補腎活血方調(diào)節(jié)卵巢儲備功能下降大鼠生殖激素水平的實驗研究

趙井苓 王娟 蕭閔 謝莉 李成銀 秦丹梅

〔摘要〕 目的 探討補腎活血方對卵巢儲備功能下降（diminished ovarian reserve， DOR）大鼠生殖激素水平及卵巢組織形態(tài)的影響。方法 采用Ataya法復制DOR大鼠模型。隨機分為6組，每組10只?？瞻捉M不予處理;模型組給予蒸餾水;戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇水溶液（90 μg/kg），補腎活血方低、中、高劑量組給予補腎活血方水煎劑（7.875、15.750、31.500 g/kg）。按大鼠體質(zhì)量1 mL/100 g的容積灌胃，每日1次，共14 d。每天觀察并記錄各組大鼠一般生理反應。造模結(jié)束7 d后，從第8天開始，每日早上9點抓取各組大鼠，行陰道涂片觀察。14 d治療結(jié)束后，HE染色光鏡下觀察卵巢組織的形態(tài)，ELISA法檢測血清中卵泡刺激素、黃體生成素、雌二醇及抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）的含量。結(jié)果 在增加DOR模型大鼠卵泡計數(shù)上，補腎活血方高劑量組優(yōu)于戊酸雌二醇組（P<0.05），也優(yōu)于補腎活血方低劑量組（P<0.05）;在調(diào)節(jié)AMH上，補腎活血方高、中劑量組優(yōu)于戊酸雌二醇組（P<0.05），更優(yōu)于補腎活血方低劑量組（P<0.01）。結(jié)論 補腎活血方可能通過增加DOR模型大鼠卵泡數(shù)、提高AMH水平、促進性激素分泌、調(diào)節(jié)動情周期，進而改善DOR模型大鼠的卵巢儲備功能。

〔關(guān)鍵詞〕 補腎活血方;卵巢儲備功能;卵泡數(shù);動情周期;性激素

〔中圖分類號〕R271.9 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.010

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Bushen Huoxue Decoction on the levels of reproductive hormones and ovarian tissue morphology in diminished ovarian reserve （DOR） rats. Methods The DOR rat model was established by Ataya method. They were randomly divided into six groups， with 10 rats in each group. Blank group was not treated; model group was given distilled water; estradiol valerate group was given estradiol valerate solution （90 μg/kg）; Bushen Huoxue Decoction low， middle and high dose groups were given Bushen Huoxue Decoction （7.875， 15.750， 31.500 g/kg）. The rats were fed intragastrically according to the volume of 1 mL/100 g of body weight. The rats were given intragastric administration once a day for 14 days. The general physiological responses of rats were observed and recorded every day. After 7 days of modeling， from day 8， each group of rats was captured at 9 o'clock every morning for vaginal smear observation. After 14 days of treatment， the morphology of ovarian tissue was observed under light microscopy with HE staining， and the content of follicle stimulating hormone， luteinizing hormone， estradiol and anti-Müllerian hormone （AMH） in serum was detected by ELISA. Results In increasing the follicle count of DOR model rats， Bushen Huoxue Decoction high dose group was better than estradiol valerate group （P<0.05）， and also better than Bushen Huoxue Decoction low dose group （P<0.05）; in the regulation of AMH， the high and medium dose groups of Bushen Huoxue Decoction were better than the estradiol valerate group （P<0.05）， and better than the low dose group of Bushen Huoxue Decoction （P<0.01）. Conclusion Bushen Huoxue Decoction may increase the number of follicles in DOR model rats， increase the level of AMH， promote the secretion of sex hormones， and regulate the estrous cycle， thereby improving the ovarian reserve of DOR model rats.

〔Keywords〕 Bushen Huoxue Decoction; ovarian reserve function; number of follicles; estrous cycle; sex hormones

卵巢儲備功能（ovarian reserve， OR）是指卵巢皮質(zhì)區(qū)卵泡生長、發(fā)育、形成卵子、排出卵子以及具有分泌性激素的能力。中醫(yī)認為卵巢儲備功能下降（diminished ovarian reserve， DOR）以腎氣虧虛、氣滯血瘀等為其主要病因病機，治療上多以補腎、活血等為原則[1-4]。

本課題組前期開展了補腎活血方的系列臨床科研課題[1-2]，顯示出該方在DOR治療上的優(yōu)勢，但作用機制尚不清楚。為此，本研究采用Ataya法注射環(huán)磷酰胺復制大鼠DOR的模型，觀察補腎活血方對大鼠生殖激素水平和卵巢組織形態(tài)的影響，探明其作用機制，為臨床研究提供科學依據(jù)，也為下一步研究有效藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 ?實驗動物

SPF級SD雌性大鼠（10周）80只，體質(zhì)量（200±20） g，購于三峽大學動物實驗中心，許可證號：SCXK（鄂）2017-0012，飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（鄂）2017-0067。單籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度（20±2） ℃，相對濕度（60±10）%，通風良好，自然晝夜節(jié)律光照，給予足夠的水和食物。實驗開始前所有大鼠先適應性喂養(yǎng)1周后再進行實驗，各項操作均符合動物倫理相關(guān)規(guī)定。

1.2 ?藥品與試劑

補腎活血方：由炙黃芪15 g，菟絲子20 g，補骨脂15 g，山茱萸10 g，熟地黃10 g，山藥20 g，白芍15 g，益母草15 g，當歸15 g，丹參10 g，香附10 g，川芎10 g，甘草10 g組成。補腎活血方所有藥物由湖北中醫(yī)藥大學黃家湖醫(yī)院藥房提供，根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[5]要求煎煮補腎活血方。同法煎煮3份藥液，分別將所得藥液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮至相當于原藥材0.5、1、2 g/mL，冷卻后置于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

戊酸雌二醇片（法國DELPHARM Lille S.A.S.，批號：492A），以生理鹽水配成90 mg/mL，冷卻后置于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

HE染色試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：G1001）;卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone， FSH）ELISA試劑盒（批號：JYM0597Ra）、黃體生成素（luteinizing hormone， LH）ELISA試劑盒（批號：JYM0623Ra）、雌二醇（estradiol 2， E2）ELISA試劑盒（批號：JYM0608Ra）、抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）ELISA試劑盒（批號：JYM00083Ra）均購自武漢基因美生物科技有限公司。

1.3 ?主要實驗儀器

離心機（型號：CR21G，日本日立公司）;組織脫水機（型號：Excelsior AS，美國賽默飛世爾科技公司）;切片機（型號：ZQP-86，上海之信儀器有限公司）;電子顯微鏡（型號：BX60，日本奧林巴斯公司），酶標儀（型號：Multiskan FC，美國Thermo公司）。

2 方法

2.1 ?動物造模、分組及給藥治療

SD雌性大鼠隨機分為正常對照組（空白組）10只、造模組70只。采用Ataya法造模，以90 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺生理鹽水溶液復制大鼠DOR的模型[6]，空白組大鼠同法注射等量的生理鹽水，于造模后第2天對各組大鼠進行陰道涂片觀察，連續(xù)觀察5 d，若陰道上皮細胞2個性周期以上仍無動情周期變化或周期延長（>6 d），提示動情周期紊亂，說明造模成功。

最終有68只造模成功，將成功模型大鼠隨機選取50只，分為模型組、陽性藥物對照組（戊酸雌二醇組），補腎活血方高、中、低劑量組，每組10只。連同空白組10只，編號后進入下一步實驗。

給藥方式：按大鼠體質(zhì)量1 mL/100 g的容積灌胃，每日1次，共灌胃14 d。模型組給予相應容積的蒸餾水，戊酸雌二醇組給予相應容積的戊酸雌二醇水溶液（90 mg/kg）。補腎活血方給藥劑量根據(jù)藥物組成，計算總質(zhì)量為175 g，相當于成人劑量為2.5 g/kg，以200 g左右大鼠為例，換算成大鼠的臨床等效劑量為15.75 g/kg，高、中、低劑量組設置分別為2倍、1倍、1/2臨床等效劑量，因此，將所制備的受試物濃縮至2、1、0.5 g/mL，進行等體積灌胃，按31.500、15.750、7.875 g/kg的劑量給藥。

2.2 ?指標檢測

2.2.1 ?各組大鼠的一般生理情況比較 ?每天觀察并記錄各組大鼠一般生理反應，包括毛發(fā)、掉毛情況、精神、活動、飲水量、飲食量、體質(zhì)量變化情況等。

2.2.2 ?陰道涂片鏡下觀察各組大鼠的動情周期 ?造模結(jié)束7 d后，從第8天開始，每日早上9點抓取各組大鼠，行陰道涂片觀察。以顯微鏡觀察脫落細胞的變化作為判斷大鼠的動情周期的依據(jù)。動情周期包括動情前期、動情期、動情后期以及動情間期這4個時期[7]，動情前期：大量的有核上皮細胞和少量白細胞;動情期：大量的角質(zhì)化、大而無規(guī)則的無核上皮細胞;動情后期：有核上皮細胞、角質(zhì)化上皮細胞和白細胞均勻存在;動情間期：大量白細胞和少量角質(zhì)化上皮細胞，記錄大鼠的動情周期變化。計算每組大鼠動情周期率：動情周期率=動物周期正常只數(shù)/每組總只數(shù)×100%。

2.2.3 ?HE染色光鏡下觀察卵巢組織的形態(tài) ?14 d治療結(jié)束后，用3%戊巴比妥鈉溶液以3 mL/kg的劑量麻醉大鼠，腹主動脈取血，分離血清置于-80 ℃冰箱保存待測;之后迅速分離卵巢組織，置于生理鹽水沖洗后，置多聚甲醛固定液中浸泡1周。將上述固定后的卵巢組織，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度為0.04 μm）、HE染色后，光鏡下觀察兩個卵巢組織中總卵泡數(shù)量，包括卵巢初級卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)、總卵泡數(shù)。

2.2.4 ?ELISA法檢測血清中FSH、LH、E2及AMH的含量 ?取上述待測血清，室溫復融后，按照ELISA試劑盒步驟操作，檢測血清FSH、LH、E2及AMH的含量。

2.3 ?統(tǒng)計學方法

圖片分析采用Image J軟件分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 20.0軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)采用“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 ?各組大鼠的一般生理情況

空白組大鼠毛色光亮、沒有出現(xiàn)明顯掉毛現(xiàn)象、精神佳、活動可、飲水飲食正常，體質(zhì)量呈逐漸增長趨勢;模型組、補腎活血方低、中、高劑量組及戊酸雌二醇組大鼠初期均出現(xiàn)不同程度的掉毛、精神欠佳、食欲減退、飲水減少等表現(xiàn)，經(jīng)治療后一般情況逐漸恢復，其中以補腎活血方中劑量組變化最為明顯，更加接近空白組。

3.2 ?陰道涂片鏡下觀察各組大鼠的動情周期

與空白組比較，模型組大鼠動情周期紊亂，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，補腎活血方高、中、低劑量組及戊酸雌二醇組均能改善動情周期，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;補腎活血方低、中、高劑量組與戊酸雌二醇組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1、表1。

3.3 ?HE染色光鏡下觀察卵巢組織的形態(tài)及卵泡計數(shù)

HE染色光鏡下觀察卵巢組織的形態(tài)顯示：空白組卵巢體積大，可見各級卵泡分布，黃體發(fā)育正常，血管豐富;模型組可見卵巢體積縮小，未見黃體，卵泡總數(shù)減少，卵泡排列紊亂;補腎活血方高、低劑量組及戊酸雌二醇組可見卵巢略有萎縮，卵泡數(shù)略有增多，黃體數(shù)量略少，卵母細胞顆粒層數(shù)較多，卵泡排列稍有紊亂;補腎活血方中劑量組卵巢體積大小基本正常，各級卵泡數(shù)均勻分布，卵母顆粒細胞層次較多。見圖2。

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織中原始卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)、總卵泡數(shù)明顯減少，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與模型組比較，戊酸雌二醇組、補腎活血方高、中、低劑量組原始卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)、總卵泡數(shù)增多（P<0.05或P<0.01）。與戊酸雌二醇組比較，補腎活血方高劑量組原始卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)、總卵泡數(shù)增多（P<0.05）。與補腎活血方高劑量組比較，補腎活血方低劑量組原始卵泡數(shù)、成熟卵泡數(shù)、總卵泡數(shù)較少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01）。見表2。

3.4 ?ELISA法檢測血清中FSH、LH、E2的含量

與空白組比較，模型組血清FSH、LH含量升高（P<0.01），E2含量降低（P<0.01）。與模型組比較，戊酸雌二醇組、補腎活血方高、中、低劑量組血清FSH、LH含量降低（P<0.05），E2含量升高（P<0.05或P<0.01）。與戊酸雌二醇組比較，補腎活血方高、中、低劑量組在性激素水平上，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表3。

3.5 ?ELISA法檢測血清中AMH的含量比較

與空白組比較，模型組血清AMH含量降低（P<0.01）。與模型組比較，補腎活血方高、中劑量組及戊酸雌二醇組AMH含量均升高（P<0.01）;與補腎活血方低劑量組比較，補腎活血方高、中劑量組AMH含量均升高（P<0.01）。見表4。

4 討論

DOR是臨床上常見的導致女性不孕的原因之一，DOR患者常伴激素水平異常，如FSH、LH升高、E2、AMH下調(diào)，這些變化很好地反映了卵巢儲備功能，常被用作評估DOR的重要指標[8-9]。FSH以及LH是直接作用卵巢皮層的促性腺激素，間接發(fā)揮調(diào)節(jié)卵巢功能的作用[10]。卵巢功能衰退時，F(xiàn)SH、LH含量升高，卵泡數(shù)量和雌激素則會減少，卵泡和卵子的生長發(fā)育則會受到遏制[11]。AMH主要由竇前和早期竇狀卵泡顆粒細胞表達，并在接下來發(fā)育至成熟卵泡或閉鎖的階段逐漸減少，通過抑制顆粒細胞芳香化酶活性、減少LH受體數(shù)目等途徑調(diào)節(jié)卵泡生長發(fā)育。血AMH水平下降與卵巢儲備降低密切相關(guān)，低水平AMH 及其在特定時期迅速下降的特征是卵巢儲備功能不足的標志[12-13]。本研究采用Ataya法注射環(huán)磷酰胺復制大鼠DOR的模型，檢測結(jié)果顯示大鼠血清中FSH、LH水平增高、E2和AMH水平下降、成熟卵泡以及原始卵泡數(shù)明顯減少，與文獻[14-15]研究一致。

中醫(yī)學認為腎虛血瘀為DOR的最主要病機，其特點為腎虛為本、血瘀為標、本虛標實、虛實夾雜[1-3]。因此，將補腎活血作為治療DOR的重要治法，貫穿本病發(fā)生發(fā)展的始終。補腎活血方以炙黃芪、菟絲子補腎為君。臣以熟地黃、山萸肉、山藥、補骨脂協(xié)助君藥補益肝腎，佐以當歸、川芎、丹參、白芍、益母草、香附行氣活血調(diào)經(jīng)。甘草為使，調(diào)和諸藥。縱觀全方，補腎與活血諸藥相配，相輔相成，共奏補腎活血之效。研究[2-3]表明補腎活血方能溫腎陽，益腎精，補腎氣，養(yǎng)血活血，維持腎-天癸-沖任-胞宮軸穩(wěn)定，從而達到干預性治療目的;研究[16]顯示補腎活血方可進一步改善患者卵巢組織血液循環(huán)、增強卵巢排卵功能，從而改善患者的臨床癥狀，對于腎虛血瘀所致的DOR療效顯著。根據(jù)該方的作用機制，補腎活血方可能通過調(diào)節(jié)腎-天癸-沖任-胞宮軸而改善DOR卵巢儲備功能。

本實驗研究結(jié)果顯示，與模型組比較，給予補腎活血方治療后，大鼠的生理活動基本恢復，紊亂的動情周期得到改善（P<0.01）;成熟卵泡數(shù)量、總卵泡數(shù)量增加，且性激素水平明顯改善，如血清FSH、LH含量降低，AMH、E2含量升高（P<0.05或P<0.01）。這些情況的改善與西藥戊酸雌二醇療效相當（P>0.05）。補腎活血方高、中劑量組在調(diào)節(jié)AMH上優(yōu)于戊酸雌二醇組（P<0.05），更優(yōu)于補腎活血方低劑量組（P<0.01）。這也正是我們臨床上常見的現(xiàn)象：雌激素在改善患者癥狀上效果顯著，但對增加卵泡數(shù)量方面效果有限。通過本研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血方能夠增加DOR模型大鼠卵泡數(shù)，改善DOR模型大鼠的激素水平，進而調(diào)節(jié)動情周期，從而有效改善DOR模型大鼠的卵巢儲備功能。

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