pH; (c) 最適溫度; (d)不同離子及濃度; (e) 三唑酮降解酶的Linewear-Burk曲線。

Figure 4 Enzymatic properties of degrading enzymes

(a) 三唑酮初始濃度為0.4 mg·kg-1；(b)三唑酮初始濃度為2 mg·kg-1；(c)三唑酮初始濃度為5 mg·kg-1。

Figure 5 Effects of strain SM3 on the degradation of triadimefon in soil.

2.3.3降解酶最適溫度菌株SM3降解酶的最適反應(yīng)溫度圖4（c）所示。當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，該降解酶表現(xiàn)出最強(qiáng)的降解活性，即該胞內(nèi)酶對(duì)三唑酮的最適降解溫度為30 ℃。當(dāng)溫度＜30 ℃時(shí)，該胞內(nèi)酶的酶活隨著溫度的升高而增大。當(dāng)溫度＞30 ℃，隨著溫度升高，該酶液的對(duì)三唑酮的降解活性逐漸降低，甚至當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，相對(duì)酶活僅有10.7%。綜上，該酶的最適酶促反應(yīng)溫度為30 ℃。酶促反應(yīng)的反應(yīng)溫度升高可以增加分子運(yùn)動(dòng)速率，提高酶與底物的接觸頻率從而加快酶促反應(yīng)速率；但溫度過(guò)高也容易使蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)被破壞，增加酶變性失活的概率[34-35]。

2.3.4 金屬離子對(duì)降解酶酶活的影響 由圖4（d）可以看出，不同金屬離子隨著濃度的升高對(duì)三唑酮降解酶的酶活有不同的影響，Ca2+、Mg2+和Mn2+都對(duì)降解酶的酶活有著促進(jìn)作用，且隨著濃度的升高對(duì)酶活的促進(jìn)作用也在加強(qiáng)，3種金屬離子對(duì)三唑酮降解酶的酶活影響無(wú)明顯差別。Fe2+、Cu2+和Zn2+這3種金屬離子對(duì)降解酶的酶活起抑制作用，3種離子對(duì)降解酶的酶活抑制作用稍有不同，其中Cu2+對(duì)降解酶的活性抑制作用最強(qiáng)，Cu2+濃度為10 mmol·L-1時(shí)，降解酶的酶活僅有55.32%，同一濃度下，Zn2+抑制作用稍弱，降解酶的酶活為69.49%，而Fe2+濃度在10 mmol·L-1時(shí)，降解酶的酶活還在75%以上，對(duì)降解酶的酶活抑制作用相對(duì)來(lái)說(shuō)較弱。由此可推測(cè)，金屬離子可能對(duì)酶的空間結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)具有一定的影響，導(dǎo)致其活性發(fā)生改變[36-37]。

2.3.5 三唑酮降解酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)由圖4（e）可以看出，用由 Lineweaver-Burk作圖法繪制的三唑酮降解酶的米氏方程為=49.845+0.738 7，相關(guān)系數(shù)2= 0.998 2，根據(jù)方程可計(jì)算得到三唑酮降解酶的米氏常數(shù)m=67.477 mmol·mL-1，最大反應(yīng)速率max=1.3537 mmol·h-1，這兩個(gè)動(dòng)力學(xué)常數(shù)是反映了此降解酶在以三唑酮為反應(yīng)底物時(shí)的酶學(xué)性質(zhì)，是區(qū)別于其他底物的主要特征性常數(shù)。

(a) 三唑酮初始濃度為0.4 mg·kg-1；(b)三唑酮初始濃度為2 mg·kg-1；(c) 三唑酮初始濃度為5 mg·kg-1。

Figure 6 Degradation kinetics of triadimefon in soi

2.4 菌株SM3在污染土壤中的應(yīng)用

2.4.1 菌株SM3對(duì)土壤中三唑酮的降解效果 菌株SM3對(duì)土壤中不同濃度三唑酮的降解效果如圖5所示。由圖5可以看出，當(dāng)三唑酮濃度分別為0.4、2.0和5.0 mg·kg-1，不同濃度三唑酮降解率隨著時(shí)間的增大而增大。25 d后，未添加菌株SM3的土壤中三唑酮的降解率分別達(dá)到68.9%、43.4%和32.1%，可能是因?yàn)橥寥乐斜旧砗械耐林⑸?，?duì)降解三唑酮起到促進(jìn)作用；而添加菌株SM3土壤中三唑酮的降解速率明顯加快，25 d時(shí)三唑酮降解率分別達(dá)到99.7%、79.1%和58.1%。表明菌株SM3可以提高土壤中三唑酮的降解效果，加快降解速率，且三唑酮的添加量越少，其在土壤中越易被降解，殘留期越短，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用藥時(shí)，應(yīng)盡量做到合理施藥，因需施藥，不濫用農(nóng)藥。

2.4.2 菌株SM3對(duì)土壤中三唑酮的降解動(dòng)力學(xué) 對(duì)土壤中三唑酮的降解曲線進(jìn)行動(dòng)力學(xué)擬合，結(jié)果表明不同濃度三唑酮的降解都符合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)，降解動(dòng)態(tài)見(jiàn)圖6。設(shè)定三唑酮的初始濃度分別為0.4、2.0和5.0 mg·kg-1，然而在拌藥平衡過(guò)程中的損失以及殘留的形成，未加菌組24 h后的實(shí)測(cè)濃度分別為0.38、1.90和4.83 mg·kg-1，降解半衰期分別為16.12、33.01和46.21 d；加菌組24 h后的實(shí)測(cè)濃度分別為0.35、1.82和4.69 mg·kg-1，降解半衰期分別為4.72、13.08和21.67 d，與未加菌組相比，三唑酮的降解半衰期分別縮短了70.72%、60.38%和53.11%。結(jié)果說(shuō)明菌株SM3對(duì)土壤中三唑酮的降解有促進(jìn)作用，且土壤中三唑酮的濃度越低，其降解速率越快。

3 結(jié)論

本研究利用單因素實(shí)驗(yàn)，測(cè)定不同條件對(duì)菌株SM3降解三唑酮的影響。結(jié)果表明，對(duì)三唑酮降解的最優(yōu)條件為：溫度為30 ℃、pH值為7.0、接菌量為5%、鹽濃度為10 g·L-1和初始葡萄糖含量為1%，此條件下72 h三唑酮的降解率可達(dá)71.4%。

對(duì)可降解三唑酮的菌株SM3的降解酶進(jìn)行定位分析，發(fā)現(xiàn)其胞內(nèi)酶、細(xì)胞周知酶和胞外酶36 h對(duì)三唑酮的降解率分別可達(dá)到62.64%、42.44%和25.46%，由此推斷菌株SM3降解三唑酮關(guān)鍵酶為胞內(nèi)酶。該酶的最佳作用條件為：粗酶液添加量為0.75 mL、pH值為7，溫度為30 ℃。金屬離子Ca2+、Mg2+和Mn2+對(duì)其酶活有促進(jìn)作用，而Fe2+、Cu2+和Zn2+對(duì)酶活起不同程度的抑制作用，其中Cu2+對(duì)降解酶的活性抑制作用最強(qiáng)。以三唑酮為底物，得到米氏常數(shù)為m=67.477 mmol·mL-1，最大反應(yīng)速率max=1.353 7 mmol·h-1為進(jìn)一步研究三唑酮降解酶的酶學(xué)性質(zhì)提供了理論依據(jù)。

通過(guò)室內(nèi)模擬土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)，初步探究了菌株SM3對(duì)土壤中三唑酮降解的作用。當(dāng)土壤中三唑酮的濃度分別為0.4、2 和5 mg·kg-1時(shí)，添加菌株SM3處理的降解半衰期分別為4.72、13.08 和21.67 d，與未添加菌株SM3的處理相比，三唑酮的降解半衰期分別縮短了70.72%、60.38%和53.11%；且添加菌株SM3處理25 d后降解率分別為99.7%、79.1%和58.1%，而未添加菌株SM3處理的降解率僅達(dá)到為68.9%、43.4%和32.1%，說(shuō)明添加菌株SM3可明顯促進(jìn)三唑酮的降解，縮短其在土壤中的降解半衰期，提高其降解速率，對(duì)三唑酮污染土壤的生物修復(fù)效果顯著。

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Study on the degradation characteristics and application of triadimefon-degrading strain SM3

ZHAO Suxia, SHI Senlei, HU Peng, WANG Ying, LIN Fengxiang, YUE Xingyu, SHI Yanhong

(School of Resources and Environment, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

In this paper, a triadimefon-degrading strain SM3, which was screened by the research group in the early stage, was taken as the research object, and its degradation characteristics, enzymatic properties and application potential were preliminarily studied. The results showed that: under pure culture conditions, the temperature of 30 ℃, pH 7.0, inoculum volume of 5%, salt concentration of 10 g·L-1and glucose content of 1% were the optimal culture conditions for the efficient degrading strain SM3. The key enzymes of triadimefon are intracellular enzymes, and the optimum pH for enzymatic degradation is 7.0 and the optimum temperature is 30 ℃; indoor simulated triadimefon-contaminated soils were set at 0.4, 2 and and 5 mg·kg-1, respectively. After 1, 5, 10, 15, 20 and 25 days, samples were taken to determine the content of triadimefon in the soil. After 25 days, the degradation rates of triadimefon in the contaminated soil with three concentrations reached 99.7%, 79.1% and 58.1%, respectively, and the degradation process conformed to the first-order kinetic equation. This study provides an excellent strain resource for the biodegradation and environmental management of triazole fungicides triadimefon.

triadimefon; degrading bacteria; degradation enzymatic properties; first order kinetic

X592

A

1672-352X (2023)02-0275-08

2022-05-01

國(guó)家自然科學(xué)基金（31972981）和校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（X202210364226）共同資助。

趙素霞，碩士研究生。E-mail：zsx2467595818@163.com

通信作者:施艷紅，博士，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：shiyh@ahau.edu.cn

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230509.003

2023-05-09 13:57:50

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20230509.1017.006.html