毛蕊異黃酮干預(yù)Hippo通路抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖與遷移的機(jī)制

孫騰飛，李俊峰，陶方方，趙俊慧，劉青玲，劉文洪

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

乳腺癌是全球女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在女性腫瘤中居首位，且呈逐年上升趨勢。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是雌激素受體(ER)、孕酮受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER-2)表達(dá)均為陰性的乳腺癌，占所有乳腺癌的15%～20%[1]，常規(guī)乳腺癌的內(nèi)分泌治療如芳香化酶抑制劑和靶向劑療法對該類乳腺癌的療效不佳。與其他乳腺癌亞型相比，TNBC有分化低、增殖快、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、整體生存率較低等特點(diǎn)[2]，在臨床上的治療效果不理想。尋找TNBC的有效治療藥物，一直是乳腺癌基礎(chǔ)研究的一個重要方向。

毛蕊異黃酮(calycosin，CA)是黃芪異黃酮類中的一種主要成分，也是黃芪的重要活性成分之一。CA已被證實(shí)在心血管疾病、腫瘤、細(xì)菌感染、神經(jīng)疾病等方面的治療中顯示出良好的療效[3]。近代藥理學(xué)研究表明，CA對結(jié)腸癌[4]、鼻咽癌[5]、肝癌[6]等腫瘤的增殖、遷移侵襲有顯著的抑制作用，也能促進(jìn)凋亡和影響細(xì)胞周期，但對TNBC相關(guān)作用機(jī)制報道尚少。

Hippo信號通路是調(diào)節(jié)器官大小和維持組織穩(wěn)態(tài)的最重要通路之一，腫瘤疾病中Hippo信號通路往往處于失調(diào)狀態(tài)，能促進(jìn)增殖和引起對化療藥物的抵抗，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其遷移侵襲能力[7]，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。有報道在胃癌細(xì)胞中，高遷移率族盒蛋白9(SOX9)通過激活Hippo信號通路促進(jìn)EMT，引起腫瘤細(xì)胞遷移侵襲，通過調(diào)控Hippo通路，可以抑制增殖、遷移，發(fā)揮抗腫瘤效果[8]。CA是否對TNBC具有相同或者相似的作用機(jī)制，尚未明確。本研究探討了CA對人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移的影響及作用機(jī)制，為CA治療TNBC的臨床應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 試劑胎牛血清(批號42Q8497K)、L-15培養(yǎng)基(批號AG29798283)均購自美國Gibco公司；0.1%胰酶(批號21203504)、青霉素鏈霉素雙抗(批號21203590)均購自Biosharp生物公司；毛蕊異黃酮(批號B20846)、碘化丙啶(批號L12J12G137439)購自上海源葉生物公司；BCA蛋白測定試劑盒(批號122120210621)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol?Plus RNA Purification Kit(批號12183-555)、SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR(批號11752-050)均購自美國Invitrogen公司；RNase-Free DNase Set(批號79254)購自德國Qiagen公司；E-cadherin抗體(批號3195S)、N-cadherin抗體(批號13116S)、vimentin抗體(批號5741S)、NF2抗體(批號6995S)、p-Mst1抗體(批號49332S)、p-Yap抗體(批號13008S)均購自美國CST公司；β-actin抗體(批號BK7018)購自杭州寶科生物科技有限公司；山羊抗兔Ig G H&L(批號ab6721)(購自美國abcam公司)。

1.3 儀器蛋白電泳轉(zhuǎn)印設(shè)備(美國Bio-Rad公司)；CFX384多重實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)；ChemiScope Mini化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞用含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 mg·L-1的L-15培養(yǎng)基，置于37 ℃、100%空氣，無CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長狀況，1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長鋪至底部80%～90%時用0.1%胰酶消化液消化，以1 ∶2比例傳代培養(yǎng)。

1.4.2CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，以0.1%胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，用2×107個·L-1細(xì)胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，各孔200 μL，37 ℃下培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加入藥物，使CA終濃度為12.5、25、50、100、200、400、800 μmol·L-1，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個平行孔。加藥后分別培養(yǎng)24 h，吸去各孔培養(yǎng)液，PBS清洗1次，加入10% CCK-8溶液200 μL，以無細(xì)胞的10% CCK-8溶液為空白組，37 ℃恒溫放置30 min；用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測其吸光值并計算存活率。

細(xì)胞存活率/%=(OD毛蕊異黃酮組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%

1.4.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，用0.1%胰酶消化后制成5×108個·L-1的細(xì)胞懸液種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至70%左右時加入藥物，使CA終濃度為25、50、100 μmol·L-1，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個平行孔。培養(yǎng)24 h，0.1%胰酶消化收集細(xì)胞，1 000 r·min-1離心3 min棄去培養(yǎng)液，PBS洗1次，離心去除PBS，加入4 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定，置于4 ℃環(huán)境，固定24 h。固定結(jié)束后離心棄去固定液，加入3 mL PBS重懸5 min；400目篩網(wǎng)過濾1次，1 000 r·min-1離心5 min，棄去PBS；加入200 μL PI染液，4 ℃避光孵育30 min。最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期情況。

1.4.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞分組及收集方法同“1.4.3”，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。取5×104個重懸的細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，吸去上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，混勻，再加入10 μL碘化丙啶染色液，混勻。室溫避光孵育20 min，隨后置于冰浴中，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.1%胰酶消化后制成5×108個·L-1的細(xì)胞懸液種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)細(xì)胞待長滿板底時，持移液器垂直板底均勻劃痕，倒去培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗去脫落細(xì)胞3次，加入藥物，使CA終濃度為25、50、100 μmol·L-1，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基。在給藥干預(yù)后0、12、24 h于顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞劃痕的愈合情況。不同組細(xì)胞在各時間點(diǎn)的劃痕面積用ImageJ軟件分析，以各組0 h的劃痕面積為基準(zhǔn)，計算劃痕愈合相對面積。

12 h或24 h愈合相對面積=(0 h劃痕面積-12 h或24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積。

1.4.6RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測EMT相關(guān)基因水平 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.1%胰酶消化后制成5×108個·L-1的細(xì)胞懸液種于6孔培養(yǎng)板中，在37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞，待生長至70%左右時，加入藥物，使CA終濃度為25、50、100 μmol·L-1，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基，干預(yù)24 h。干預(yù)后加入TRIzol?Reagent和氯仿處理，提取總RNA，用紫外吸收光法測定RNA濃度。E-cadherin上游引物序列為5′-GATAGAGAACGCATTGCCACATAC-3′，下游為5′-CTCCATTGGATCCTCAACTGCATT-3′；N-cadherin上游引物序列為5′-CCCACAGCTCCACCATATGACTC-3′，下游為5′-CCTGCTCACCACCACTACTTGAG-3′；vimentin上游引物序列為5′-CTGGATTCACTCCCTCTGGTTG-3′，下游為5′-CATCGTGATGCTGAGAAGTTTCGTT-3′，β-actin上游引物序列為5′-GATGACCCAGATCATGTTTGAGAC-3′，下游為5′-GGAGTCCATCACGATGCCAGT-3′；反應(yīng)體系：ddH2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR Green 10 μL，cDNA 1 μL，共20 μL。循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，63 ℃變性25 s，共40個循環(huán)；擴(kuò)增后輸出目的基因以及內(nèi)參基因β-actin的Ct值，以2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量。

1.4.7Western blot實(shí)驗(yàn)檢測EMT與Hippo通路相關(guān)蛋白水平 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.1%胰酶消化后制成5×108個·L-1的細(xì)胞懸液種于6孔培養(yǎng)板中，在37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞，待生長至70%左右時，加入藥物，使CA終濃度為25、50、100 μmol·L-1，對照組加入含有等體積藥物溶媒的培養(yǎng)基，干預(yù)24 h。用含PMSF的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加適量5×上樣緩沖液，100 ℃處理5 min變性。以10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白，電泳完畢后蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，按1 ∶1 000用TBST稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，孵育二抗，TBST洗膜3次，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，采用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白條帶分析。

2 結(jié)果

2.1 CA對MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響與對照組相比，CA明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，且呈劑量相關(guān)性(Fig 1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示，CA作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為363.2 μmol·L-1。為排除細(xì)胞毒性對實(shí)驗(yàn)的影響選用細(xì)胞存活率較高的藥物濃度，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選 取低于IC50值濃度(25、50、100 μmol·L-1)的CA開展。

Fig 1 Effect of calycosin on proliferation of *P<0.05，**P<0.01 vs Control group

2.2 CA對MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響通過細(xì)胞流式法檢測CA對MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響，PI染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測各期細(xì)胞所占百分比，與對照組相比，CA 50、100 μmol·L-1能顯著提高G0/G1期細(xì)胞所占百分比(P<0.01)，阻滯效果呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，表明CA組可能干預(yù)細(xì)胞周期，阻滯于G0/G1期，抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖(見Fig 2)。

Fig 2 Effect of calycosin on cell cycle of **P<0.01 vs Control group

2.3 CA對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Annexin V-FITC/PI染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測顯示，與對照組相比，CA 50、100 μmol·L-1能明顯提高細(xì)胞凋亡率(P<0.01)，且效果呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，表明CA促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，見Fig 3。

2.4 CA對MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測CA對MDA-MB-231細(xì)胞遷移的影響，為避免CA的細(xì)胞增殖抑制作用對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)時培養(yǎng)基的血清濃度為2%。在干預(yù)12 h和24 h時，與對照組相比，CA各濃度均能明顯降低劃痕的相對愈合面積(P<0.05、0.01)，且抑制作用呈現(xiàn)時間、劑量相關(guān)，表明CA能對MDA-MB-231細(xì)胞的遷移能力有抑制作用，見Fig 4。

2.5 CA對MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)基因mRNA與蛋白表達(dá)的影響通過RT-PCR檢測CA

Fig 3 Effect of calycosin on apoptosis of MDA-MB-231 cells **P<0.01 vs Control group

Fig 4 Effect of calycosin on migration of MDA-MB-231 cells *P<0.05，**P<0.01 vs Control group

對MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，CA各濃度均能顯著提高E-cadherin基因mRNA表達(dá)和明顯降低N-cadherin基因mRNA表達(dá)(P<0.01)；CA 100 μmol·L-1明顯下降vimentin基因mRNA表達(dá)(P<0.01)，見Fig 5。

Fig 5 Effect of calycosin on EMT-related mRNA expressions in MDA-MB-231 cells **P<0.01 vs Control group

采用Western blot檢測CA對MDA-MB-231細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，CA各濃度均能顯著提高E-cadherin表達(dá)量(P<0.05、0.01)，CA 50、100 μmol·L-1能明顯下降N-cadherin和vimentin表達(dá)量(P<0.01)，且均呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，見Fig 6。

Fig 6 Effect of calycosin on EMT-related proteins expressions in MDA-MB-231 cells *P<0.05，**P<0.01 vs Control group

RT-PCR與Western blot結(jié)果均顯示CA能明顯調(diào)控與EMT相關(guān)基因蛋白表達(dá)，表明CA可能通過抑制MDA-MB-231細(xì)胞的EMT實(shí)現(xiàn)其藥效作用。

2.6 CA對MDA-MB-231細(xì)胞Hippo信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響通過Western blot檢測CA對MDA-MB-231細(xì)胞Hippo信號通路相關(guān)蛋白NF2、p-Mst1、p-Yap表達(dá)的影響，與對照組相比，CA各濃度均能明顯提高p-Mst1、p-Yap和NF2表達(dá)量(P<0.05、0.01)，且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。表明CA能夠抑制Hippo信號通路的激活，見Fig 7。

Fig 7 Effect of calycosin on Hippo signaling pathway protein expressions in MDA-MB-231 cells *P<0.05，**P<0.01 vs Control group

3 討論

乳腺癌在中醫(yī)屬于“積聚”，“陰毒”等范疇，黃芪具有升陽補(bǔ)氣，補(bǔ)益扶正等功效，契合乳腺癌病理病機(jī)。CA作為黃芪中一種主要活性成分，在多種腫瘤的治療中表現(xiàn)出較好的療效。故本研究圍繞CA對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制作用，探討其作用機(jī)制。有報道表明，CA阻滯胃腺癌AGS細(xì)胞于G0/G1期，提高了細(xì)胞凋亡率，抑制細(xì)胞增殖[9]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CA在TNBC細(xì)胞中展現(xiàn)出同樣的效果，但其具體機(jī)制尚不明確。

遷移是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移惡化的主要原因。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CA可抑制EMT途徑抑制細(xì)胞遷移能力。EMT表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去連接和極性的過程，并出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞易遷移的特征，在腫瘤中會造成腫瘤細(xì)胞間黏附力的喪失，進(jìn)而引起遷移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10]。E-cadherin是細(xì)胞黏附的關(guān)鍵蛋白之一，用以維持細(xì)胞上皮表型和組織穩(wěn)態(tài)，在腫瘤中其表達(dá)的缺失被認(rèn)為是EMT發(fā)生的主要標(biāo)志，往往會引起腫瘤組織局部浸潤和轉(zhuǎn)移侵襲[11]。N-cadherin是間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附作用，在腫瘤中增強(qiáng)細(xì)胞的活力和遷移能力，其表達(dá)水平在EMT過程中提高[12]。vimentin是一種中間纖維蛋白，與微管、微絲一起構(gòu)成細(xì)胞骨架，在調(diào)控細(xì)胞黏附能力和細(xì)胞遷移方面發(fā)揮重要作用，EMT過程中高表達(dá)的vimentin誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞黏附力降低，提高細(xì)胞的遷移能力[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CA抑制了MDA-MB-231細(xì)胞中N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)，提高了E-cadherin蛋白的表達(dá)，提示CA可能通過抑制MDA-MB-231細(xì)胞的EMT途徑來抑制細(xì)胞的遷移。

Hippo信號是由一系列激酶級聯(lián)引起的信號調(diào)控，Hippo信號處于未被激活狀態(tài)時，YAP與TAZ處于磷酸化狀態(tài)，磷酸化Mst1/2的激活部位后激活Mst1/2，進(jìn)一步激活腫瘤抑制激酶LATS1/2，活化的LATS1/2發(fā)生磷酸化，誘導(dǎo)生長轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP/TAZ磷酸化，造成其胞質(zhì)滯留或生物降解，阻止核積累[14]。當(dāng)Hippo信號通路失調(diào)時，YAP/TAZ無法及時被磷酸化，會轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，并誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖、細(xì)胞維穩(wěn)和遷移侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞一系列活動[15]。腫瘤抑制基因NF2是Hippo信號通路的重要上游調(diào)控因子之一，通過激活MST1/2磷酸化和促進(jìn)P-MST1/2激發(fā)LAT1/2磷酸化是Hippo信號傳導(dǎo)重要激活因子[16]。干預(yù)Hippo信號通路，提高P-Yap蛋白表達(dá)，也可阻滯細(xì)胞于G0/G1期，抑制遷移侵襲活力[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，CA通過提高NF2表達(dá)量，促進(jìn)Mst1磷酸化進(jìn)一步調(diào)控下游Yap磷酸化，提高P-Yap的水平，表明CA通過抑制Hippo信號通路抑制了MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，提高細(xì)胞凋亡水平。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，CA對MDA-MB-231細(xì)胞具有良好的抑制作用，顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能是通過抑制Hippo信號通路，抑制EMT途徑，調(diào)控MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡和周期水平。為CA進(jìn)一步開發(fā)為乳腺癌藥物提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。