明暗箱實(shí)驗(yàn)：昆明小鼠狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)條件篩選

王 群，馬 飛，王學(xué)斌，馬月香，孫世光

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 1.中醫(yī)學(xué)院、2.附屬醫(yī)院、3.第二附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250001；4.濟(jì)南市市中區(qū)人民醫(yī)院眩暈科，山東 濟(jì)南 250002；5.山東省中醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；6.山東省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250001)

焦慮癥是最常見的精神障礙，臨床常與其他類精神障礙合并共存；2019年全球疾病負(fù)擔(dān)研究發(fā)現(xiàn)，焦慮癥是導(dǎo)致10～24歲青少年傷殘調(diào)整生命年的第六位主要疾病[1-2]。明暗箱實(shí)驗(yàn)(light/dark box，LDB)是狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型行為學(xué)評(píng)價(jià)的經(jīng)典方法，廣泛用于焦慮癥發(fā)病機(jī)制與藥物篩選研究；嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)DB焦慮情緒主要是基于明暗光線刺激沖突產(chǎn)成，其行為模式受實(shí)驗(yàn)裝置(形狀、材質(zhì)、尺寸等)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(品系、年齡、性別等)及實(shí)驗(yàn)操作(起始位置、記錄時(shí)間、重測(cè)測(cè)量及周期節(jié)律等)諸多因素影響[3-4]。因此，本研究依據(jù)LDB作為狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)方法與原理，初步探討晝夜節(jié)律、光照面積、光照顏色以及光照強(qiáng)度等因素對(duì)昆明小鼠LDB行為模式的影響，以期篩選出LDB作為狀態(tài)焦慮動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，雄性(♂)，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(魯)20130001；室溫(20±2)℃，黑暗12 h(6 ∶00～18 ∶00)和光照12 h(18 ∶00～6 ∶00)環(huán)境，自由進(jìn)水飲食飼養(yǎng)；預(yù)適應(yīng)環(huán)境1周后，選取體質(zhì)量(20±2)g小鼠進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置明暗箱(45 cm × 27 cm × 27 cm)，木質(zhì)，包括3部分：大面積箱體(27 cm × 27 cm × 27 cm)，底部分成9個(gè)面積相等的方格(9 cm × 9 cm)；小面積箱體(18 cm × 27 cm × 27 cm)，底部分成6個(gè)面積相等的方格(9 cm × 9 cm)；兩箱體隔板(可移動(dòng))之中央通道(7 cm × 7 cm)。明箱區(qū)采用30 W白燈泡離箱底40 cm高處照明；暗箱區(qū)采用30 W紅燈泡(或其他實(shí)驗(yàn)彩色)離箱底40 cm高處照明。

1.3 實(shí)驗(yàn)操作操作者將昆明小鼠置于大面積箱體正中央格，用攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物5 min的行為變化，包括兩箱停留時(shí)間、水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)、穿梭次數(shù)以及糞便粒數(shù)；其中，四只爪子均進(jìn)入一格方可記錄水平運(yùn)動(dòng)1次，兩前爪騰空或攀附墻壁方可記錄垂直運(yùn)動(dòng)1次。納入實(shí)驗(yàn)參數(shù)：明區(qū)停留時(shí)間百分率(Ltime%)、明區(qū)水平運(yùn)動(dòng)百分率(Lcross%)、明區(qū)垂直運(yùn)動(dòng)百分率(Lrear%)、水平運(yùn)動(dòng)總得分(Cross)、垂直運(yùn)動(dòng)總得分(Rear)、總得分(Total=Cross+Rear)、穿梭次數(shù)(Transition)和兩區(qū)糞便粒數(shù)(Lfbs，Dfbs)及糞便總粒數(shù)(Fbs=Lfbs+Dfbs)。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件LDB實(shí)驗(yàn)條件影響因素主要考察晝夜節(jié)律(白天黑夜)、光照面積(明箱區(qū))、光照顏色(暗箱區(qū))、光照強(qiáng)度(明箱區(qū))以及晝夜節(jié)律與光照面積交互效應(yīng)。其中，晝夜節(jié)律主要考察白天周期(18 ∶00～6 ∶00；Day)、黑夜周期(6 ∶00～18 ∶00；Night)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)DB行為模式影響；光照面積主要考察眀箱區(qū)光照大面積箱體(L3/5)、小面積箱體(L2/5)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)DB行為模式影響；晝夜節(jié)律與光照面積采用析因設(shè)計(jì)分組：Day-L3/5(n=6)，Day-L2/5(n=6)，Night-L3/5(n=6)，Night-L2/5(n=6)。光照顏色主要考察暗箱區(qū)光照顏色黃色(Yellow，n=6)、綠色(Green，n=6)、藍(lán)色(Blue，n=6)、紅色(Red，n=6)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)DB行為模式影響，明箱區(qū)采用30 W白燈泡光照；實(shí)驗(yàn)周期選取Night。光照強(qiáng)度主要考察眀箱區(qū)光照強(qiáng)度15 W(n=6)、25 W(n=6)、40 W(n=6)、60 W(n=6)、100 W(n=6)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)DB行為模式影響，暗箱區(qū)采用30 W紅燈泡光照；實(shí)驗(yàn)周期選取Night。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)由Analyze→Nonparametric Tests→One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test程序完成；Levene檢驗(yàn)由Analyze→Compare Means→One-Way ANOVA(Homogeneity of Variances Test)程序完成。t檢驗(yàn)由Analyze→Compare Means→One-SampleTTest/Independent-SamplesTTest程序完成；單因素ANVOA由Analyze→Compare Means→One-Way ANOVA程序完成；析因設(shè)計(jì)ANVOA由Analyze→General Linear Model→Univariate程序完成；Kruskal-Wallis檢驗(yàn)Analyze→Nonparametric Tests→K-Independent-Samples Tests。所有數(shù)據(jù)先進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)分布檢驗(yàn)和Levene方差齊性檢驗(yàn)；依據(jù)正態(tài)分布結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)/單因素ANOVA/析因設(shè)計(jì)ANOVA/Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[5-6]。

2 結(jié)果

2.1 晝夜節(jié)律Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)提示，LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)；Levene檢驗(yàn)提示，LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Ltime%、Lcross%、Cross、Rear、Total數(shù)據(jù)均符合方差齊性(P>0.05)。t檢驗(yàn)結(jié)果提示，與黑夜周期相比，白天周期LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs差異變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 1。

2.2 光照面積Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)提示，LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)；Levene檢驗(yàn)提示，LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Rear、Total、Transition、Fbs數(shù)據(jù)均符合方差齊性(P>0.05)。t檢驗(yàn)結(jié)果提示，與3/5相比，光照大面積箱體(L3/5)LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Lcross%(Day：t=5.363，P<0.01)升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與2/5相比，光照小面積箱體(L2/5)LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Lrear%(Day：t=3.211，P<0.05)升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步析因設(shè)計(jì)ANOVA結(jié)果提示，晝夜節(jié)律對(duì)LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)影響差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而光照面積對(duì)LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Ltime%(F(1，20)=18.361，P<0.01)、Lcross%(F(1，20)=49.148，P<0.01)、Lrear%(F(1，20)=8.424，P<0.01)影響差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；晝夜節(jié)律與光照面積對(duì)LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)存在交互作用影響，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 1。

2.3 光照顏色Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)提示，LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs(而非Dfbs、Lfbs)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)；Levene檢驗(yàn)提示，LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Rear、Transition、Fbs數(shù)據(jù)均符合方差齊性(P>0.05)。單因素ANOVA結(jié)果提示，光照顏色對(duì)LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Rear(F(3，20)=3.746，P<0.05)、Fbs(F(3，20)=3.585，P<0.05)影響效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Dunnettt檢驗(yàn)結(jié)果提示，與Red組相比，Yellow組LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Rear(MD=-30.833，P<0.05)顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果提示，光照顏色對(duì)Lfbs、Dfbs影響效應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 2。

2.4 光照強(qiáng)度Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)提示，LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs(而非Dfbs、Lfbs)所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)；Levene檢驗(yàn)提示，LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Ltime%、Lcross%、Lrear%、Cross、Rear、Total、Transition、Fbs數(shù)據(jù)均符合方差齊性(P>0.05)。單因素ANOVA結(jié)果提示，光照強(qiáng)度對(duì)LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Cross(F(4，25)=2.569，P<0.05)、Total(F(4，25)=2.588，P<0.05)影響效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Dunnettt檢驗(yàn)結(jié)果提示，與15 W組相比，100 W組LDB實(shí)驗(yàn)參數(shù)Cross(MD=-173.167，P<0.05)、Total(MD=-93.667，P<0.05)明顯降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Kruskal-Wallis檢驗(yàn)結(jié)果提示，光照強(qiáng)度對(duì)Lfbs、Dfbs影響效應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 3。

Fig 1 Effect of day-night rhythm and illumination area on behavioral pattern of light/dark box(n=24)Solid bars，dark cycle;Hollow bars，light cycle;Wide bars，light at L3/5 area;Narrow bars，light at L2/5 area.*P<0.05，#P<0.01 vs Wide bars.

Fig 2 Effect of illumination color (in Dark box) on behavioral pattern of light/dark box♂ n=24.*P<0.05 vs Red light.

Fig 3 Effect of illumination intensity (in Light box) on behavioral pattern of light/dark box(n=30)*P<0.05 vs 15 W.

3 討論

外界環(huán)境(光線、噪音、清潔度等動(dòng)物福利)可以明顯影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為與生理變化，并導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)波動(dòng)變異[7-8]。已有研究證實(shí)[9-10]，嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物視覺系統(tǒng)對(duì)紫外光區(qū)與中波長(zhǎng)可見光區(qū)(綠光)敏感，而對(duì)紅光及紅外光區(qū)不敏感，這可能與嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物視覺系統(tǒng)是二元色，視網(wǎng)膜缺乏識(shí)別紅光錐體細(xì)胞相關(guān)；然而，最新研究發(fā)現(xiàn)[11-13]，嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為與生理受光線影響(包括紅光)，這可能與嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為與生理受視覺、觸覺、聽覺以及交感神經(jīng)系統(tǒng)等不同神經(jīng)通路交互式傳遞、不同腦區(qū)分布式編碼控制有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，光照面積可明顯影響LDB焦慮行為模式(Ltime%、Lcross%、Lrear%)，且光照面積通過晝夜節(jié)律影響LDB焦慮行為模式，尤其是與明箱區(qū)空間面積相比，白天周期LDB焦慮行為(Lcross%、Lrear%)明顯增加；光照顏色(黃光)可明顯影響LDB探索行為模式(Rear)，光照強(qiáng)度(100 W)可明顯影響LDB運(yùn)動(dòng)行為模式(Cross、Total)。同時(shí)，嚙齒類動(dòng)物情緒行為的形成與表達(dá)與先天遺傳與后天環(huán)境密切相關(guān)[18]，而狀態(tài)焦慮評(píng)價(jià)受外界環(huán)境及操作條件等后天因素的影響更為明顯，應(yīng)注意到本研究可能存在的缺陷：①晝夜顛倒預(yù)適應(yīng)環(huán)境周期僅1 w；②光照顏色是通過燈罩顏色過濾獲??；③光照強(qiáng)度采用燈泡功率大小區(qū)分；上述因素亦可能導(dǎo)致LDB行為模式一定程度的偏移。