凍干狂犬病疫苗熱原檢測在HL-60單核細胞激活實驗中的方法轉移和驗證研究

楊澤岸，陳 晨，張 媛，王 燦，高 華，吳彥霖

(1.中國食品藥品檢定研究院 北京 102629 2.上海食品藥品檢驗所,上海 201203)

疫苗質量安全問題也日益受到公眾關注，其中熱原反應(pyrogen reaction)是臨床常見的不良反應之一。熱原反應系經非腸道給藥0.5～1 h內出現(xiàn)的冷顫、高熱、出汗、昏暈、嘔吐，甚至休克等現(xiàn)象，能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質稱為熱原[1]。熱原包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。藥物中的熱原物質主要指細菌性熱原，是某些細菌的代謝產物、細菌外壁及內毒素(endotoxin)。細菌內毒素，又稱脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，是革蘭陰性菌的產物，其致熱能力最強[2]。熱原檢查方法包括家兔熱原檢查法(rabbit pyrogen test，RPT)、細菌內毒素檢查法(bacterial endotoxin test，BET)和單核細胞激活實驗(monocyte activation assay，MAT)[3-9]。

基于ISO 17025 的規(guī)范性文件中關于方法學驗證的內容，各國藥品監(jiān)管機構發(fā)布的指導原則提出了方法驗證(method validation)、方法轉移(method transfer)和方法確認(method verification)的概念，用于保證檢驗方法適合于檢驗、被檢樣品的質量可控，并確保檢驗人員有能力去操作方法，根據目的、檢驗人員、檢驗環(huán)境等因素的不同，以上3個概念的內涵和側重點又有所不同。method validation的核心是實驗室通過試驗設計和測試，證明被驗證的方法適用于該方法擬定的檢測用途。method validation主要由方法建立者進行，方法建立者必須要證明所建立的方法能夠滿足期望的檢測用途。method transfer是一個實驗室建立了經過驗證的分析方法，當其他實驗室(方法接收實驗室)在使用這個方法進行檢驗檢測時，就牽涉到方法在2個及以上不同實驗室之間的轉移問題，接收方法的實驗室需要證明其能夠成功地在本實驗室中運行該方法。常見的method transfer有：分析方法由公司的研發(fā)實驗室轉移到質控實驗室[10-12]。在方法的協(xié)作標定過程中，協(xié)作單位接收組織者提供的HL-60-IL-6單核細胞激活實驗方法[13-14]，并基于組織者的要求進行方法關鍵指標的測試和研究，協(xié)助完成方法的建立和驗證，上述環(huán)節(jié)涉及method transfer和method validation兩個環(huán)節(jié)。因此，我們首先按照組織者要求對LPS刺激HL-60分泌IL-6法進行了方法的transfer和validation，并使用經過validation的方法進行了人狂犬疫苗的品種適用性研究。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑細胞：人早幼粒白血病細胞HL-60，中國科學院細胞庫，細胞及鑒定結果由上海藥檢所提供[16]。

試劑：胎牛血清、IMDM、胰酶(Gibco公司，批號1347556、1897074、1095511)；人白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(BD OptEIATM公司，批號7118747EU；R&D公司，批號P134546；欣博盛生物科技有限公司，批號H170523-003a和H190716-007a)；LPS國家標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號150800-201601)；凍干人用狂犬病疫苗：10個廠家13批及熱原不合格樣品對應的3批疫苗附的注射用水(16批樣品)。

1.2 主要儀器CKX 41倒置顯微鏡(Olympus公司)；1389 A2生物安全柜(Thermo Fisher公司)；3141 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；6R離心機(Beckman Coulter公司)：Z2細胞計數(shù)儀(Beckman Coulter公司)；SYNERGY MX和SYNERGY HT酶標儀(Biotek公司)。

1.3 方法

1.3.1方法轉移 1)LPS 標準品溶液的配制 在無菌條件下，將LPS國家標準品用細菌內毒素檢查用水復溶至10 000 EU·mL-1，在渦旋混合器上混勻15 min，用維持培養(yǎng)液稀釋成0，0.015 6，0.031 2，0.062 5，0.125，0.25，0.5，1.0，10，100 EU·mL-1一系列濃度，每稀釋一步均應在漩渦混合器上混勻30 s。2)細胞檢測體系的建立 取對數(shù)生長期細胞，穩(wěn)定傳代2～3次，調整HL-60細胞密度至每1 mL約含1.0×105～1.0×106個細胞，于20%胎牛血清的IMDM細胞培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。選擇8～20代次的細胞用于實驗。取細胞懸液適量，1 000 r·min-1離心20 min，棄去上清液，用維持培養(yǎng)液(含2%FBS的IMDM培養(yǎng)基)調整細胞密度為每1 mL約含1.0×106個細胞，100 μL每孔接種于96孔U型板，加入100 μL 3.1或供試品溶液，平行3孔，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，取細胞上清，使用ELISA試劑盒檢測IL-6含量，計算450 nm處的吸光度A值與LPS濃度的關系，即為HL-60 MAT實驗檢測體系。

1.3.2方法驗證 參考2015年版《中國藥典》四部通則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則，對方法的線性及范圍、準確度、精密度、重復性、耐用性進行驗證[17]。

1)線性 以LPS濃度為橫坐標，吸光度A值為縱坐標進行四參數(shù)擬合。R2不得低于0.95，計算該體系對應的最低檢測限。最低檢測限=空白孔實測平均A值+3倍標準偏差(+3 s)。

2)重復性 取1名人員3次獨立實驗結果，3次最低檢測限結果應不超過50%～200%。

3)準確度 在維持培養(yǎng)基中加入接近反應曲線 EC50的LPS濃度溶液作為添加已知的標準品溶液濃度，配制方法同3.2，計算回收率%。

回收率%=(實測值-溶液中所含被測成分值)/加入標準品量×100%

4)耐用性 細胞自購買起為1代，建庫留種，取8、16、21和24代細胞進行靈敏度檢測，考察指標為最低檢測限；考察2家公司的IL-6 ELISA檢測試劑盒對檢測結果的影響。

1.3.3凍干人用狂犬病疫苗樣品的HL-60單核細胞激活實驗檢測 選用10個廠家共計13批次樣品，對其中RPT和BET檢測不合格的樣品附帶的注射用水3批進行檢查，按照《中國藥典》品種項下進行最大稀釋倍數(shù)MVD的計算，按照公式L=K·M-1，確定供試品的熱原物質限值(L)。其中，K為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU·(kg·h)-1表示，注射劑K=5 EU·(kg·h)-1，M為人用每千克體重的最大供試品劑量，以mL·(kg·h)-1、mg·(kg·h)-1或U·(kg·h)-1表示，中國人均體重按60 kg計算，人體表面積按1.62 m2計算。注射時間若不足1 h，按1 h計算。按照L按照標準每劑不得大于25EU，規(guī)格為0.5 mL和1.0 mL。按照公式MVD=C·L/·λ-1，λ為檢測體系的最低檢測限，每一步稀釋比不得大于1 ∶10，每稀釋一步均應在漩渦混合器上混勻30秒[18]。

1.3.4細菌內毒素動態(tài)顯色測定法 按《中國藥典》四部(2015 版)[18]通則1143細菌內毒素檢查法項中光度測定法進行凍干人用狂犬病疫苗的細菌內毒素含量檢測。

1.3.5熱原檢查法按《中國藥典》四部(2015 版)[19]通則1142熱原檢查法項進行凍干人用狂犬病疫苗的熱原檢測。

2 結果

2.1 方法驗證

2.1.1線性 當LPS濃度為0、0.0156、0.0312、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、10、100 EU·mL-1時，致HL-60細胞分泌的細胞因子IL-6含量的吸光度A值通過logistic四參數(shù)回歸，呈現(xiàn)很好的量效關系(Fig 1)，R2值均>0.95。

Fig 1 Dose-response relationship of IL-6 secretion byHL-60 induced by different concentrations of LPS standard

2.1.2重復性 使用BD OptEIATM公司和R&D公司生產的人IL-6 ELISA試劑盒分別進行3次試驗，計算R2值和最低檢測限。2個廠家吸光度A值差異比較大，但通過試劑盒自帶標曲計算IL-6含量，2個廠家對IL-6含量的檢測一致。表明HL-60-IL-6檢測體系重復性符合1.3.2要求，最低檢測限的波動范圍在50%～200%之間(Tab 1)。

Tab 1 Linearity and repeatability(n=3，3 independent experiments for 2 manufacturers)

2.1.3準確度 將LPS濃度0.5和1.0 EU·mL-1作為已知濃度標準品溶液加入檢測體系，平行6孔，獨立進行5次實驗，檢測體系的LPS含量為0 EU·mL-1，實測值為0.01 EU·mL-1(Tab 2)，LPS濃度0.5和1.0 EU·mL-1的回收率在91%～110%。

2.1.4耐用性 參考重復性實驗結果，在比對了BD OptEIATM公司和R&D公司生產的人IL-6 ELISA試劑盒檢測的基礎上，進行欣博盛生物科技有限公司2個批號的人IL-6 ELISA試劑盒檢測，通過logistic四參數(shù)回歸，LPS濃度與HL-60分泌IL-6含量呈現(xiàn)很好的量效關系，R2值均>0.95，最低檢測限為0.5和1.0 EU·mL-1，靈敏度與細菌內毒素檢查法相比無明顯優(yōu)勢。

Tab 2 Accuracy test results n=6，5 independent experiments for 2 concentrations)

使用R&D公司比較了8、16、20和24代的細胞的靈敏度，24代細胞與8代細胞的吸光度A值相比降低超過80%，最低檢測限分別為0.0625、0.0625、0.5和10 EU·mL-1，且24代細胞0.5、1.0和10 EU·mL-1劑量組間差異無顯著性，基于此，檢測體系建議使用20代次以內的HL-60細胞用于單核細胞激活實驗的檢測。

2.2 凍干人用狂犬病疫苗樣品的HL-60單核細胞激活實驗《中國藥典》2015年版二部凍干人用狂犬病疫苗品種項下規(guī)定的細菌內毒素含量不得超過25 EU·劑-1，檢測體系最低檢測限為0.125 EU·mL-1，參照細菌內毒素檢查法中光度測定法中的干擾試驗，以1.0 EU·mL-1作為干擾濃度，計算檢測樣品中的LPS含量(Tab 2)。編號14-16為BET檢驗不合格樣品附帶安瓿裝水，表明HL-60-IL-6法、BET法和RPT法檢測結論一致。

3 討論

3.1 熱原補充方法的研究為了確保非腸道用藥的質量和安全，尤其是靜脈注射用藥，熱原檢測技術日益至關重要，各國藥典也相繼收載多種熱原檢測方法，包括家兔熱原檢查法、細菌內毒素檢查法和單核細胞激活實驗。RPT被認為是檢測熱原的“金標準”，可全面、直觀反應藥物的臨床風險，其缺點是不能定量、靈敏度低、結果重復性差、費用較高、使用活體動物等，且RPT不適用于放射性藥物、化療藥物、免疫抑制劑等影響家兔發(fā)熱藥物的熱原檢測。BET可半定量或定量檢測藥物中細菌內毒素(含量，靈敏度較高，重復性好，其缺點是只能檢測革蘭陰性菌來源的LPS，不能檢測其他來源的熱原[15]。目前，《英國藥典》、《歐洲藥典》均已收錄了MAT，用于熱原檢測，于2005、2006年已有7種方法分別得到歐洲權威機構的驗證：7種推薦的方法有人全血法(新鮮人全血-IL-1β、新鮮人全血-IL-6和凍存人全血-IL-1β)，人外周血法(PBMC-IL-6)和細胞系法(MM6-IL-6、THP1-新喋呤(Neo)、THP1-TNFα)[17]。其中，人全血和人外周血對人血的要求較高，而且來源困難。而細胞系法中推薦的兩株細胞MM6和THP-1-新喋呤(Neo)細胞無法獲得，限制了該方法的推廣應用。

Tab 3 Results of freeze-dried human rabies vaccine HL-60-IL-6 method，BET method and RPT method

此外，細菌內毒素檢查法須使用專用試劑—鱟試劑系從國家二級保護動物鱟體內血液提取，由于環(huán)境惡化、過度捕撈(提取鱟試劑是捕撈鱟的主要目的之一)等原因，使我國鱟資源銳減，因而對鱟資源的保護迫在眉睫[16]。本實驗所采用的HL-60細胞系人源細胞，不再使用鱟、家兔等動物，消除了種屬差異，可作為熱原物質檢查方法的有力補充。HL-60-IL-6單核細胞激活實驗對凍干人用狂犬病疫苗樣品的檢測結果表明，該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，可以對熱原進行定量檢測。且根據文獻報道，該法不僅用于LPS檢測，還可用于革蘭氏陽性菌脂磷壁酸，真菌酵母多糖類熱原物質的檢測，具有廣譜檢測多種熱原的能力，亦可避免使用人血或單核細胞所產生的倫理問題，從而更好地保障凍干人用狂犬病疫苗的臨床用藥安全，盡可能減少因熱原污染導致的不良反應。

3.2 方法協(xié)作標定的研究一個方法的研究從實驗室內建立、實驗室內驗證開始，到實驗室間轉移和再驗證完成，經由多個實驗室不同人員對方法進行研究。對于方法協(xié)作標定實驗室在接收到方法時，涉及的再驗證項目、實驗過程中考核指標的實驗次數(shù)、符合要求評判標準等具體問題，我國尚無明確規(guī)定。大多數(shù)方法協(xié)作標定的實驗室均基于2015年版《中國藥典》四部通則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則進行了方法的再次驗證或部分驗證[17]。國家藥典委員會進行了關于《中國藥典》2020年版四部通則增修訂內容(第十九批)的公示，在《分析方法轉移指導原則》公示稿中規(guī)定：“對分析方法轉移的可接受方法還包括再驗證或部分驗證。再驗證時，應對通則9101《分析方法驗證指導原則》中收載的可能在轉移中受到影響的驗證指標進行說明”。有望在《中國藥典》2020年版四部通則中增加《分析方法轉移指導原則》，為相關的方法協(xié)作標定研究提供了理論指導和支持。