黃星天牛中腸中內切葡聚糖酶的鑒定與酶活性測定

梅慧珍+陳安利+夏定國

摘要：內切葡聚糖酶（Cx）是纖維素酶系中的主要成分，它包含多種同工酶，能夠將可溶性纖維素水解成還原性寡糖。采用 Native-PAGE技術對黃星天牛中腸中Cx進行電泳分離，結合LC-MS/MS技術對黃星天牛中腸中Cx種類進行鑒定，并對其性質進行研究。結果顯示黃星天牛中腸中含有多種Cx，通過結構域分析，確定為GHF5家族蛋白，有共同的保守區(qū)（IIYETFNEPT），Cx最適反應溫度為50 ℃，最適pH值為6.0，且具有較廣的pH值穩(wěn)定范圍，低濃度的Mg2+與Co2+對該酶有激活作用，高濃度的Mg2+與Cu2+對該酶有抑制作用。這一結果可為黃星天牛降解纖維素機制的研究提供理論基礎，為進一步研究天牛中腸組織的生理功能提供基礎信息。

關鍵詞：黃星天牛；中腸；內切葡聚糖酶；鑒定；結構域；保守區(qū)；降解纖維素

中圖分類號： Q556+.2；S433.5 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0165-04

中腸是昆蟲食物消化和營養(yǎng)吸收的主要場所，也是許多外來有害物質如農藥、毒素、病源微生物等的作用靶標[1-6]。研究昆蟲中腸蛋白質的組成和功能，不僅有助于闡明昆蟲中腸對營養(yǎng)物質消化吸收的分子機理，也能進一步認識外源物質與中腸內蛋白質之間的相互作用。

天牛作為植食性昆蟲，植物中的多糖如纖維素、半纖維素的降解是本身的能量來源之一。自1930年Ripper首次報道天牛自身能分泌纖維素酶后[7]，又有一些學者提出天牛自身具有分泌纖維素酶的生化結構基礎[8]。用加入抗菌素的飼料人工飼養(yǎng)天牛，天牛腸道消化液中仍有很高的纖維素酶活性[9]。用等電聚焦電泳分離天牛消化道內切葡聚糖酶（Cx），發(fā)現不同發(fā)育階段和不同蟲態(tài)間的Cx同工酶差異很大，這標志著天牛體內共生微生物分泌Cx和天牛攝入真菌Cx的可能性很小[10]。Cx是纖維素降解過程中的一種重要水解酶。它作用于纖維素分子內部的非結晶區(qū)，隨機水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量帶非還原性末端的小分子纖維素。自Chararas等首次報道從歐洲絞天牛（Ergates faber）中分離純化出內源性纖維素酶以后[11]，其他昆蟲的內源性纖維素酶也相繼得到報道[12-20]。

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）是在不加入十二烷基硫酸鈉（SDS）疏基乙醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于同工酶的鑒定和提純。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持酶等蛋白質生物大分子的生物活性，對于生物大分子的鑒定有重要意義。

本研究基于Native-PAGE技術對黃星天牛中腸中Cx進行電泳分離并采用LC-MS/MS技術對黃星天牛中腸中的Cx進行篩選，同時對黃星天牛中腸中Cx的活性進行初步研究，可為探索黃星天牛消化纖維素的機制提供理論基礎，為進一步認識與研究天牛中腸組織的功能提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃星天牛成蟲收集于中國農業(yè)科學院蠶業(yè)研究所桑園。

1.2 試驗方法

1.2.1 中腸總蛋白的提取

將采集的黃星天牛成蟲置于 -80 ℃ 冰箱中保存過夜，翌日解剖，取出中腸，用ddH2O反復沖洗，至無明顯的內含物，用吸水紙吸干。利用一步法動物組織活性蛋白提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取總蛋白：將組織剪切成小塊，用液氮研磨至粉末狀，加入預冷的抽提試劑（每1 mL抽提試劑加入1 μL DTT、10 μL PMSF、1 μL 蛋白酶抑制劑），渦旋振蕩10 s，冰上放置20 min，期間取出振蕩3～5次，再 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min，上清液作為組織總活性蛋白部分，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫ň唧w試驗方法參照試劑盒說明書）。

1.2.2 Cx分析

參考李慶的方法[10]，制備含有1% CMC、12%凝膠的非變性膠，進行電泳，電泳在低于 8 ℃ 條件下進行。電泳完畢后，將膠剝離，將marker的區(qū)域與蛋白樣品的區(qū)域切割分離，含有marker的膠進行考染，含有蛋白樣品的膠移至pH值為6.0的0.2 mol/L NaH2PO4-NaHPO4緩沖液中，37 ℃水浴保溫10 min，倒去緩沖液，加入2.0% KI+0.2% I2染色液于25 ℃水浴染色5 min，倒去染色液，用自來水沖洗多余染液，加入60% 硫酸處理5～10 min，終止酶活，倒去硫酸，用水沖洗，直至背景膠板上出現透明帶（Cx帶）。

1.2.3 Cx帶的膠回收及質譜分析

將Cx帶的部分切下，用ddH2O將膠中蛋白質條帶脫色到膠體接近無色，室溫、12 000 r/min 條件下離心5 min，去除上清保留膠體，然后用生工生物工程（上海）股份有限公司的PAGE膠蛋白微量回收試劑盒回收膠中的蛋白，所得蛋白溶液委托深圳華大基因科技服務有限公司進行LC-MS/MS分析。

1.2.4 Cx的酶活性測定

采用DNS定糖法測定Cx的活性[21]。取10 μL適當稀釋的粗酶液，加入200 μL 1% 羧甲基纖維素鈉（用0.05 mol/L檸檬酸緩沖液配制，pH值4.8），50 ℃ 反應1 h，加入500 μL DNS試劑，煮沸 6 min，再加入 500 μL 蒸餾水，在540 nm波長下測定吸光度。定義1 min產生1 g葡萄糖所需酶量為1個酶活性單位。

1.2.5 中腸Cx活性的研究

1.2.5.1 最適pH值的測定 分別用pH值為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0的緩沖液配制1%羧甲基纖維素鈉溶液[醋酸緩沖液（pH值2.0），檸檬酸緩沖液（pH值4.0、6.0），Tris-HCl緩沖液（pH值8.0），甘氨酸-氫氧化鈉 （pH值10.0）][18]，作為不同pH值條件下的酶作用底物，加入稀釋后的粗酶液，于50 ℃保溫1 h，測定酶活性，以酶活性最高者為100%，確定最適pH值。

1.2.5.2 最適溫度的測定 用pH值 6.0的檸檬酸緩沖液配制1%羧甲基纖維素鈉溶液，作為底物，加入稀釋后的粗酶液，于不同溫度（30～70 ℃）水浴保溫1 h，測定酶活性，以最大酶活性為100%，確定最適反應溫度。

1.2.4.3 金屬離子對酶活性的影響 分別配制含有濃度為5、100 mmol/L 的CoCl2、MgCl2、CuCl2、CaCl2 的1%羧甲基纖維素鈉溶液，在最適溫度與pH值下保溫1 h，測定酶活性。以不加任何無機鹽的1%羧甲基纖維素鈉溶液作為底物所測出來的值為100%。

2 結果與分析

2.1 Cx檢測結果

Native-PAGE電泳共發(fā)現5條透明度大小不同的Cx帶（圖1），酶帶透明度越大，說明酶活性越大（酶活性由Cx與羧甲基纖維素鈉反應的強度有關）[10]。結果表明，黃星天牛中腸中可能存在多種Cx。Cx的分子大小范圍分布很廣，一般分子量介于23～146 ku之間，當然也有例外，如纖維黏菌內切酶分子量小至6.3 ku[22]。電泳結果顯示，黃星天牛Cx帶的分子量主要分布在35～55 ku與10～15 ku這2個范圍內。

2.2 LC-MS/MS結果分析

本研究委托深圳華大基因科技服務有限公司，利用Triple TOF 5600質譜儀對Native-PAGE電泳所獲得的蛋白樣品進行LC-MS/MS（液相-質譜聯用鑒定蛋白質混合物的技術）分析。通過與NCBI天?？疲–erambycidae）蛋白質數據庫進行比對分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/？term=txid41088），共得到265個蛋白分子（包括重復蛋白質）。其中，與Native-PAGE電泳膠面Cx分子量分布一致的有66個非重復蛋白，分子量分布在35～55 ku之間的蛋白有54個，分子量分布在10～15 ku之間的蛋白有12個，對所得的蛋白進行COG分類發(fā)現，66個蛋白中有27個蛋白具有COG的功能性分類（圖2），其中11個蛋白與代謝有關，如氨基酸（amino acid transport and metabolism）、能源代謝（energy production and conversion）、碳水化合物（Carbohydrate transport and metabolism）、脂質（lipid transport and metabolism）的運輸和新陳代謝。

2.3 黃星天牛中腸中Cx種類的鑒定與分析

通過LC-MS/MS 技術對黃星天牛中腸中Cx的鑒定，結果顯示，黃星天牛有4種非重復的Cx（表1），其蛋白理論分子量分布在36～38 ku之間，等電點在4.3左右。

利用Prosite生物在線軟件（http：//prosite.expasy.org/prosite.html）對Cx的結構域進行分析，結果顯示，這4種Cx均屬于GHF 5家族（圖3），存在共同的保守區(qū)（IIYETFNEPT）。

2.4 Cx的最適pH值與溫度

從圖4-A可以看出，Cx在pH值4～8時，該酶活性在最大酶活性的50%以上，可見Cx具有較廣的pH值穩(wěn)定性，在pH值為6.0時的酶活性最高。這可能是由于pH值改變了酶分子的帶電狀態(tài)，特別是改變了酶活性中心上有關基團的電離狀態(tài)，導致該酶與底物不能很好地結合，從而影響底物被酶水解，最終使酶催化活性有不同程度的下降。圖4-B表明，溫度在30～50 ℃之間時，Cx的酶活性隨著溫度的升高而升高，在50 ℃時達到最大，隨著溫度繼續(xù)上升，酶活性逐漸下降。

2.5 金屬離子對Cx的影響

用5、100 mmol/L Co2+及5 mmol/L Mg2+對Cx進行處理，酶活性最高分別能夠提高31.37%、95.17%、25.24%；Ca2+對酶活性基本無影響；而5、100 mmol/L Cu2+及100 mmol/L Mg2+對酶有抑制作用（圖5）。

3 結論與討論

以木質纖維素為食的昆蟲（如白蟻、甲蟲、蠹蟲、木食性蟑螂以及木蜂等）能非常有效地將食物中的纖維素、半纖維素物質轉化為糖類，并從中獲取自身生長發(fā)育所需的能量[23]，Cx是纖維素降解途徑中的一種重要的酶系。2014年，Pauchet等在日本光肩天牛的中腸中證實了6個分子量皆在35～50 ku的GHF5蛋白中，且他們發(fā)現雄性成蟲中只有4種屬于GHF5的蛋白中，而雌性成蟲中沒有GHF5家族的蛋白[17]。本試驗在黃星天牛中腸中鑒定出4種Cx，均屬于GHF5，這一結果與Pauchet等的結果[17]一致。GHF45作為Cx家族的另一成員，已在很多種類的天牛中發(fā)現，如云斑天牛、桑天牛[16-20]。本試驗在黃星天牛中未鑒定出GHF5家族，這可能與蛋白表達豐度有關[20]。此外，本研究發(fā)現2條分子量低于15 ku的內切酶條帶，迄今為止還未見報道。

對黃星天牛中腸中Cx活性研究表明，無論是最適作用溫度還是最適作用pH值，Cx均顯示出廣泛的適應性。Cx作為纖維素的主要消化酶，廣泛的pH值適應范圍使其能適應食物的不同pH值條件及腸道各部分的內環(huán)境，直接作用于天牛攝入的纖維類物質，并隨食物在腸道內向后移動時持續(xù)發(fā)揮作用[24]。金屬離子對Cx的活性有一定的影響，Co2+及低濃度的Mg2+對Cx都有較強的激活作用，Cu2+及高濃度的Mg2+對酶都有抑制作用。高濃度的Cu2+相比低濃度的Mg2+而言，其抑制作用更強。Cu2+是一些殺蟲劑的重要成分，施用Cu2+試劑如波爾多液等，既可防疾病，又可抑制天牛的消化酶，從而起到控制天牛為害的作用。

本試驗通過對黃星天牛中腸內切酶的研究，不僅可以為黃星天牛降解纖維素機制的研究提供理論基礎，也為以后天牛中腸蛋白質研究提供了重要的數據資料。

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