兩種方法構(gòu)建小鼠過敏性接觸性皮炎的比較研究

朱曉筱，周蘭蘭

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室 安徽 合肥 230022;2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護(hù)學(xué)院，廣東 深圳 518055)

過敏性接觸性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)是由半抗原特異性T細(xì)胞依賴性反應(yīng)介導(dǎo)的皮膚或粘膜接觸某些外部刺激物或過敏原時(shí)發(fā)生的炎癥反應(yīng)[1-2]。當(dāng)機(jī)體受到半抗原攻擊后，主要表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎性因子的釋放，臨床癥狀主要是致敏皮膚周圍出現(xiàn)紅斑、糜爛、結(jié)痂、水腫、瘙癢等[3-5]。ACD反應(yīng)中的T細(xì)胞在移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病、自身免疫和腫瘤免疫中起著關(guān)鍵作用。因此，研究對(duì)ACD的誘導(dǎo)和調(diào)控作用對(duì)于尋找新藥和闡明作用機(jī)制具有重要意義。

良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型有助于人們更方便和更有效地了解人類疾病的發(fā)生及發(fā)展規(guī)律并有利于研究其預(yù)防措施。2，4-二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)誘導(dǎo)的ACD模型是炎癥或慢性瘙癢研究中最常用的動(dòng)物模型之一[6-7]。一個(gè)好的動(dòng)物模型必須具有可準(zhǔn)確復(fù)制且與臨床發(fā)病機(jī)制相似的特點(diǎn)，這對(duì)疾病的發(fā)病機(jī)制和療效的研究具有關(guān)鍵作用。DNFB是一種半抗原，當(dāng)與機(jī)體首次接觸后激活皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞因子。而細(xì)胞因子與抗原呈遞細(xì)胞結(jié)合，轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)，激活抗原特異性的T細(xì)胞，使其產(chǎn)生記憶T細(xì)胞，該過程為敏化過程。在致敏4～7 d后，機(jī)體再次接觸半抗原DNFB后補(bǔ)充和激活記憶T細(xì)胞，通過輔助T細(xì)胞1(Th 1)和輔助T細(xì)胞2(Th 2)產(chǎn)生細(xì)胞因子，誘發(fā)局部接觸性過敏反應(yīng)[8]。該反應(yīng)一般在接觸半抗原后約18 h發(fā)生，并在24～48 h內(nèi)達(dá)到高峰。有文章應(yīng)用2周ACD模型研究Toll樣受體在慢性瘙癢癥中的作用，而也有文章通過使用5周ACD模型研究通過 BRAF信號(hào)通路影響感覺神經(jīng)元慢性瘙癢的發(fā)展[9]。所以有些研究人員考慮到2周的建模周期是否太短而無法產(chǎn)生明顯的癥狀和炎癥變化。為了在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)操作中明確和選擇更適合的動(dòng)物模型而進(jìn)行深步研究，本研究構(gòu)建并評(píng)價(jià)了DNFB致小鼠ACD反應(yīng)的不同建模方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)雄性SPF級(jí) C57 BL/6小鼠，體質(zhì)量約(25±2)g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：(蘇)2016-0010，SCXK。飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食和飲水，環(huán)境溫度(20～25)℃，相對(duì)濕度40%～60%。本研究中描述的所有實(shí)驗(yàn)方案均遵循安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》中概述的方案，符合美國國立衛(wèi)生研究院ARRIVE實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南的指導(dǎo)方針。

1.2 主要藥品試劑及儀器2，4-二硝基氟苯：購自Sigma，BCCB1276。丙酮：合肥欣樂有限公司，190131。橄欖油：上海阿拉丁，K1922143。多聚甲醛：上海阿拉丁，HJ201403。生理鹽水：山東齊魯藥業(yè)有限公司，2B20012105。小鼠(Mouse)免疫球蛋白E(Ig E)ELISA試劑盒：南京建成生物工程研究所，210821M。相機(jī)和三腳架：日本尼康。ASP-300型自動(dòng)脫水機(jī)：德國萊卡。HistoCoreArcadia組織包埋機(jī)：德國萊卡。RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)：德國萊卡。DHG - 9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海三科學(xué)儀器有限公司。Pannoramic MIDI智能組織切片成像分析系統(tǒng)：3D HISTECH。

Fig 1 Protocol for 2-week and 5-week ACD model induction in mice

1.3 2周過敏性接觸性皮炎模型的構(gòu)建與分組DNFB溶解在丙酮：橄欖油(4 ∶1)的混合溶液中；雄性C57 BL/6小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照、溶媒組(丙酮：橄欖油)和DNFB模型組，每組6只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，剔除小鼠頸背部和腹部的毛發(fā)，剃毛面積約為2 cm × 2 cm。適應(yīng)2 d后，將0.5% DNFB-丙酮混合液50 μL均勻涂抹在腹部剃毛區(qū)，進(jìn)行初次致敏，d 2重復(fù)該操作強(qiáng)化致敏。敏化5 d后，將0.15% DNFB 50 μL均勻涂抹在模型組小鼠頸背部剃毛區(qū)，對(duì)照組小鼠和溶媒組小鼠分別涂抹50 μL的生理鹽水和50 μL丙酮-橄欖油混合液。隔1 d給藥1次，重復(fù)4次，即在頸背部開始給藥的d 1，3，5，7均勻涂抹，且每次頸背部涂抹24 h后記錄行為學(xué)視頻60 min。見Fig 1 A。

1.4 5周過敏性接觸性皮炎模型的構(gòu)建與分組將C57 BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、溶媒組(丙酮 ∶橄欖油4 ∶1組)和DNFB模型組，每組5只。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，小鼠腹部和頸背部剃毛，面積2 cm × 2 cm。小鼠剃毛后適應(yīng)兩天開始造模。滴加0.15% DNFB 100 μL于小鼠腹部剃毛處，均勻涂抹敏化。敏化1周后，在模型組小鼠頸背部剃毛區(qū)域涂抹0.15% DNFB 50 μL，每周給藥兩次，持續(xù)4周，共9次，每次頸背部處理24 h后記錄癢覺行為學(xué)視頻，連續(xù)記錄60 min。具體干預(yù)措施見Fig 1 B。

1.5 癢行為學(xué)檢測(cè)使用SONY數(shù)字視頻攝像機(jī)對(duì)癢行為測(cè)試進(jìn)行錄像。在錄像記錄前，將小鼠放置在塑料場(chǎng)地(10 cm×10 cm×13 cm)中至少10 min使其習(xí)慣于記錄條件，塑料小盒上方有通氣孔，盒中放少許墊料，透明塑料盒之間用紙片隔開，避免小鼠相互影響；透明塑料盒使用前清洗并吹干，避免氣味殘留的影響。然后記錄小鼠60 min的自發(fā)性劃痕。視頻在計(jì)算機(jī)上播放以供觀察者評(píng)估，計(jì)數(shù)在60 min內(nèi)觀察到小鼠后肢向著頸背部涂抹區(qū)域的抓撓行為。劃痕定義為在小鼠抬起后爪抓撓到后爪回到地面或嘴巴記為1次。

1.6 皮膚病理組織學(xué)檢測(cè)造模結(jié)束后，取小鼠造模處皮膚，多聚甲醛固定后脫水包埋成蠟塊，切片機(jī)切成5 μm的薄片，分別進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE)和甲苯胺藍(lán)染色(Toluidine blue staining，TB)后，鏡下觀察并拍片。ImageJ測(cè)量表皮厚度(Fig 4箭頭處)和肥大細(xì)胞數(shù)(Fig 5箭頭處)后分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 ELISA檢測(cè)小鼠血清中Ig-E水平造模結(jié)束后，眼球靜脈取血。離心機(jī)設(shè)置3 000 r·min離心30 min后取上清，接下來的具體操作步驟按ELISA試劑盒所附的說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)范圍為7.5～240 μg·L-1最后在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，并拍照記錄后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩種建模周期的小鼠癢行為學(xué)變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 2所示，與空白對(duì)照組相比較，2周ACD模型組小鼠后肢抓撓次數(shù)明顯增多且呈上升趨勢(shì)(P<0.01)；溶媒組小鼠后肢抓撓次數(shù)無明顯增多趨勢(shì)。隨著時(shí)間的推移，2周模型的構(gòu)建周期結(jié)束時(shí)小鼠抓撓次數(shù)達(dá)到最高水平(P<0.01)。5周ACD模型的模型組小鼠后肢抓撓次數(shù)也增多明顯，在5周模型構(gòu)建期結(jié)束時(shí)，模型組的癢行為學(xué)顯著高于對(duì)照組和溶媒組(P<0.01)。

2.2 兩種建模周期的小鼠皮膚病損程度比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 3所示，在兩種建模的過程中，對(duì)照組和溶媒組小鼠頸背部皮膚表面均無明顯變化，且小鼠活動(dòng)性較好。隨著造模過程的進(jìn)行，2周模型小鼠造模部位皮膚逐漸出現(xiàn)紅斑、水腫、潰爛、結(jié)痂。小鼠造模處皮膚在涂抹DNFBd 5已經(jīng)發(fā)生潰爛；頸背部涂抹DNFB d 7潰爛處皮膚結(jié)痂變硬；2周造模結(jié)束時(shí)皮膚呈現(xiàn)結(jié)痂狀態(tài)。

然而，5周模型小鼠的皮膚表面明顯出現(xiàn)紅斑、水腫、潰爛、結(jié)痂、脫痂、再反復(fù)潰爛后結(jié)痂的現(xiàn)象。在小鼠頸背部涂抹DNFB d 8造模處皮膚發(fā)生潰爛；d 11給藥前皮膚已結(jié)痂；d 15給藥前，皮膚結(jié)痂已褪去，暴露痂下皮膚，呈干燥狀；d 18給藥前，造模處皮膚潰爛加重；d 22給藥前，皮膚開始結(jié)痂，且給藥區(qū)域周圍皮膚開始翻起；d 25給藥前，小鼠給藥區(qū)域周圍翻起皮膚開始褪去，且皮膚潰爛；5周模型造模結(jié)束取材時(shí)，頸背部痂脫落暴露出皮膚。

Fig 2 Comparison of scratching behavior changes in two ACD models A：2-week last scratch count;B：2-week itch behavioral trends;C：5-week last scratch count，D：5-week itch behavioral trends.**P<0.01 vs NS group

2.3 HE染色觀察比較皮膚表皮增厚程度如Fig 4所示，2周模型和5周模型的溶媒組和對(duì)照組小鼠造模處皮膚表皮均無明顯增厚，且邊緣清晰。2周模型組小鼠與對(duì)照組小鼠相比，造模處皮膚表皮層明顯增厚(P<0.01)，且炎性浸潤(rùn)、海綿狀變性和真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張；與2周模型結(jié)果相似，5周模型小鼠造模部位皮膚也表現(xiàn)出表皮增厚(P<0.01)、角化過度、海綿樣變性和真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張。

2.4 TB染色觀察比較炎性肥大細(xì)胞浸潤(rùn)程度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 5所示，與對(duì)照組和溶媒組小鼠相比，2周模型組小鼠造模部位皮膚真皮層出現(xiàn)散在的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且肥大細(xì)胞浸潤(rùn)明顯(P<0.01)。同樣，5周模型的結(jié)果與2周模型的結(jié)果相似，造模部位皮膚表皮炎癥浸潤(rùn)明顯(P<0.01)，但浸潤(rùn)程度更為嚴(yán)重。5周造模部位皮膚肥大細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核小，染色淺，位于細(xì)胞中心成堆或單獨(dú)分布，且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿相同大小的藍(lán)紫色顆粒，均勻分布在細(xì)胞核周圍。

2.5 ELISA檢測(cè)比較血清中Ig-E水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 6所示，與對(duì)照組和溶媒組小鼠相比，2周模型組小鼠血清中Ig-E水平明顯升高(P<0.01)。同樣，5周模型的結(jié)果與2周模型的結(jié)果相似，模型組小鼠血清中Ig-E水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。

Fig 4 Comparison of epidermal thickness variationin two ACD models A：2-week NS group;B：2-week vehicle group;C：2-week DNFB group;D：5-week NS group;E：5-week vehicle group;F：5-week DNFB group;G：Statistical analysis of the degree of skin epidermal thickening.**P<0.01 vs NS group

Fig 5 Comparison of inflammatory mast cell changes A：2-week NS group;B：2-week vehicle group;C：2-week DNFB group;D：5-week NS group;E：5-week vehicle group;F：5-week DNFB group;G：Statistical analysis of the mast cell counts results.**P<0.01 vs NS group

Fig 6 Comparison of Ig-E levels in serum in two A：2-week IgE levels in serum;B：5-week Ig-E levels in serum.**P<0.01 vs NS group

3 討論

ACD是一種具有復(fù)發(fā)性、瘙癢性和炎癥性的慢性皮膚病，其發(fā)病率在全世界逐年升高。外源性過敏原的局部致敏是誘發(fā)ACD免疫炎癥的重要基礎(chǔ)，而免疫炎癥反應(yīng)主要以Th 2細(xì)胞分泌IL-4為基礎(chǔ)[4]。通過表皮中的蛋白質(zhì)連接才能構(gòu)成一個(gè)新的抗原決定簇，引起免疫系統(tǒng)激活。DNFB建立的ACD模型是最常用模型之一，DNFB是小分子物質(zhì)半抗原，易與皮膚組織蛋白相結(jié)合，且不顯著改變組織蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，其誘導(dǎo)的ACD模型作為一種免疫和瘙癢模型，在T細(xì)胞炎癥相關(guān)及瘙癢研究中有重要作用[7，10]。然而，ACD不同的建模周期模型往往會(huì)給研究人員帶來選擇上的麻煩，而且其時(shí)間跨度也大不相同。因此，以便更好地選擇合適的動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究和明確不同建模周期的病變特征變得十分重要，特別是對(duì)于藥物治療效果的評(píng)價(jià)。研究采用腹部致敏后頸背激發(fā)的方法建立不同造模周期的小鼠ACD模型，通過檢測(cè)動(dòng)物的瘙癢行為變化，并進(jìn)一步檢查了皮膚組織病理學(xué)變化情況和血清中IgE水平等，以評(píng)估慢性瘙癢和免疫炎癥反應(yīng)的程度。

瘙癢為一種十分不愉快的感覺，會(huì)引起機(jī)體強(qiáng)烈的抓撓欲望[7，11]。通常瘙癢與皮膚疾病有關(guān)，然而它也可能伴隨著各種全身性疾病，包括腎、肝、神經(jīng)、腫瘤或心理源性疾病等[12-13]。因此，合適的瘙癢模型以及增加對(duì)慢性瘙癢神經(jīng)生物學(xué)的了解可能有助于提供新的治療策略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種ACD模型造模周期的小鼠整個(gè)建模過程都伴隨后肢刮擦反應(yīng)。隨著造模的進(jìn)行，瘙癢抓撓次數(shù)均逐漸增多，這表明兩種建模周期都會(huì)引起癢行為發(fā)生顯著變化，且瘙癢發(fā)生迅速。因此，從瘙癢行為的角度來看，建模時(shí)間的長(zhǎng)短可能影響不夠明顯。

在臨床上，特應(yīng)性皮炎患者常有一些特征性的表現(xiàn)，如皮膚干燥、魚鱗病和各種濕疹等。急性濕疹的特點(diǎn)是紅斑丘疹和水皰，瘙癢劇烈，且伴有滲出和結(jié)痂；而亞急性或慢性濕疹為干燥、鱗狀或剝落性紅斑丘疹[14]。我們的研究結(jié)果顯示小鼠瘙癢癥狀為小鼠開始時(shí)抓撓，然后皮炎再造成損害進(jìn)一步加重。即先產(chǎn)生瘙癢，然后再引起皮損，這與ACD的臨床特點(diǎn)是一致的。瘙癢是DNFB誘發(fā)的ACD模型的基本特征，而不是先出疹后再產(chǎn)生瘙癢。且隨著時(shí)間的推移，可能會(huì)出現(xiàn)表皮增厚(苔蘚樣變)和長(zhǎng)期搔抓而引起的皮膚裂痕。ACD小鼠在造模部位的典型癥狀是瘙癢、紅腫、鱗屑和結(jié)痂破損等，尤其是5周模型小鼠反復(fù)出現(xiàn)該癥狀，因此其更嚴(yán)重。這表明兩個(gè)造模周期的皮損均具有典型性，且也符合臨床疾病的特點(diǎn)，因此我們認(rèn)為其均可作為瘙癢和皮炎研究的動(dòng)物模型。

ACD通常被認(rèn)為是由于活化的Th 2、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用而引起的炎癥性皮膚病，其主要機(jī)制為炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)[15]。該研究發(fā)現(xiàn)兩種造模周期的小鼠造模皮膚組織病理學(xué)表現(xiàn)為表皮增厚、炎性浸潤(rùn)、海綿樣變性、真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張和角化過度。結(jié)果表明兩種造模周期都是可行的，但五周模型炎癥損傷更加劇烈。肥大細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，尤其是在Th 2和Ig E介導(dǎo)的急性過敏反應(yīng)中[16-17]。Meixiong等[18]研究表明，肥大細(xì)胞通過Mas相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體b 2受體激活導(dǎo)致ACD相關(guān)的炎癥和瘙癢。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，兩種建模周期小鼠造模皮膚均出現(xiàn)明顯的肥大細(xì)胞浸潤(rùn)。與瘙癢行為和皮膚損傷結(jié)果相同，5周模型小鼠造模皮膚的肥大細(xì)胞數(shù)量明顯高于2周模型小鼠。結(jié)果表明，這兩種建模周期都是可行的，但在5周建模結(jié)束后，炎癥損傷程度和免疫反應(yīng)更加強(qiáng)烈。

綜上所述，DNFB引起ACD模型非常穩(wěn)定，且兩種建模周期都是可行的。2周模型雖然造模周期較短，但癢行為學(xué)、皮膚損傷和免疫炎癥反應(yīng)均出現(xiàn)。而5周模型可能有更典型的癥狀、皮膚受損程度更嚴(yán)重和更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，且有足夠的時(shí)間進(jìn)行藥物觀察研究。本研究為瘙癢和炎癥相關(guān)藥物的研究選擇合適的動(dòng)物模型提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。