東湖F1代BMPR-1B和BMP15基因多態(tài)性與產(chǎn)羔性能關聯(lián)性分析

姚 東，范智偉，王鵬飛, 2，秦帥奇，楊宇航, 2，李 爽，凌英會,2*

東湖F1代和基因多態(tài)性與產(chǎn)羔性能關聯(lián)性分析

姚 東1，范智偉1，王鵬飛1, 2，秦帥奇1，楊宇航1, 2，李 爽1，凌英會1,2*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，合肥 230036；2. 安徽地方畜禽遺傳資源保護與生物育種省級實驗室，合肥 230036)

為探究候選基因、與東弗里生羊♂和湖羊♀的雜交F1代（東湖F1羊）產(chǎn)羔數(shù)間的關聯(lián)性，評估東弗里生羊作為引入品種的經(jīng)濟利用價值，使用PCR-RFLP技術(shù)對東湖F1羊和湖羊的、基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)進行關聯(lián)分析。結(jié)果顯示，東湖F1羊與湖羊群體內(nèi)均未檢測出基因的FecXI突變?；騀ecB突變位點在湖羊群體中檢測出AG、GG兩種基因型，基因頻率分別為0.064和0.936，優(yōu)勢基因型為GG型，等位基因A、G的基因頻率分別為0.032和0.968，優(yōu)勢基因為等位基因G；在東湖F1羊群體中檢測出AA、AG和GG 3種基因型，基因頻率分別為0.146、0.683和0.171，優(yōu)勢基因型為AG型，等位基因A、G的基因頻率分別為0.488和0.512。表明對產(chǎn)羔有利的G等位基因可以通過東弗里生和湖羊雜交遺傳給后代，可作為其分子育種的輔助選擇標記。湖羊AG型與GG型個體產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（＞0.05），東湖F1羊 GG型、AG型個體產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于AA型個體（0.01＜＜0.05），GG型與AG型個體產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著（＞0.05）。結(jié)果表明東湖F1羊產(chǎn)羔數(shù)與基因顯著相關。

東湖F1羊；東弗里生羊；湖羊；產(chǎn)羔數(shù)；基因；基因

近年來我國肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，養(yǎng)殖方式逐漸規(guī)模化、標準化和舍飼化。綿羊性情溫順活動量相對于山羊要小的多，因此更加適合舍飼。其中湖羊是眾多綿羊品種中舍飼化程度較高的。湖羊具有四季發(fā)情多胎多羔、早熟、泌乳性優(yōu)良、生長發(fā)育快、肉質(zhì)性能好、耐高溫高濕等優(yōu)點，是我國太湖地區(qū)終年舍飼的重要綿羊品種，更是舍飼化肉羊生產(chǎn)的不二選擇[1]。湖羊因其出眾的繁殖性能常被作為雜交改良中的母本。東弗里生羊來自荷蘭弗里生省，是世界知名的乳肉兼用型綿羊，該品種體格高大、體型結(jié)構(gòu)均勻、乳房及乳頭結(jié)構(gòu)優(yōu)良[2]。常作為父本參與品種的雜交改良。本試驗以東弗里生羊為父本與純繁湖羊母本進行二元雜交，其后代東湖F1羊體格健壯、被毛白色、尾部細長，保留較多父本東弗里生羊的表型特征。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B（bone morphogenetic protein receptor type 1B,）基因?qū)儆谏L因子β基因家族中的亞家族，其參與卵丘細胞擴展、排卵循環(huán)和骨骼發(fā)育等，其作用能夠影響家畜的繁殖性能[3]。該基因的突變位點最早由Davis等對澳大利亞美利奴Booroola羊常染色體突變位點的研究時發(fā)現(xiàn)，該基因突變能顯著影響綿羊排卵數(shù)與產(chǎn)羔數(shù)，并命名為基因[4-6]?？截悢?shù)的增加對綿羊排卵數(shù)呈加性，對產(chǎn)羔數(shù)也是部分顯性的[4, 7]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（bone morphogenetic protein 15,）是一種轉(zhuǎn)化生長因子，在卵母細胞中特異性表達，并在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[8-10]。通過影響卵母細胞、顆粒細胞的生長分化來影響卵泡的發(fā)育，此外BMP15可與GDF9形成同源或異源二聚體，陸續(xù)激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅱ型受體和Ⅰ型受體，進而使Smad1/5/8通路磷酸化完成其對卵泡發(fā)育或排卵數(shù)的影響[11-13]。諸多研究表明，和基因的突變對綿羊這一物種的產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響，該基因可作為綿羊育種過程中繁殖性能評定的分子標記，在實際生產(chǎn)中具有重要意義。本試驗通過探究東湖F1羊的和基因是否會出現(xiàn)相應突變，并闡明該突變位點與東湖F1羊繁殖性能的關系，以期為東湖F1羊在生產(chǎn)過程中提供具有實際意義的指導。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設計

本試驗以廬江祥瑞養(yǎng)殖有限公司湖羊和東弗里生（♂）×湖羊（♀）F1代為研究對象（試驗期間飼養(yǎng)管理方式不變），選擇懷孕母羊東湖F1羊82只、湖羊69只統(tǒng)計其產(chǎn)羔數(shù)并靜脈采血用于后續(xù)試驗。

1.2 主要試驗試劑

1×TAE電泳緩沖液配制：量取100 mL 50× TAE溶液加入燒杯中，加入4 900 mL三級水攪拌混勻后分裝；1.0%瓊脂糖溶液配制：稱取1.0 g瓊脂糖，緩慢倒入錐形瓶后，向其中加入100 mL 1×TAE電泳緩沖液后放入微波爐加熱至完全溶解；3.0%瓊脂糖溶液配制：稱取3.0 g瓊脂糖倒入錐形瓶后，向其中加入100 mL 1×TAE電泳緩沖液后放入微波爐加熱至完全溶解引物溶解：先將引物管用小離心機離心，使引物粉末集中于底部，防止粉末飛揚，加入適量ddH2O，渦旋震蕩使其充分溶解后置于﹣20℃保存。

1.3 血液基因組DNA提取與檢測

血樣的基因組DNA提取按照TinGen DNA 提取試劑盒使用說明書進行操作，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進行檢測，條帶清晰沒有拖尾說明DNA完整性好。

1.4 BMPR-1B和BMP15基因PCR擴增

本試驗參考Hanrahan[14]和Mulsant[15]等發(fā)表的和上基因各位點的引物序列，引物由華大基因生物技術(shù)有限公司合成。引物信息如表1所示。

表1 兩個基因的對應引物及序列長度

對設計的兩對引物進行PCR退火溫度梯度試驗，尋找出最佳的退火溫度，以期獲得最佳擴增效果。經(jīng)多次試驗后，得到最佳退火溫度，為60 ℃，為60.5 ℃。PCR擴增后，使用1%的瓊脂糖進行凝膠電泳檢測，分析擴增結(jié)果。PCR反應體系(50 μL): ddH2O（21 μL）、DNA模板（2 μL）、2×FasPremix（25 μL）、上下游引物（各1 μL）。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min、34個循環(huán)（95 ℃變性30 s、基因60 ℃退火30 s、基因60.5 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s），72 ℃再延伸10 min。

1.5 PCR-RFLP檢測

使用PCR-RFLP檢測方法對擴增產(chǎn)物檢測是否存在突變位點，基因的FecB突變位點限制性內(nèi)切酶為Ⅱ，基因FecXI突變位點由限制性內(nèi)切酶l。總反應體系25 μL ：ddH2O（19.5 μL ）、10× NE Buffer（2.5 μL ）、PCR產(chǎn)物（2 μL ）、限制性內(nèi)切酶（1 μL），在37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應1 h使用移液槍吸取10 μL 酶切產(chǎn)物，用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。將所有酶切顯示為陽性樣品以及部分陰性樣品送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

用Popgene 32(version 3.2)軟件和PIC-CALC程序?qū)Λ@得的SNP位點分型結(jié)果進行處理，計算其雜合度He、多態(tài)信息含量PIC等。采用SPSS26.0軟件卡方檢驗對目的基因的FecB位點基因型頻率和基因頻率進行差異顯著性檢驗，并進行哈迪-溫伯格平衡檢測，使用SPSS26.0一般線性模型對本研究中的綿羊群體產(chǎn)羔數(shù)與基因型的關聯(lián)性分析，分析模型為:=++e（為產(chǎn)羔數(shù)；為群體平均值；為基因型效應，e為隨機殘差效應）。數(shù)據(jù)和圖表制作使用Excel2010和SPSS26.0進行處理。使用SPSS26.0分析軟件進行方差分析，當＜0.01時，表示差異極顯著；當＜0.05時，表示差異顯著，所有數(shù)據(jù)使用平均值±標準差表示（SD表示）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及目的基因擴增結(jié)果

在完成血液基因組DNA提取后，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果，結(jié)果顯示條帶清晰、明亮且無雜帶與拖帶，然后使用超微量分光光度計檢測其濃度與OD值，均符合要求后可用于進行下一步PCR擴增試驗。隨機抽取兩個候選基因突變位點的5個擴增產(chǎn)物，使用1%的瓊脂糖溶液進行凝膠電泳檢測，目的條帶為154 bp（）、140 bp（BMPR-1B）與試驗結(jié)果一致，條帶比較清晰、非常明亮且無雜帶，表明引物的特異性和程序設定是可行的，檢測結(jié)果明確后可進行下一步PCR-RFLP試驗。

2.2 BMP15基因FecXI突變位點PCR-RFLP檢測

使用限制性內(nèi)切酶l對試驗群體所有湖羊與東湖F1羊、基因擴增產(chǎn)物進行PCR-RFLP酶切試驗，然后用2%的瓊脂糖溶液電泳檢測酶切結(jié)果，結(jié)果如圖1所示。酶切結(jié)果顯示只有一種帶型，即全部為純合野生型。表明FecXI位點在湖羊和東湖F1羊群體中均無多態(tài)性。

M. Marker I；1-3. 湖羊酶切結(jié)果(AA基因型) ；4-7. 東湖F1羊酶切結(jié)果（AA基因型）。

Figure 1 Enzyme digestion results of FecXImutation sites

M. Marker I；1,4,5. GG基因型；2,3. AG基因型。

Figure 2 Enzyme digestion results of FecB mutation site of Hu sheep

M. Marker I；1,4. AA基因型；2,3. AG基因型；5,6. GG基因型。

Figure 3 Enzyme digestion results of FecB mutation site of Donghu F1

2.3 BMPR-1B基因FecB突變位點PCR-RFLP檢測

使用限制性內(nèi)切酶Ⅱ?qū)υ囼炄后w所有湖羊和東湖F1羊基因擴增產(chǎn)物進行PCR-RFLP酶切試驗，然后用2%的瓊脂糖溶液電泳檢測，結(jié)果如圖2和圖3所示。結(jié)果顯示所選湖羊群體只存在兩種帶型，具有兩條帶（110 bp/140 bp）的雜合突變型，即基因型為AG的個體；只含有一條帶（110 bp）的純合突變型，即基因型為GG的個體，表明該突變位點在試驗湖羊群體中具有多態(tài)性；東湖F1羊酶切后代具有3種帶型，只有一條帶的（140 bp）的純合野生型，即基因型為AA的個體；具有兩條帶的（110 bp/140 bp）雜合突變型，即基因型為AG的個體；只含有一條帶（110 bp）的純合突變型，即基因型為GG的個體，表明該突變位點在試驗東湖F1羊群體中具有多態(tài)性。

圖4 FecB突變位點不同基因型測序峰圖

Figure 4 Sequencing peaks of different genotypes at FecB mutation sites

2.4 BMPR-1B基因FecB突變位點測序結(jié)果

湖羊與東湖F1羊基因FecB突變位點PCR-RFLP檢測結(jié)果顯示在該位點存在不同基因型，將所有突變個體測序。測序結(jié)果表明，在湖羊群體中只檢測到雜合突變型與純合突變型，在東湖F1羊群體中除此之外還檢測到純合野生型。測序結(jié)果（圖4）顯示，當基因的編碼區(qū)第746處為A堿基時，即為純合野生型；當同時出現(xiàn)A和G雙峰時，表明發(fā)生了雜合突變；當該位點為G堿基時，表明發(fā)生了純合突變。所以在試驗湖羊群體內(nèi)BMPR-1B基因編碼區(qū)的第746堿基出發(fā)生了A→G的突變，致使249位氨基酸由谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼帷?/p>

2.5 湖羊與東湖F1羊BMPR-1B基因FecB突變位點的多態(tài)性分析

2.5.1 湖羊與東湖F1羊FecB位點基因型頻率與基因頻率 如表2 所示，湖羊群體基因的FecB突變位點存在兩種基因型：雜合突變型（AG，0.064）和純合突變型（GG，0.936），其中純合突變型（GG）占較大比例，為優(yōu)勢基因型；東湖F1羊存在3種基因型，即純合野生型（AA，0.146）、雜合突變型（AG，0.683）和純合突變型（GG，0.171），其中雜合突變型（AG）占較大比例，為優(yōu)勢基因型。湖羊G等位基因的基因頻率為0.968遠大于A等位基因的基因頻率0.032；東湖F1羊的G等位基因的基因頻率0.512高于A等位基因的基因頻率0.488。結(jié)果分析表明，經(jīng)過東弗里生（♂）與湖羊（♀）雜交后，東湖F1羊雜合突變型（AG）個體在群體中的比例提高，同時出現(xiàn)了純合野生型個體（AA）；但對產(chǎn)高性能有提升作用的G等位基因的基因頻率降低，等位基因A與G的基因頻率趨向平衡。

表2 不同品種FecB位點基因型頻率與基因頻率

表3 不同品種FecB位點哈-溫平衡檢測、期望雜合度、觀測雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量

注：HWE為哈迪-溫伯格平衡檢測；2.＜0.25表示低度多態(tài)；0.25＜＜0.5表示重度多態(tài)；＞0.5表示高度多態(tài)。

在對兩品種FecB位點的基因型頻率和基因頻率的基礎上，進一步進行哈迪-溫伯格平衡檢測，同時計算兩個種群的群體期望雜合度（He）、觀察雜合度（Ho）、有效等位基因數(shù)（Ne）以及多態(tài)信息含量，計算結(jié)果見表3。結(jié)果分析表明湖羊與東湖F1羊代觀測雜合圖分別為0.939、0.501；湖羊多態(tài)信息含量=0.060，屬于低度多態(tài)，東湖F1羊多態(tài)信息含量=0.375，但其哈迪-溫伯格平衡檢測=11.021，以達到顯著水平，所以其多態(tài)信息含量無效。

表4 湖羊FecB位點不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)關聯(lián)性分析

2.5.2 產(chǎn)羔數(shù)與基因FecB突變位點關聯(lián)性分析 對湖羊與東湖F1羊產(chǎn)羔數(shù)與FecB突變位點不同基因型進行關聯(lián)性分析，湖羊FecB位點不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關聯(lián)分析結(jié)果（表4）顯示，湖羊群體純合突變型（GG）個體平均產(chǎn)羔數(shù)比雜合突變型（AG）高0.1，但差異不顯著（＞0.05）。

表5 東湖F1羊不同基因型與平均產(chǎn)羔數(shù)關聯(lián)性分析

注：同列肩標不同大寫字母表示差異極顯著（＜0.01）；肩標不同小寫字母表示差異顯著（0.01＜＜0.05）；無標注表示差異不顯著（＞ 0.05）。

東湖F1羊FecB位點不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關聯(lián)分析結(jié)果（表5）顯示，東湖F1羊純合野生型（AA）、雜合突變型（AG）、純合突變型（GG）個體的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.67、2.13和2.25；AG型個體產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于AA型個體（＜0.01），GG型個體產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于AA型個體（＜0.01），AG型個體產(chǎn)羔數(shù)與GG型個體差異不顯著（＞0.05）。

3 討論與結(jié)論

近年來，國內(nèi)外關于綿羊繁殖性能主效基因FecB的研究較多。喇永富發(fā)現(xiàn)湖羊群體中存在BB、B+和++ 3種基因型，基因型頻率分別為0.69、0.28和0.03，優(yōu)勢基因型為純合野生型（BB），優(yōu)勢等位基因為B，存在FecB突變的個體繁殖力顯著高于無FecB突變個體，但純合FecB突變的個體與雜合FecB突變個體繁殖力無顯著差異[15]。孫渭博等在研究中發(fā)現(xiàn)湖羊群體中檢測到B+、BB兩種基因型，優(yōu)勢基因型為純合野生型（BB），優(yōu)勢等位基因為B，在產(chǎn)羔數(shù)方面結(jié)果與喇永富的相同，B+、BB兩種基因型母羊產(chǎn)羔數(shù)無顯著差異（＞0.05）[16]。Davis研究結(jié)果表明在東弗里生羊群體中未檢測到FecB突變，在中國湖羊與小尾寒羊群體中檢測出FecB突變[17]。本試驗通過PCR擴增目的基因、PCR-RFLP酶切以及DNA測序等方法對湖羊與東湖F1羊雜交羊FecB突變位點進行多態(tài)性檢測。試驗結(jié)果表明，湖羊與東湖F1羊FecB基因均存在多態(tài)性。其中湖羊群體中只存在AG（0.064）和GG（0.936）兩種基因型，優(yōu)勢基因型為GG型，等位基因A與G的基因頻率分別為0.032和0.968，優(yōu)勢基因為等位基因G；東湖F1羊群體中存在AA（0.146）、AG（0.683）和GG（0.171）3種基因型，優(yōu)勢基因型為AG型，等位基因A與G的基因頻率分別為0.488和0.512。經(jīng)過東弗里生羊與湖羊雜交后，東湖F1羊群體中出現(xiàn)了純合野生型后代，東湖F1羊相較于湖優(yōu)勢基因型由GG型轉(zhuǎn)變?yōu)锳G型，基因頻率相較于湖羊A與G差別不大。本試驗中湖羊的純合突變基因型占據(jù)絕對優(yōu)勢，眾多研究報道均表明基因FecB突變位點中的等位基因G在綿羊的產(chǎn)羔性能中起著決定性作用。雖然Davis的研究結(jié)果表明東弗里生綿羊群體中不存在FecB突變，但是在東湖F1羊中出現(xiàn)了3種基因型，表明湖羊FecB突變能夠遺傳給其雜交后代。

而在湖羊和東湖F1羊兩個群體中并沒有發(fā)現(xiàn)基因中的FecXI突變位點，PCR-RFLP酶切結(jié)果表明2個群體都只存在純合野生型。在國內(nèi)綿羊品種的研究中柳淑芳等在小尾寒羊的多胎候選基因的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該綿羊群體不存在FecXI突變位點，表明小尾寒羊的多胎遺傳機制與基因突變無關，基因的FecXI突變不能作為小微寒羊的候選基因[18]。在國外綿羊品種的研究中Sara等在Watish綿羊品種的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因FecXI突變位點擴增片段中不存在多態(tài)性，即Watish綿羊的高繁殖力性能與該突變位點無關[19]。Seedy等采用PCR-RFLP技術(shù)對埃及Barki和Rahamni兩個綿羊品種中FecXI突變的遺傳篩選及產(chǎn)羔數(shù)的研究中表明不存在候選基因的突變，并且認為應該對可能影響排卵數(shù)的其他突變或者基因進行進一步研究，以此來確定埃及綿羊品種的遺傳類型和方式[20]。

總體而言，利用東弗里生羊與湖羊雜交后，雜交羊中出現(xiàn)了與產(chǎn)羔性能相關的主效基因FecB，且東湖F1羊中不同基因型間產(chǎn)羔數(shù)差別較大。湖羊與東湖F1羊基因FecXI突變位點均不存在多態(tài)性；兩個群體中基因的FecB位點均有多態(tài)性，產(chǎn)羔數(shù)與基因型的相關性分析結(jié)果表明FecB突變能有效提高產(chǎn)羔率，且優(yōu)勢等位基因G存在加性效應，即G等位基因頻率越高，平均產(chǎn)羔率越多，F(xiàn)ecB突變位點可作為東弗里生與湖羊雜交育種的分子篩選標記。

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Correlation analysis ofandgene polymorphisms and litter size in hybrid F1generation of East Frieslandand Hu sheep

YAO Dong1, FAN Zhiwei1, WANG Pengfei1, 2, QING Shuaiqi1, YANG Yuhang1, 2, LI Shuang1, LING Yinghui1, 2

(1. School of Animal Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;2. Local Animal Genetic Resources Conservation and Biobreeding Laboratory of Anhui Province, Hefei 230036)

In order to explore the correlation between candidate genesandand the litter size of lambs produced in the F1 generation of East Friesland ♂and Hu sheep♀(Donghu F1sheep), and to evaluate the economic utilization value of East Friesland as an introduced breed, PCR-RFLP technique was used to analyze the association betweenandgene polymorphisms and lamb number in Donghu F1and Hu sheep. The results showed that FecXImutation ofgene was not detected in Donghu F1and Hu sheep populations. Two genotypes, AG and GG, were detected in the population of Hu sheep with gene frequencies of 0.064 and 0.936, respectively, and the dominant genotype was GG. The gene frequencies of allele A and G were 0.032 and 0.968, respectively, and the dominant gene was G. Three genotypes, AA, AG and GG, were detected in Donghu F1 population, and the gene frequencies were 0.146, 0.683 and 0.171, respectively. The dominant genotype was AG, and the gene frequencies of allele A and G were 0.488 and 0.512, respectively. The results indicated that the G allele favorable to lambing could be passed on to offspring through the cross between East Friesland and Hu sheep, and could be used as an auxiliary selection marker in molecular breeding. There was no significant difference in litter size between AG and GG of Hu sheep (> 0.05), but the number of litter size of GG and AG of Donghu F1was significantly higher than that of AA (0.01 << 0.05), and there was no significant difference between GG and AG of Donghu F1Sheep(> 0.05). In conclusion, the results showed that the litter size in Donghu F1sheep was significantly correlated with thegene.

Donghu F1; East Friesland; Hu sheep; lambing number;;

S826

A

1672-352X (2023)02-0243-06

2022-04-15

國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CAS38）, 安徽省牛羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（AHNYCYTX）和安徽省肉羊良種聯(lián)合攻關(2021)項目共同資助。

姚 東，碩士研究生。E-mail：yd15655106305@163.com

通信作者:凌英會，博士，教授，博士生導師。E-mail：lingyinghui@ahau.edu.cn

10.13610/j.cnki.1672-352x.20230511.013

2023-05-12 10:08:37

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20230511.1335.026.html