新型組蛋白去乙?；敢种苿㈱N-470A抑制乳腺癌的增殖、遷移的機(jī)制研究

王麗榮,于 杰,亓洪昭,劉翠云,朱素杰,胡運(yùn)潔,周志俠,孫振青,單佩佩

(1.青島大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,山東 青島 266021；2.青島市中心醫(yī)院,山東 青島 266042；3.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心外科,山東 濰坊 261031;4.青島大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科,山東 青島 266000)

據(jù)2020年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌成為全球第一大癌癥，其發(fā)病率和死亡率逐年攀升，對(duì)女性的健康造成很大的危害[1-2]。目前用于治療乳腺癌的手段主要有：手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法、內(nèi)分泌治療、免疫治療以及靶向治療[3]。其中，靶向治療是一種特異性靶向腫瘤特定分子的治療手段。因其具備腫瘤細(xì)胞的高針對(duì)性、較好的抗腫瘤效果，對(duì)正常組織的傷害更小的優(yōu)點(diǎn)現(xiàn)在被廣泛研究并應(yīng)用于臨床[4]。目前腫瘤分子靶向藥物主要包括單克隆抗體和小分子化合物，一些已經(jīng)由FDA批準(zhǔn)用于腫瘤的臨床治療[5]。盡管如此，由于乳腺癌的高度異質(zhì)性和復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，目前可用于乳腺癌的靶向藥物依然極大的發(fā)展空間。近年來研究表明[6-7]，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，伴隨著明顯的表觀遺傳學(xué)變化。表觀遺傳修飾在腫瘤的形成和腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步惡化發(fā)揮重要的作用。組蛋白去乙?；甘且环N催化染色體上組蛋白去乙酰化的表觀遺傳修飾酶，參與真核生物的基因表達(dá)調(diào)控。染色體上組蛋白的去乙?；焕贒NA與組蛋白八聚體解離，核小體結(jié)構(gòu)緊密從而抑制轉(zhuǎn)錄[8]。腫瘤組織中組蛋白去乙?；副磉_(dá)的異常升高則會(huì)導(dǎo)致抑制腫瘤相關(guān)的基因表達(dá)受到抑制。已有研究顯示乳腺癌細(xì)胞中組蛋白去乙?；?HDAC)表達(dá)異常升高并可以作為治療的分子靶標(biāo)[9]。自2006年伏立諾他(Vorinostat)被FDA批準(zhǔn)用于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的治療起，近十年來對(duì)組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACi)的研究不斷增多，其中一些已被批準(zhǔn)用于腫瘤的臨床治療[10-12]。但目前針對(duì)實(shí)體瘤的HDACi抑癌效果并不理想，并且其抑癌機(jī)制仍然需要不斷發(fā)掘完善。因此研發(fā)新型有效可用于臨床治療的HDACi并闡明其機(jī)制對(duì)于未來乳腺癌的治療具有重要意義[13]。本研究以一組新的組蛋白去乙酰化酶抑制劑為研究對(duì)象，篩選出ZN-470A，發(fā)現(xiàn)該小分子藥物在體內(nèi)外對(duì)乳腺癌均具有較強(qiáng)的抑制作用。機(jī)制研究上，本課題將以抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行探究。我們的研究提示ZN-470A可以作為治療乳腺癌的潛在候選藥物。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1細(xì)胞 人乳腺細(xì)胞MDA-MB-231、MCF-7；鼠乳腺癌細(xì)胞4T1。

1.1.2主要試劑 MTT(碧云天，ST316)、RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，31800022)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco，12100046)、胎牛血清(美侖，PWL001)、胰酶(Gibco,27250018)、Ac-H3(CST，9649S)、Ac-H4(CST，8647S)、β-actin(Santa Cruz，sc-47718)、細(xì)胞裂解液(Yeasen，20101ES60)、PVDF膜(Merck，IPVH00010)；ECL化學(xué)發(fā)光液(Vazyme,E412-01)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組與處理 通過原位注射將腫瘤細(xì)胞接種至6～8周的小鼠乳腺脂肪墊內(nèi)(4T1，1×105個(gè))，1周腫瘤形成后，將小鼠分成對(duì)照組和加藥組，定期通過腹腔注射給藥。加藥組注射含有ZN-470A的PBS溶液(20 mg·kg-1)，對(duì)照組注射含相同藥物體積DMSO的PBS溶液。連續(xù)給藥4周后，將小鼠處死，取出腫瘤、肺部及其他臟器進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.2.2組蛋白去乙?；富钚詼y(cè)定 利用HDAC活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)HDAC活性。在HDAC底物存在下，將HDAC酶(HeLa核提取物或MDA-MB231細(xì)胞裂解物)與SAHA或ZN-470A在37 ℃下孵育1 h。然后加入賴氨酸顯色劑終止反應(yīng)，37 ℃再孵育30 min。檢測(cè)440～460 nm下吸光度值。3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT 對(duì)數(shù)期生長的乳腺癌細(xì)胞消化，將細(xì)胞稀釋成5×107·L-1，接種至96孔板中(100 μL/孔)。24 h待細(xì)胞貼壁后，將原培養(yǎng)液吸出，再加入梯度稀釋含ZN-470A的培養(yǎng)液。37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h。將培養(yǎng)液吸出，加入含5 g·L-1MTT的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后將培養(yǎng)液吸出，每孔加入150 mL的DMSO溶解沉淀，測(cè)定OD490 nm吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.4克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期生長的細(xì)胞，胰酶消化，重懸。接種至6孔板(500～1 000個(gè)細(xì)胞/孔)。細(xì)胞完全貼壁后，加入不同濃度的ZN-470A培養(yǎng)液，中途每2～3 d換液1次，并觀察細(xì)胞狀態(tài)，待克隆形成后終止培養(yǎng)。PBS洗滌1～2次，每孔加入1 mL的4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌2～3次,每孔加入0.1%結(jié)晶紫染液1 mL，染色10～20 min，拍照。3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，無血清培養(yǎng)基重懸。24孔板中放入Transwell小室，上室加入100 μL細(xì)胞懸液，5×104個(gè)細(xì)胞/孔(MDA-MB-231)或10×104個(gè)/孔(4T1)。下室加入500 μL完全培養(yǎng)基。上室與下室加入相同濃度的ZN-470A。細(xì)胞于37 ℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)12 h,用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色顯微鏡觀察拍照。對(duì)照孔的抑制百分比表示為100%。3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.6Western blot MDA-MB-231用一定濃度的ZN-470A處理24 h后，PBS洗滌2～3次，RIPA蛋白裂解液200 μL裂解細(xì)胞，加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min使蛋白變性。蛋白樣品用于SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，5%脫脂牛奶常溫封閉60 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育1 h。3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.7免疫熒光 24孔板中放入細(xì)胞爬片，接種對(duì)數(shù)期生長的腫瘤細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)，待細(xì)胞完全貼壁后。吸棄原培養(yǎng)液，加入含一定濃度ZN-470A的培養(yǎng)液，37 ℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h。4%多聚甲醛室溫固定15 min,0.1% Triton X-100通透5 min，2% BSA封閉1 h。細(xì)胞與Ac-H3、Ac-H4一抗(1 ∶2 000) 4 ℃孵育過夜。用PBS洗滌2～3次，細(xì)胞與相應(yīng)熒光二抗(1 ∶1 000)常溫孵育1 h。PBS洗滌2～3次，最后用含DAPI抗熒光淬滅封片劑封片，顯微鏡下觀察拍照。3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.8免疫組化 將切除的腫瘤，固定并包埋在石蠟中。切成6 μm厚度組織切片，依次進(jìn)行脫蠟、復(fù)水、抗原修復(fù)。3 % H2O2常溫避光孵育10 min，2% BSA封閉1 h，組織與Ac-H3、Ac-H4一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜；PBS 洗滌2～3次，二抗(1 ∶1 000)常溫孵育1 h，PBS 洗滌2～3次，DAB顯色液常溫10～15 min,PBS洗滌2～3次，蘇木精染色2 min,自來水下沖洗，復(fù)水、透明、封片。3次重復(fù)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ZN-470A抑制組蛋白去乙酰化酶的活性將HeLa細(xì)胞核提取物或MDA-MB231細(xì)胞裂解物與HDAC底物混合，其中陰性對(duì)照組不做處理；陽性對(duì)照組加入SAHA，終濃度為10 μmol·L-1；實(shí)驗(yàn)組加入相同濃度的ZN-470A。結(jié)果如Fig 1顯示，與control組比較，組蛋白去乙?；冈谒幬镒饔孟禄钚悦黠@受到抑制，并且ZN-470A抑制效果優(yōu)于陽性對(duì)照SAHA(P<0.01)。說明ZN-470A可有效抑制組蛋白去乙?；傅幕钚浴?/p>

Fig 1 ZN-470A inhibited activity of histone SAHA:10 μmol·L-1;ZN-470A:10 μmol·L-1.**P<0.01 vs control

乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231經(jīng)過不同濃度ZN-470A作用24 h后，提取細(xì)胞中的蛋白，通過Western blot檢測(cè)各組樣品中Ac-H3、Ac-H4表達(dá)情況。結(jié)果如Fig 2所示，以β-actin作為內(nèi)參，ZN-470A藥物作用后，細(xì)胞中Ac-H3、Ac-H4表達(dá)量明顯上調(diào)，證明了在細(xì)胞中ZN-470A可抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，從而使組蛋白H3、H4的乙酰化水平上調(diào)。

Fig 2 Effect of ZN-470A on histone acetylation in breastcancer cells MDA-MD-231**P<0.01 vs control

同樣地，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZN-470A對(duì)細(xì)胞內(nèi)部Ac-H3、Ac-H4表達(dá)的影響。結(jié)果如Fig 3所示，乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在濃度為10 μmol·L-1的ZN-470A作用24 h后，與control組相比，Ac-H3、Ac-H4的熒光強(qiáng)度明顯增加，表明ZN-470A作用后細(xì)胞內(nèi)部組蛋白H3、H4的乙?；缴险{(diào)，組蛋白去乙酰化酶活性有效被抑制。

2.2 ZN-470A抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和單細(xì)胞成瘤能力Fig 4結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞MCF-7在10 μmol·L-1ZN-470A作用后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。與control相比，ZN-470A處理后的MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡特征，細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。說明ZN-470A可有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長，且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。

Fig 5可見，不同濃度處理后的3株乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生存率,ZN-470A對(duì)乳腺癌細(xì)胞4T1、MCF-7、MDA-MB-231均有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且根據(jù)數(shù)據(jù)分析，兩株三陰性乳腺癌細(xì)胞株4T1、MDA-MB-231對(duì)ZN-470A更加敏感。濃度為5 μmol·L-1時(shí)，4T1和MDA-MB-231的細(xì)胞數(shù)分別下降47%(P<0.01)及51.75%(P<0.01)。說明ZN-470A對(duì)三陰性乳腺癌的增殖呈現(xiàn)有效的抑制效果。

Fig 3 Effect of ZN-470A (10 μmol·L-1) on histoneacetylation in breast cancer cells MDA-MD-231

Fig 4 The morphological changes of breast cancercell MCF-7 after ZN-470A (10 μmol·L-1)treatment

腫瘤細(xì)胞的體外克隆形成反映出腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞成瘤能力，根據(jù)Fig 6的結(jié)果，ZN-470A對(duì)乳腺癌細(xì)胞4T1的克隆形成能力具有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性。相同藥物濃度下ZN-470A的克隆形成數(shù)少于陽性對(duì)照SAHA，克隆的大小也小于陽性對(duì)照SAHA。

通過Transwell檢測(cè)兩種三陰性乳腺癌細(xì)胞4T1、MDA-MB-231的遷移能力。如Fig 7的結(jié)果所示，與control相比，ZN-470A作用后細(xì)胞的遷移數(shù)量明顯減少，證明ZN-470A顯著降低了兩種高度惡性乳腺癌細(xì)胞系的侵襲能力。

2.3 ZN-470A抑制小鼠乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移濃度為20 mg·kg-1的ZN-470A藥物治療28 d后，針對(duì)小鼠腫瘤組織的免疫組化結(jié)果顯示(Fig 8)，與Control組相比，ZN-470A治療可提高腫瘤組織中組蛋白H3、H4的乙酰化水平。

ZN-470A治療28 d后,取小鼠肺部進(jìn)行H&E染色。Fig 9顯示，與control組相比，ZN-470A治療后肺部更光滑，相反地，未治療的小鼠肺部出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)。ZN-470A可有效地抑制腫瘤在小鼠體內(nèi)向肺部的轉(zhuǎn)移。

Fig 5 ZN-470A inhibited proliferation of breast cancer n=4)*P<0.5,**P<0.01 vs control

Fig 6 ZN-470A inhibited formation of breast cancer cell clones

Fig 7 ZN-470A inhibited invasion of breast cancer cellsScale:0.1 μm

Fig 8 Effect of ZN-470A on histone acetylation in tumor tissuesZN-470A:20 mg·kg-1；Scale:50 μm

2.4 ZN-470作用后乳腺癌細(xì)胞中蛋白的表達(dá)變化不同濃度ZN-470A作用后，檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞中幾種相關(guān)蛋白的表達(dá)。Fig 10結(jié)果顯示，TNFRSF17、AIF、FOSL2在ZN-470A作用后表達(dá)量減少。其中TNFRSF17為腫瘤壞死因子受體超家族中的一員，與腫瘤壞死因子配體相結(jié)合，參與細(xì)胞的活化、存活、增殖、壞死和凋亡等細(xì)胞程序；AIF屬于凋亡誘導(dǎo)因子，參與線粒體途徑細(xì)胞凋亡；FOSL2是一種轉(zhuǎn)錄因子，可與p-c-Jun形成異源二聚體AP-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，參與多種基因的表達(dá)調(diào)控。

Fig 9 ZN-470A inhibited lung metastasis of breast cancerZN-470A:20 mg·kg-1；Scale:100 μm

Fig 10 Effect of ZN-470A on protein expression in breast cancer

3 討論

目前治療乳腺癌的方法包括局部治療和全身治療。治療策略的選擇需要考慮患者的腫瘤亞型、病理分期和其他疾病相關(guān)因素。對(duì)于非轉(zhuǎn)移性乳腺癌，策略是手術(shù)切除。對(duì)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌，除手術(shù)治療外，同時(shí)根據(jù)腫瘤亞型聯(lián)合內(nèi)分泌治療或化療[3]。然而，已經(jīng)公布的許多化療藥物具有嚴(yán)重的副作用，并且乳腺癌患者對(duì)治療的反應(yīng)差異很大。最終，很大一部分患者對(duì)化療產(chǎn)生耐藥性[14]。近年來，靶向治療表現(xiàn)出顯著治療效果，不良反應(yīng)發(fā)生率最低，保證了患者良好的生活質(zhì)量。近二十年來，腫瘤靶向藥物發(fā)展迅速，在研究和臨床應(yīng)用方面取得多項(xiàng)突破。乳腺癌被認(rèn)為是一種復(fù)雜的異質(zhì)性腫瘤，靶向治療顯然在其中起著重要的治療作用。研發(fā)藥效更強(qiáng)，毒性更低的乳腺癌靶向藥具有重要意義。

本研究從一組新型HDACi中篩選出具有治療效果的ZN-470A，分別從細(xì)胞和動(dòng)物水平上驗(yàn)證了該藥對(duì)乳腺癌具有明顯的抑制作用。ZN-470A是以目前已上市的組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA為基礎(chǔ)骨架，添加修飾基團(tuán)合成的新型小分子化合物。在前期HDAC酶活檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)其抑制組蛋白去乙?；傅幕钚员萐AHA高，繼而細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證了其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果比SAHA更顯著。修飾后的化合物可能通過增強(qiáng)藥物與靶分子之間的結(jié)合能力而使藥物的酶活抑制效果提高，修飾基團(tuán)的引入亦可能使藥物結(jié)合更多靶分子，從而增強(qiáng)藥物的抗腫瘤效果。最后通過Western blot檢測(cè)了藥物處理前后一些增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNFRSF17、AIF、FOSL2這3種蛋白表達(dá)有下調(diào)的趨勢(shì)。TNFRSF17又稱B細(xì)胞成熟抗原，是一種腫瘤壞死因子受體超家族成員。TNF 超家族成員(包括TNF、FAS、TRAIL及其受體)，它們通過調(diào)節(jié)主要的信號(hào)通路，控制細(xì)胞的生存和分化，并在不同組織的生長、組織和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，在多種惡性腫瘤中被廣泛研究[15]。AIF屬于凋亡誘導(dǎo)因子，參與線粒體途徑細(xì)胞凋亡[16]。FOSL2是一種轉(zhuǎn)錄因子，可與p-c-Jun形成異源二聚體AP-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，參與多種基因的表達(dá)調(diào)控[17]。

綜上所述，新型組蛋白去乙?；敢种苿㈱N-470A對(duì)乳腺癌的增殖、遷移具有明顯的抑制作用，是一種治療乳腺癌的潛在有效藥物。通過對(duì)其機(jī)制的初步研究，提示該小分子化合物可調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)蛋白TNFRSF17、AIF、FOSL2的表達(dá)。未來針對(duì)其分子機(jī)制的更深入探索，研究其作用的相關(guān)通路，有利于進(jìn)一步揭示ZN-470A的藥理作用；同時(shí)，對(duì)HDACi抑制腫瘤的分子機(jī)制具有補(bǔ)充和完善的意義。