如意珍寶片對骨關(guān)節(jié)炎性痛的抑制作用

陳海坤，柏虎虎，李宇哲，朱閱賓，葛安娜，吳樹金，劉燕妮，胡曉東

(蘭州大學(xué)藥學(xué)院分子藥理研究所，甘肅 蘭州 730000)

慢性疼痛是骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)的主要癥狀，也是臨床治療面臨的棘手問題[1]。骨關(guān)節(jié)炎性痛(osteoarthritic pain)由組織損傷和神經(jīng)病變共同引起，機械性痛覺超敏(mechanical allodynia)為其典型特征[2]，包括靜態(tài)痛覺超敏(static allodynia)和動態(tài)痛覺超敏(dynamic allodynia)。

實驗動物的OA模型按誘發(fā)方式，可分為自發(fā)性、手術(shù)誘導(dǎo)和非手術(shù)誘導(dǎo)三類[1]。內(nèi)側(cè)半月板-脛骨韌帶切斷術(shù)(destabilization of the medial meniscus，DMM)是一種常用的手術(shù)誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎模型，手術(shù)造成的小鼠膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定會誘發(fā)軟骨組織和神經(jīng)病變，導(dǎo)致慢性病理性疼痛的形成，并且痛覺超敏癥狀與關(guān)節(jié)病變的發(fā)展程度存在明顯的相關(guān)性[3-5]。

如意珍寶片是在藏藥如意珍寶丸的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新劑型，由珍珠母、沉香、石灰華等組成。如意珍寶片主要用于清熱醒腦、舒筋通絡(luò)、關(guān)節(jié)不利、治療白脈病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓背角中，NMDA受體(N-methyl-D-aspartate receptors)功能亢進參與病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展，GABAA能去抑制可增加NMDA受體GluN1亞基第897位絲氨酸磷酸化(pS897-GluN1)，提高GluN1亞基的突觸分布，導(dǎo)致痛覺敏化[6]。本文旨在探究如意珍寶片緩解骨關(guān)節(jié)炎性痛的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6小鼠(♂)，年齡8～12周，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供(動物合格證號：SCXK(甘) 2018-0002)。

1.2 主要材料如意珍寶片(甘肅奇正藏藥有限公司；批準文號：國藥準字Z20100061；生產(chǎn)批號：2003001)、多聚甲醛(Sigma-Aldrich，貨號：158127)、正常山羊血清(Jackson ImmunoResearch，貨號：138751)、山羊抗兔GluN1- pS897抗體(Millipore，貨號：06-641)、Cy3偶聯(lián)的山羊抗兔熒光二抗(Abcam，貨號：ab6939)、AMPA受體阻斷劑CNQX(Sigma-Aldrich，貨號：C127)、NMDA受體阻斷劑D-APV(Sigma-Aldrich，貨號：A8054)、甘氨酸受體阻斷劑strychnine (Sigma-Aldrich，貨號：S450162)、鈉通道阻斷劑TTX(Sigma-Aldrich，貨號：SML0378)、GABAA受體阻斷劑bicuculline (Sigma-Aldrich，貨號：B8398)、Von Frey纖維針(Stoehing，USA)、自制毛刷、BX51WIF熒光顯微鏡(Olympus，Japan)、Axon700B型膜片鉗放大器(Axon Instrument，America)、冷凍切片機(Leica，Germany)、體式顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)、FV1200型激光共聚焦顯微鏡(Olympus Corporation，Japan)、ZQP-86型振動切片機 (上海之信儀器有限公司)。

1.3 DMM模型在進行DMM手術(shù)之前，對小鼠進行痛覺篩選，連續(xù)3 d進行行為學(xué)測試，并剔除痛覺異常的小鼠(50%縮足反應(yīng)閾值<1 g，毛刷誘發(fā)的痛行為評分>0.5)，對痛覺測試結(jié)果在正常范圍內(nèi)的小鼠造模。小鼠用戊巴比妥鈉(90～120 mg·kg-1)腹腔注射麻醉。在體式顯微鏡下，無菌操作，行左側(cè)膝關(guān)節(jié)髕骨內(nèi)側(cè)切口，暴露、并橫斷內(nèi)側(cè)半月板-脛骨韌帶[3，7]。右側(cè)(假手術(shù)側(cè))僅做皮膚切口。逐層縫合傷口。

1.4 灌胃給藥如意珍寶片研磨、粉碎，以每0.625、1.25、2.5 g·L-1比例溶解于蒸餾水。按照20 mL·kg-1的比例灌胃，即相當于每只小鼠給予如意珍寶片12.5、25、50 mg·kg-1，每天給藥1次，連續(xù)給藥6 d。

1.5 行為學(xué)測定

1.5.1靜態(tài)痛覺超敏 將小鼠放在底部為金屬鐵絲網(wǎng)的測試籠里，適應(yīng)30 min，在造模前、后的不同時間點，使用不同力度的von Frey纖維，垂直刺激小鼠的后足底掌心皮膚，觀察小鼠的撤足和舔足反應(yīng)，以up-down法[8-9]，按照下列公式，計算50%縮足反應(yīng)閾值(paw withdrawal thresholds，PWT)：

50% PWT (g)=(10[Xf+K·δ])/10 000；Xf=最小von Frey力度值，K=常數(shù)，δ=0.26。

1.5.2動態(tài)痛覺超敏 將小鼠放在底部為金屬鐵絲網(wǎng)的測試籠里，適應(yīng)30 min，在造模前、后的不同時間點，以特制的毛刷[10]，從足跟向足尖方向輕刷小鼠的足底皮膚，以下列標準判定動物的疼痛分值[11]：

0：移步或簡單的抬足；

1：持續(xù)抬足，時間超過2 s；

2：連續(xù)后足抖動；

3：舔足；

每只小鼠測試3次，每次間隔2 min，計算3次的平均值。

1.6 免疫組化染色小鼠用戊巴比妥鈉(90～120 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，左心室逆向灌注4 ℃的20 mL生理鹽水和10 mL的多聚甲醛，分離腰膨大部脊髓，用30%的蔗糖溶液4 ℃脫水過夜；冰凍切片機切取厚16 μm組織片；在包含0.25% Triton X-100和10%正常山羊血清的PBS中4 ℃封閉過夜；加入一抗，4 ℃過夜；加入二抗，在暗處室溫孵育2 h。封片。激光共聚焦顯微鏡拍片[8]。

1.7 電生理學(xué)記錄小鼠用戊巴比妥鈉(90～120 mg·kg-1)麻醉，脊髓轉(zhuǎn)入4 ℃、充氧(95% O2+5% CO2) 的蔗糖溶液(mmol：50.0 sucrose，95.0 NaCl，1.8 KCl，0.5 CaCl2，7.0 MgSO4，1.2 KH2PO4，26.0 NaHCO3，15.0 D-glucose，pH 7.4)，體式顯微鏡下，快速剝離脊膜，固定于瓊脂槽，橫向切取300 μm的脊髓片，轉(zhuǎn)入記錄槽，灌流(5 mL·min-1)充氧的ACSF至少1 h后，以BX51WIF熒光顯微鏡的40倍物鏡，挑選Ⅱ板層的健康細胞，在電壓鉗模式下(鉗制電壓0 mV)，以Axon700B型放大器記錄mIPSCs，充灌電極內(nèi)液(mmol：110.0 Cs2SO4，5.0 KCl，2.0 MgCl2，0.5 CaCl2，5.0 HEPES，5.0 EGTA，5.0 Mg-ATP，0.5 Na-GTP，pH 7.2，295～300 mOsm)的電極電阻為3～8 MΩ，細胞外液中加入AMPA受體阻斷劑CNQX (10.0 μmol)、NMDA受體阻斷劑D-APV(50.0 μmol)、甘氨酸受體阻斷劑strychnine(2 μmol)和鈉通道阻斷劑TTX (0.5 μmol)。鉗制電壓在-70 mV，記錄mEPSCs，電極內(nèi)液為(mmol)：115 CsMeSO4，20 CsCl，10 HEPES，2.5 MgCl2，4 Na-ATP，0.4 Na-GTP，0.6 EGTA，10 sodium phosphocreatine (pH 7.25，295-300 mOsm)，細胞外液中加入GABAA受體阻斷劑bicuculline(10 μmol)、strychnine (2 μmol)和TTX(0.5 μmol)。實時監(jiān)測串聯(lián)阻抗和輸入阻抗的變化，任一阻抗的變化超過15%則細胞棄用。信號的過濾頻率2 kHz，采樣率為10 kHz[8]。

2 結(jié)果

2.1 如意珍寶片對DMM誘發(fā)的靜態(tài)痛覺超敏的影響我們在測定小鼠的基礎(chǔ)痛閾后，制備左側(cè)DMM模型，連續(xù)監(jiān)測痛閾的變化。結(jié)果顯示：從造模后d 7開始，von Frey纖維誘發(fā)的左側(cè)縮足反應(yīng)閾值(PWT)顯著下降(Fig 1A)，而右側(cè)(假手術(shù)側(cè))的痛閾卻沒有明顯變化，在實驗期內(nèi)始終維持穩(wěn)定(Fig 1A)，說明DMM誘發(fā)出了靜態(tài)痛覺超敏。隨后，我們灌胃給予生理鹽水、如意珍寶片小劑量(12.5 g·kg-1，F(xiàn)ig 1B)、中劑量(25 mg·kg-1，F(xiàn)ig 1C)和大劑量(50 mg·kg-1，F(xiàn)ig 1D)，每天給藥1次，連續(xù)給藥6 d，發(fā)現(xiàn)：生理鹽水不會對靜態(tài)痛覺超敏產(chǎn)生明顯的影響(Fig 1A)。灌胃給予如意珍寶片，能夠劑量依賴性地升高左側(cè)PWT值(Fig 1B-1D)；在末次給藥后，各組動物的左側(cè)PWT值如Fig 1E所示，和DMM動物相比，25 mg·kg-1和50 mg·kg-1的如意珍寶片能夠顯著提高PWT值，有效緩解靜態(tài)痛覺超敏。

2.2 如意珍寶片對DMM誘發(fā)的動態(tài)痛覺超敏的影響相比于靜態(tài)痛覺超敏，動態(tài)痛覺超敏的臨床治療更為困難。DMM會誘發(fā)明顯的動態(tài)痛覺超敏(Fig 2A)，表現(xiàn)為非傷害性的輕微毛刷刺激也會引起小鼠的撤足、舔足等痛行為；這些痛反應(yīng)在DMM后7 d即出現(xiàn)，而右側(cè)(假手術(shù)側(cè))則不會對毛刷刺激產(chǎn)生明顯的反應(yīng)(Fig 2A)。灌胃給予生理鹽水不會對痛行為的評分值產(chǎn)生任何影響(Fig 2A)。但灌胃給予如意珍寶片，能夠劑量依賴性地降低痛反應(yīng)(Fig 2B-2D)；在末次給藥后，各組動物的左側(cè)痛行為評分如Fig 2E所示，和DMM動物相比，50 mg·kg-1的如意珍寶片能夠顯著降低痛行為評分，有效緩解動態(tài)痛覺超敏。

Fig 1 Effect of Ruyizhenbao tablets on static allodynia A:Changes of PWTs between DMM and sham groups after injection of saline.B:Changes of PWTs between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (12.5 mg·kg-1).C:Changes of PWTs between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (25 mg·kg-1).D:Changes of PWTs between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (50 mg·kg-1).E:Effects of different doses of Ruyizhenbao tablets on static alladynia in DMM mice.BL：The baseline of pain threshold.The arrows showed the time point of the corresponding treatment.*P<0.05 vs DMM group.

Fig 2 Effect of Ruyizhenbao tablets on dynamic allodynia A:Time-dependent changes of dynamic score between DMM and sham groups after injection of saline.B:Time-dependent changes of dynamic score between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (12.5 mg·kg-1).C:Time-dependent changes of dynamic score between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (25 mg·kg-1).D:Time-dependent changes of dynamic score between DMM and sham groups after injection of Ruyizhenbao tablets (50 mg·kg-1).E:Effects of different doses of Ruyizhenbao tablets on dynamic score in DMM mice.BL：The baseline of pain threshold.The arrows showed the time point of the corresponding treatment.*P<0.05 vs sham group.

2.3 如意珍寶片對脊髓背角興奮性突觸傳遞的影響在DMM誘發(fā)小鼠痛覺超敏后4周，灌胃給予不同劑量的如意珍寶片，每天給藥1次，連續(xù)6 d；在末次給藥后0.5～1 h，切取離體脊髓片，記錄AMPA受體介導(dǎo)的微小興奮性突觸后電流 (mEPSCs)。結(jié)果顯示：DMM可顯著提高mEPSCs的頻率(Fig 3A)，和假手術(shù)對照組相比，差異具有顯著性(Fig 3B)；灌胃給予如意珍寶片(12.5 mg·kg-1，25 mg·kg-1和50 mg·kg-1)，能夠劑量依賴性的降低mEPSCs的頻率(Fig 3B)。然而，DMM后，mEPSCs的幅值沒有明顯的變化(Fig 3C)，和對照組相比，差異無顯著性；各劑量的如意珍寶片也不會對mEPSCs的幅值產(chǎn)生明顯影響(Fig 3C)，提示：如意珍寶片可能通過突觸前機制，阻滯痛覺信息的傳遞。

2.4 如意珍寶片對脊髓背角抑制性突觸傳遞的影響在DMM誘發(fā)小鼠痛覺超敏后4周，灌胃給予不同劑量的如意珍寶片，每天給藥1次，連續(xù)6 d；在末次給藥后0.5～1 h，切取離體脊髓片，記錄GABAA受體介導(dǎo)的微小抑制性突觸后電流(mIPSCs)。結(jié)果顯示：DMM可降低mIPSCs的頻率和幅值(Fig 4A)，和假手術(shù)對照組相比，差異具有顯著性(Fig 4B-4C)，提示：DMM誘發(fā)了脊髓去抑制。然而，灌胃給予如意珍寶片不會對mIPSCs的頻率和幅值產(chǎn)生明顯影響(Fig 4A)，和模型組動物相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 4B-4C)，提示：如意珍寶片不能逆轉(zhuǎn)DMM誘發(fā)的脊髓去抑制。

2.5 如意珍寶片對脊髓背角NMDA受體磷酸化的影響在DMM誘發(fā)小鼠痛覺超敏后4周，我們灌胃給予不同劑量的如意珍寶片，每天給藥1次，連續(xù)6 d；在末次給藥后0.5～1 h，在脊髓背角觀察NMDA受體pS897-GluN1的變化。結(jié)果顯示：和對照組相比，DMM小鼠的單位面積下pS897-GluN1的免疫反應(yīng)強度明顯升高(Fig 5)，而如意珍寶片能夠劑量依賴性地降低pS897-GluN1水平(Fig 5)。

3 討論

在骨關(guān)節(jié)炎疼痛狀態(tài)下，關(guān)節(jié)軟骨退化嚴重，滑膜及半月板中的血管生成增加，刺激關(guān)節(jié)處感覺神經(jīng)生長，多種炎性細胞因子的表達增加，導(dǎo)致關(guān)節(jié)處炎癥的發(fā)生。機械性痛覺超敏是骨關(guān)節(jié)炎患者的典型癥狀之一，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。本研究顯示，灌胃給予如意珍寶片能夠有效緩解DMM誘發(fā)的動態(tài)痛覺超敏和靜態(tài)痛覺超敏，提示如意珍寶片對骨關(guān)節(jié)炎性痛的良好的治療效果。

Fig 3 Effect of Ruyizhenbao tablets on frequency (A，B) and amplitude (A，C) of mEPSCs in spinal cord dorsal horn 1：Sham;2:DMM;3:Ruyizhenbao tablets/12.5 mg·kg-1；4:Ruyizhenbao tablets/25 mg·kg-1；5:Ruyizhenbao tablets/50 mg·kg-1.*P<0.05 vs sham group (Kruskal-Wallis test)，#P<0.05 vs DMM group (Kruskal-Wallis test).

Fig 4 Effect of Ruyizhenbao tablets on frequency (A，B) and amplitude (A，C) of mIPSCs in spinal cord dorsal 1：Sham;2:DMM;3:Ruyizhenbao tablets/12.5 mg·kg-1；4:Ruyizhenbao tablets/25 mg·kg-1；5:Ruyizhenbao tablets/50 mg·kg-1.*P<0.05 (Kruskal-Wallis test).

Fig 5 Effect of Ruyizhenbao tablets on pS897-GluN1 induced by n=8)1：Sham;2:DMM;3:DMM/Saline;4:DMM/12.5 mg·kg-1；5:DMM/25 mg·kg-1；6:DMM/50 mg·kg-1.*P<0.05 vs sham group，#P<0.05 vs DMM group.

外周炎癥及神經(jīng)損傷之后，脊髓背角中興奮性谷氨酸能突觸傳遞的增強是誘發(fā)和維持慢性痛的重要機制。突觸前膜遞質(zhì)的釋放增加、和/或突觸后膜谷氨酸受體的功能亢進，都有可能導(dǎo)致突觸傳遞的增強。mEPSCs的頻率和幅值變化，分別代表了突觸前膜和突觸后膜的功能改變。本研究發(fā)現(xiàn)DMM之后，mEPSCs的頻率明顯提高，但其幅值卻沒有明顯變化，提示DMM可能通過促進突觸前膜的遞質(zhì)釋放，誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎性痛。我們的結(jié)果顯示，如意珍寶片能夠有效降低mEPSCs的頻率，而對其幅值沒有明顯作用，說明如意珍寶片可能作用于突觸前膜，抑制谷氨酸的釋放，減弱痛覺信息的傳遞，從而產(chǎn)生良好的鎮(zhèn)痛效果。

興奮性NMDA型谷氨酸受體的功能亢進是增強痛覺信息傳遞、提高脊髓背角痛覺傳遞神經(jīng)元的興奮性、誘發(fā)和維持機械性痛覺超敏的重要原因。外周組織或神經(jīng)損傷之后，脊髓背角NMDA受體的磷酸化水平會明顯升高[12]；磷酸化修飾是導(dǎo)致NMDA受體功能亢進的關(guān)鍵途徑[13]。通過免疫組化實驗，我們觀察了如意珍寶片對NMDA受體GluN1亞基的影響，發(fā)現(xiàn)如意珍寶片呈劑量依賴性地降低了GluN1亞基S897位的磷酸化。眾所周知，GluN1亞基的S897是cAMP依賴性蛋白激酶的磷酸化位點，我們先前研究發(fā)現(xiàn)，GluN1亞基的S897磷酸化水平降低能夠減輕炎癥疼痛[6]。S897磷酸化水平的降低提示：如意珍寶片可能通過對PKA的活性的抑制來緩解骨關(guān)節(jié)炎性痛。

我們先前研究表明，脊髓背角中抑制性突觸傳遞的減弱是誘發(fā)病理性疼痛的又一關(guān)鍵因素[6]。提高GABA能抑制效率，可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效果[14]。我們的研究顯示，DMM可降低mIPSCs的頻率和幅值，提示脊髓去抑制參與DMM誘發(fā)的骨關(guān)節(jié)炎性痛。然而，各種劑量的如意珍寶片都不會對抑制性突觸傳遞產(chǎn)生明顯的影響。因此，我們的研究結(jié)果提示，如意珍寶片可能特異性干預(yù)興奮性突觸傳遞，有效緩解骨關(guān)節(jié)炎性痛。如意珍寶片含有多種成分，其靶向興奮性突觸傳遞的具體成分和特異性干預(yù)興奮性突觸傳遞的分子機制都不夠明確，除此之外，我們尚未檢測骨關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)滑液中炎性因子的變化情況，這些問題需要我們進一步的深入研究。

(致謝：本實驗在蘭州大學(xué)藥學(xué)院分子藥理學(xué)研究所完成，對本實驗提供技術(shù)支持和實驗幫助的老師同學(xué)表示感謝。)