加減益經(jīng)湯對(duì)大鼠卵巢儲(chǔ)備功能下降的影響及機(jī)制研究Δ

萬(wàn)云慧，陳曉勇（江西省婦幼保健院中醫(yī)科/江西省中西醫(yī)結(jié)合女性生殖重點(diǎn)研究室，南昌 330006）

卵巢儲(chǔ)備功能下降（decrease of ovarian reserve，DOR）是指女性卵巢產(chǎn)生的卵母細(xì)胞數(shù)量及其質(zhì)量下降，主要表現(xiàn)為月經(jīng)不調(diào)、繼發(fā)性閉經(jīng)、不孕等癥狀[1]。DOR是卵巢功能退化至某種程度的一種疾病，若不加以干預(yù)，卵巢功能可能繼續(xù)退化而造成卵巢功能不全或卵巢早衰，因此必須盡早采取有效方法對(duì)其進(jìn)行干預(yù)治療。但目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)DOR 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此臨床暫時(shí)缺乏安全有效的DOR 治療方法，西醫(yī)主要依靠激素補(bǔ)充治療，但長(zhǎng)期激素治療會(huì)增加患者的患癌風(fēng)險(xiǎn)[2－3]。已有報(bào)道提出，腎氣盛衰與心、肝、脾之氣有關(guān)，由此創(chuàng)制的益經(jīng)湯使心、肝、脾、腎四經(jīng)同治[4]。加減益經(jīng)湯是在益經(jīng)湯的基礎(chǔ)上去白術(shù)、山藥，加菟絲子（增強(qiáng)了補(bǔ)腎的作用），去生棗仁、牡丹皮，加丹參（“一味丹參，功同四物”，減少了方劑藥物的組成），易人參為黨參而組成。有研究認(rèn)為，加減益經(jīng)湯對(duì)DOR 患者卵巢功能的改善效果十分明顯，且在改善卵巢儲(chǔ)備功能、提高女性受孕率方面具有一定功效[5－6]，但其作用機(jī)制尚不清楚。有研究指出，長(zhǎng)時(shí)間缺氧會(huì)誘發(fā)多種細(xì)胞死亡，是導(dǎo)致卵泡閉鎖、卵母細(xì)胞數(shù)量減少、卵巢功能衰退的重要原因之一[7－9]。低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、B 淋巴細(xì)胞瘤2 基因/腺病毒E1B 相互作用蛋白3重組蛋白（B lymphocytoma 2 gene/adenovirus E1B interacting protein 3 recombinant protein，Bnip3）、自噬關(guān)鍵分子酵母Atg6同系物（Beclin1）通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞缺氧自噬，通過(guò)調(diào)節(jié)上述通路可逆轉(zhuǎn)小鼠卵巢內(nèi)的缺氧及自噬狀態(tài)，從而發(fā)揮提高DOR 模型小鼠生育力的作用[10－11]。基于此，本研究探討了加減益經(jīng)湯對(duì)DOR模型大鼠的影響，從HIF-1α/Bnip3/Beclin1 通路出發(fā)初步分析其可能機(jī)制，以期為DOR的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括XDS-900C型光學(xué)顯微鏡（上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）、GS-15R型離心機(jī)（美國(guó)Beckman 公司）、BIOBASE-EL10A 型酶標(biāo)儀（山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司）、BL2200H 型電子天平（日本Shimadzu 公司）、9700 型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）、Lodigit 型WB 凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

熟地黃、黨參、菟絲子、丹參、杜仲、北沙參、白芍、當(dāng)歸、柴胡藥材（批號(hào)均為101018）均購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，由江西省婦幼保健院中藥房劉迎新副主任中藥師鑒定均為真品；環(huán)磷酰胺（批號(hào)756230，純度≥99%）購(gòu)自北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蘇木精-伊紅染液（批號(hào)G1120）和TRIzol 試劑（批號(hào)15596-026）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為ER0960、ER1123）均購(gòu)自武漢恩菲生物科技有限公司；抗苗勒氏管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）ELISA 試劑盒（批號(hào)E-EL-M3015）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；雌激素（estrogen，E2）ELISA 試劑盒（批號(hào)20201214）購(gòu)自上海研啟生物科技有限公司；鼠源HIF-1α、Bnip3、Beclin1 單克隆抗體（批號(hào)分別為ab179483、ab109362、ab254511）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（批號(hào)S0131S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)4374966）購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；戊酸雌二醇片（批號(hào)201710BJ125，規(guī)格1 mg/片）購(gòu)自拜爾醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司；HIF-1α轉(zhuǎn)錄抑制劑YC-1（批號(hào)Y1027）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G 二抗和鼠源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)分別為20181225、16AF0207）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 成年雌性大鼠140 只，7～8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（浙）2019-0002。所有大鼠飼養(yǎng)在無(wú)菌環(huán)境中，溫度約為27 ℃，相對(duì)濕度約為55%，自由進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)2020JXFYKY06013）。

2 方法

2.1 加減益經(jīng)湯的制備

取熟地黃、黨參、菟絲子藥材各20 g，丹參、杜仲、北沙參藥材各15 g，白芍、當(dāng)歸藥材各10 g，柴胡藥材6 g，加水沒(méi)過(guò)藥材并共同煎煮1 h，取濾液，然后將其濃縮成高、中、低質(zhì)量濃度[2.36、1.18、0.59 g/mL（以生藥量計(jì)）]的藥液，裝瓶冷卻后，低溫儲(chǔ)藏。

2.2 分組、造模與給藥

通過(guò)觀察陰道脫落細(xì)胞切片對(duì)比大鼠的動(dòng)情周期情況。挑選動(dòng)情周期正常的大鼠140 只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、抑制劑組和加減益經(jīng)湯低、中、高劑量組，每組20只。大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，對(duì)照組大鼠股靜脈注射等體積生理鹽水，其余各組大鼠股靜脈注射環(huán)磷酰胺（75 mg/kg）1 mL 復(fù)制DOR 模型[12]。注射結(jié)束24 h 后根據(jù)陰道脫落細(xì)胞切片觀察大鼠動(dòng)情周期情況，動(dòng)情周期≥6 d 或停滯在某一時(shí)期≥3 d 者，視為動(dòng)情周期紊亂，表示DOR 造模成功。造模成功2 h 后，加減益經(jīng)湯低、中、高劑量組大鼠灌胃加減益經(jīng)湯（5.9、11.8、23.6 g/kg）[13]，抑制劑組大鼠灌胃加減益經(jīng)湯23.6 g/kg 并同時(shí)股靜脈注射YC-1（2 mg/kg），陽(yáng)性對(duì)照組大鼠灌胃戊酸雌二醇片0.09 mg/kg，對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每日給藥1次，連續(xù)8周。

2.3 動(dòng)情周期觀察

藥物干預(yù)24 h 后，以生理鹽水濕潤(rùn)消毒棉簽后，插入大鼠陰道深約0.5 cm，旋轉(zhuǎn)一周，將棉簽上的分泌物均勻涂抹于載玻片并晾干，滴加多聚甲醛固定15 min，蘇木精浸染5 min，鹽酸乙醇分化10 s，伊紅染色20 s，流水沖洗后干燥封片，在顯微鏡下觀察脫落細(xì)胞形態(tài)，評(píng)價(jià)各組大鼠動(dòng)情周期變化。

2.4 卵巢指數(shù)和病理學(xué)觀察

藥物干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠稱定質(zhì)量后禁食12 h，麻醉后剪開腹腔，分離卵巢并稱定質(zhì)量，計(jì)算卵巢指數(shù)[卵巢指數(shù)＝卵巢濕質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%]，然后將大鼠部分卵巢組織制成石蠟切片，采用蘇木精-伊紅染色后，在顯微鏡下觀察其病理學(xué)變化。

2.5 卵巢細(xì)胞自噬情況觀察

取大鼠病理學(xué)觀察剩余的部分卵巢，去除周圍脂肪組織，低倍鏡下用25 號(hào)針頭刺破卵泡，分離卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞，吹打使細(xì)胞分離，200 目網(wǎng)篩過(guò)濾，以800 r/min 離心10 min，棄上清，收集細(xì)胞。24 h 后細(xì)胞消化后爬片，用乙醇及丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透、包埋，切片（厚50～60 nm），以醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，于透射電鏡下觀察自噬情況。

2.6 血清激素水平檢測(cè)

抽取各組大鼠腹腔主動(dòng)脈血5 mL，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，按ELISA試劑盒方法，檢測(cè)血清中FSH、LH、AMH、E2水平。

2.7 卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot 法檢測(cè)。取各組大鼠部分卵巢組織，提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加熱變性5 min 后，取部分變性后的蛋白樣品，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入HIF-1α、Bnip3、Beclin1、β-actin 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜；用TBST 緩沖液洗滌3 次，加入HRP 標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫下孵育1 h，顯色顯影，通過(guò)Image J v1.8.0 軟件分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.8 卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1 mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)。取各組大鼠部分卵巢組織于勻漿器中，加入TRIzol試劑提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書要求，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增。引物采用PyroMark Assay Design 2.0軟件設(shè)計(jì)，由美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司合成，引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。以β-actin為內(nèi)參，采用2－ΔΔCT法計(jì)算HIF-1α、Bnip3、Beclin1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠動(dòng)情周期比較

對(duì)照組大鼠表現(xiàn)出規(guī)律的動(dòng)情周期；模型組和抑制劑組大鼠動(dòng)情周期均出現(xiàn)紊亂，主要表現(xiàn)為不同程度的動(dòng)情周期延長(zhǎng)，每次5～9 d，甚至未見完整的動(dòng)情周期；陽(yáng)性對(duì)照組和加減益經(jīng)湯各劑量組大鼠動(dòng)情周期恢復(fù)正常，每次4～5 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組有41.6%的大鼠停止動(dòng)情8 d后自然恢復(fù)正常動(dòng)情周期，58.4%的大鼠未能恢復(fù)正常動(dòng)情周期。

3.2 大鼠卵巢指數(shù)比較

如圖1所示，相較于對(duì)照組大鼠，模型組和各給藥組大鼠卵巢指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；相較于模型組大鼠，陽(yáng)性對(duì)照組和加減益經(jīng)湯各劑量組大鼠卵巢指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠卵巢指數(shù)的比較（，n＝20）

3.3 大鼠卵巢組織病理形態(tài)比較

如圖2所示，對(duì)照組大鼠卵巢組織內(nèi)卵泡數(shù)量豐富，卵細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞排列整齊，黃體數(shù)量多且發(fā)育完好；模型組大鼠卵巢組織內(nèi)卵泡數(shù)量較少，卵細(xì)胞皺縮或消失，細(xì)胞排列紊亂，黃體數(shù)量少且發(fā)育較差；抑制劑組大鼠卵巢髓質(zhì)雖有萎縮但皮質(zhì)增生不明顯，間質(zhì)纖維化程度較模型組輕；相較于模型組大鼠，陽(yáng)性對(duì)照組和加減益經(jīng)湯各劑量組大鼠卵巢組織成熟卵泡增多，黃體增多，病理情況均有所改善。

圖2 各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)（×40）

3.4 大鼠卵巢細(xì)胞自噬情況比較

如圖3所示，對(duì)照組大鼠卵巢細(xì)胞核較大，染色質(zhì)分布均勻，細(xì)胞器明顯；模型組和抑制劑組大鼠卵巢細(xì)胞核變小，染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡化，可以觀察到自噬溶酶體；相較于模型組大鼠，陽(yáng)性對(duì)照組和加減益經(jīng)湯各劑量組大鼠卵巢細(xì)胞自噬情況均有所改善。

圖3 各組大鼠卵巢細(xì)胞自噬情況（×25 000）

3.5 大鼠血清激素水平比較

如表2所示，相較于對(duì)照組大鼠，模型組大鼠血清中FSH、LH 水平均顯著升高，AMH、E2水平均顯著降低（P＜0.05）；相較于模型組大鼠，陽(yáng)性對(duì)照組和加減益經(jīng)湯各劑量組大鼠血清中FSH、LH 水平均顯著降低，AMH、E2水平均顯著升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清激素水平比較（，n＝20）

表2 各組大鼠血清激素水平比較（，n＝20）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

3.6 大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

如表3、圖4 所示，相較于對(duì)照組大鼠，模型組大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；相較于模型組大鼠，陽(yáng)性對(duì)照組、抑制劑組和加減益經(jīng)湯中、高劑量組大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），加減益經(jīng)湯低劑量組大鼠卵巢組織中Beclin1 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 各組大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n＝20）

表3 各組大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n＝20）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

3.7 大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

如表4所示，相較于對(duì)照組大鼠，模型組大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；相較于模型組大鼠，陽(yáng)性對(duì)照組和加減益經(jīng)湯中、高劑量組大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，抑制劑組和加減益經(jīng)湯低劑量組大鼠卵巢組織中HIF-1α、Beclin1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1 mRNA表達(dá)比較（，n＝20）

表4 各組大鼠卵巢組織中HIF-1α、Bnip3、Beclin1 mRNA表達(dá)比較（，n＝20）

a：與對(duì)照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

4 討論

DOR是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且持續(xù)性進(jìn)展的疾病，近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)升高，若不加以干預(yù)，其將發(fā)展為卵巢功能不全或卵巢早衰，進(jìn)一步加大治療難度。整體觀念、辨證論治的中醫(yī)思想在調(diào)節(jié)身體機(jī)能方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，可通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路共同改善DOR患者卵巢功能障礙。DOR 的臨床癥狀在中醫(yī)上歸于閉經(jīng)、血枯、不孕癥等范疇，腎藏精、主生殖，中醫(yī)認(rèn)為卵細(xì)胞的正常發(fā)育及排出均依靠腎氣旺盛，腎虛則會(huì)導(dǎo)致卵細(xì)胞發(fā)育或排出受阻，無(wú)法受孕，因此中醫(yī)治療時(shí)多以補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血為治療原則；并且臨床研究結(jié)果也顯示，補(bǔ)腎類中藥或湯劑對(duì)卵巢功能的改善作用明顯[14－15]。這提示深入研究補(bǔ)腎方對(duì)DOR的臨床治療具有重要意義。

加減益經(jīng)湯在益經(jīng)湯基礎(chǔ)上增強(qiáng)了補(bǔ)腎作用，同時(shí)兼顧健脾疏肝、補(bǔ)血活血、清養(yǎng)心肺之效，調(diào)養(yǎng)腎、脾、肝三經(jīng)，全方補(bǔ)而不膩、疏不耗正。李麗美等[16]通過(guò)構(gòu)建DOR 大鼠模型研究加減益經(jīng)湯對(duì)其影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加減益經(jīng)湯能夠改善DOR 模型大鼠的性激素水平，改善其卵巢組織病理形態(tài)。卵巢功能降低會(huì)降低血清中E2的水平，同時(shí)降低卵泡對(duì)FSH、LH 的敏感度，而為提高FSH、LH的作用效率，垂體代償性分泌大量FSH 與LH，機(jī)體內(nèi)FSH、LH水平明顯升高，因此FSH、LH與E2含量常用來(lái)評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能[12]。AMH 是在卵巢中產(chǎn)生的一種蛋白激素，與卵巢功能密切相關(guān)且其水平不易受外來(lái)因素干擾，因此AMH 也是評(píng)價(jià)卵巢儲(chǔ)備功能的重要指標(biāo)[16]。已有研究報(bào)道，加減益經(jīng)湯能明顯緩解DOR患者的臨床癥狀、改善其卵巢功能[17－18]。本研究以環(huán)磷酰胺所致DOR 模型大鼠為對(duì)象，研究加減益經(jīng)湯對(duì)其改善作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模成功后的大鼠動(dòng)情周期紊亂、卵巢指數(shù)明顯下降、卵巢組織形態(tài)出現(xiàn)病理變化，血清中FSH、LH 含量增加，AMH 及E2含量減少，以上特征均符合DOR的病理特征，提示DOR模型成功構(gòu)建；經(jīng)加減益經(jīng)湯干預(yù)后，模型大鼠的動(dòng)情周期逐漸恢復(fù)正常，上述病理特征均有所改善，提示加減益經(jīng)湯可調(diào)節(jié)DOR 模型大鼠的性激素分泌、改善其卵巢功能。

DOR 的治療難點(diǎn)在于無(wú)法針對(duì)其發(fā)病機(jī)制采取有效干預(yù)手段。機(jī)體細(xì)胞在程序性死亡、能量代謝等生理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生缺氧的應(yīng)激反應(yīng)，例如卵泡發(fā)育時(shí)，基底屏障使血管無(wú)法向卵泡內(nèi)部進(jìn)行滲透，卵泡內(nèi)部形成低氧環(huán)境，不利于卵泡及卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育[19]。有研究指出，HIF-1α與卵泡質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，HIF-1α水平能在一定程度上反映卵泡質(zhì)量[20]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠卵巢組織中HIF-1α蛋白以及mRNA 水平均高于對(duì)照組，提示卵巢組織可能處于缺氧狀態(tài)并影響卵泡發(fā)育；經(jīng)加減益經(jīng)湯干預(yù)后的DOR 模型大鼠卵巢組織中的HIF-1α蛋白以及mRNA水平降低，提示加減益經(jīng)湯可改善DOR模型大鼠缺氧狀態(tài)。缺氧使HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)大量積攢，與細(xì)胞核內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子1β結(jié)合形成二聚體，刺激其靶蛋白Bnip3表達(dá)；Bnip3與Beclin1相互競(jìng)爭(zhēng)地與B淋巴細(xì)胞瘤2基因結(jié)合，Beclin1與B淋巴細(xì)胞瘤2基因解離誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬[21]，因此HIF-1α/Bnip3/Beclin1是細(xì)胞內(nèi)缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的重要通路。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠卵巢組織中Bnip3、Beclin1 蛋白以及mRNA水平均顯著高于對(duì)照組，提示缺氧可激活Bnip3/Beclin1 通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而造成組織損傷；經(jīng)加減益經(jīng)湯干預(yù)后DOR 模型大鼠卵巢組織中的Bnip3、Beclin1 蛋白及mRNA 水平均有所下降，但抑制劑組較加減益經(jīng)湯中、高劑量組的上述指標(biāo)均出現(xiàn)上升，表明抑制劑可能會(huì)干擾加減益經(jīng)湯抑制HIF-1α/Bnip3/Beclin1通路。電鏡結(jié)果也顯示，經(jīng)加減益經(jīng)湯干預(yù)后，卵巢細(xì)胞自噬改善，說(shuō)明加減益經(jīng)湯可能通過(guò)改變?nèi)毖鯒l件來(lái)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞自噬過(guò)程，從而改善卵巢功能。

綜上所述，加減益經(jīng)湯能夠改善DOR 模型大鼠卵巢功能、調(diào)節(jié)性激素分泌、保護(hù)卵巢組織，其作用機(jī)制可能與抑制HIF-1α/Bnip3/Beclin1通路相關(guān)。