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    活血化瘀法對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎模型兔基質(zhì)金屬蛋白酶的影響

    2021-08-23 01:20:35余毅張婷熊逸嘯向振歐廣洋潘波劉劍徐儀昕劉雅娟李梅琪余望貽
    關(guān)鍵詞:基質(zhì)金屬蛋白酶活血化瘀膝骨性關(guān)節(jié)炎

    余毅 張婷 熊逸嘯 向振 歐廣洋 潘波 劉劍 徐儀昕 劉雅娟 李梅琪 余望貽

    〔摘要〕 目的 研究活血化瘀法對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎模型兔基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)的影響。方法 將32只新西蘭兔分為對(duì)照組、模型組、中藥組、陽(yáng)性藥組,每組8只。采用改良Hulth造模法建立兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型,給予藥物治療28 d。中藥組給予活血化瘀合劑(1.4 g/kg),陽(yáng)性藥組給予硫酸氨基葡萄糖溶液(0.07 mg/kg),對(duì)照組及模型組給予等體積蒸餾水。給藥結(jié)束后,取兔右后膝關(guān)節(jié)軟骨行HE染色,用于組織病理分析;收集關(guān)節(jié)液,采用ELISA法檢測(cè)MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量;采用Western blot和RT-qPCR法分別檢測(cè)兔關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白及mRNA水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較,模型組兔關(guān)節(jié)軟骨存在淺表層纖維化,軟骨細(xì)胞成簇、排列無(wú)規(guī)則、部分壞死,滑膜增厚,基質(zhì)染色丟失等病理現(xiàn)象,關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量較對(duì)照組顯著升高(P<0.01),其蛋白及mRNA表達(dá)在關(guān)節(jié)軟骨中也顯著上升(P<0.01);與模型組比較,中藥組兔關(guān)節(jié)軟骨病理?yè)p傷得以緩解,關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量明顯下降(P<0.01或P<0.05),關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-9蛋白及mRNA表達(dá)均下調(diào)(P<0.01),MMP-13 mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.05);與中藥組比較,陽(yáng)性藥組MMP-13 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 活血化瘀法能緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨的損傷,其機(jī)制可能與抑制MMPs的表達(dá),尤其是MMP-3和MMP-9表達(dá)有關(guān)。

    〔關(guān)鍵詞〕 膝骨性關(guān)節(jié)炎;活血化瘀;基質(zhì)金屬蛋白酶;關(guān)節(jié)軟骨;關(guān)節(jié)液

    〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R255.6 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.005

    〔Abstract〕 Objective To study the effects of Huoxue Huayu method on matrix metalloproteinase (MMPs) in rabbit model of knee osteoarthritis. Methods 32 New Zealand rabbits were divided into control group, model group, Chinese medicine group and positive drug group, with 8 rats in each group. A rabbit model of knee osteoarthritis was established by modified Hulth modeling method, followed by drug treatment for 28 days. The Chinese medicine group was given Huoxue Huayu Mixture (1.4 g/kg), the positive drug group was given glucosamine sulfate solution (0.07 mg/kg), and the control group and the model group were given equal volume of distilled water. At the end of the administration, rabbit right posterior knee articular cartilage was taken for histopathological analysis through HE staining, and the content of MMP-3, MMP-9 and MMP-13 of synovial fluid was detected by ELISA; Western blot and RT-qPCR were used to detect MMP-3, MMP-9, MMP-13 protein and mRNA levels in rabbit articular cartilage. Results There were superficial fibrosis in the articular cartilage of rabbits in the model group compared with the control group, the chondrocytes were clustered, arranged irregularly, partially necrotic, thickened synovial, and lost in matrix staining, the content of MMP-3, MMP-9 and MMP-13 in synovial fluid was higher than control group (P<0.01), and the protein and mRNA expression in the articular cartilage also increased significantly (P<0.01); compared with the model group, the pathological damage of rabbit articular cartilage of Chinese medicine group was relieved, and the content of MMP-3, MMP-9 and MMP-13 in joint fluid decreased significantly (P<0.01 or P<0.05), articular cartilage MMP-3, MMP-9 protein and mRNA expression were down-regulated (P<0.01), and MMP-13 mRNA expression was down-regulated (P<0.05); compared with the Chinese medicine group, MMP-13 mRNA expression in positive drug group was down-regulated (P<0.05). Conclusion Huoxue Huayu method can alleviate the damage of articular cartilage in rabbits with knee osteoarthritis model, and its mechanism may be related to the inhibition of MMPs expression, especially the expression of MMP-3 and MMP-9.

    〔Keywords〕 knee osteoarthritis; Huoxue Huayu; matrix metalloproteinase; articular cartilage; joint fluid

    膝骨性關(guān)節(jié)炎是由于膝關(guān)節(jié)局部損傷、炎癥或慢性勞損引起的軟骨變性及活動(dòng)障礙的慢性退行性骨關(guān)節(jié)病,在老年人中患病率高達(dá)50%[1]。軟骨組織損傷是膝骨性關(guān)節(jié)炎的重要病理特征,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)在軟骨基質(zhì)降解過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2-3]。因而,抑制MMPs表達(dá)能保護(hù)軟骨組織,恢復(fù)膝骨關(guān)節(jié)的正?;顒?dòng)。膝骨性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,氣滯血瘀是其主要病機(jī),治宜活血化瘀,基于此理法而成的消炎散是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑,已使用40余年,全方由近20味中藥組成,具活血涼血、散瘀止痛之功,臨床療效顯著[4]。本研究選用消炎散中主要的活血化瘀中藥“當(dāng)歸、赤芍、姜黃”組成活血化瘀合劑,通過(guò)建立膝骨性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型,明確活血化瘀法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用特點(diǎn),并以MMPs為切入點(diǎn),闡明其分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    32只SPF級(jí)健康新西蘭兔,體質(zhì)量2.0~2.5 kg,雌雄各半,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu),使用許可證號(hào)為SKYK(湘)2019-0009。

    1.2 ?實(shí)驗(yàn)藥物

    活血化瘀合劑藥物組成:當(dāng)歸10 g,赤芍10 g,姜黃10 g,原藥材均購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。全方煎煮2次,第1次加10倍量水、第2次加8倍量水,每次煎煮1.5 h,合并水煎液,濃縮至終質(zhì)量濃度為含生藥量1.3 g/mL,保存?zhèn)溆?。硫酸氨基葡萄糖(伊索佳)?gòu)自新興同仁藥業(yè)有限公司,批號(hào):18092602,規(guī)格:0.25 g×12粒,國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H20041317。

    1.3 ?主要試劑與儀器

    MMP-3、MMP-9、MMP-13 ELISA試劑盒(批號(hào):CSB-E09269Rb、CSB-E06933Rb、CSB-E14220Rb,武漢華美生物工程有限公司);MMP-3、MMP-9、MMP-13一抗(批號(hào):14351S、13667S、69926S,美國(guó)CST中國(guó)分公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào):740703,日本Takara有限公司);蘇木精、伊紅(批號(hào):ZLI-3301、ZLI-9613,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

    RM223切片機(jī)、DMi1倒置光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司);MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Themo中國(guó)有限公司);CFX96熒光定量PCR儀、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad生物科技有限公司)。

    1.4 ?動(dòng)物分組、造模與給藥

    將32只新西蘭兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、中藥組、陽(yáng)性藥組,每組8只。除對(duì)照組外,均采用改良的Hulth造模法建立兔膝骨性關(guān)節(jié)炎模型[5]。耳緣靜脈注射20%的烏拉坦(4 mL/kg)麻醉兔,固定,取右側(cè)后腿膝關(guān)節(jié),常規(guī)脫毛、消毒,使膝關(guān)節(jié)屈曲,沿兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路,使內(nèi)側(cè)副韌帶及前交叉韌帶完全離斷。經(jīng)前抽屜試驗(yàn)、內(nèi)側(cè)應(yīng)力試驗(yàn)驗(yàn)證韌帶完全離斷后,充分沖洗創(chuàng)口,逐層縫合,術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素。對(duì)照組不切開(kāi)關(guān)節(jié)囊,用鹽水沖洗后縫合。術(shù)后預(yù)防感染。造模后4周隨機(jī)挑選3只動(dòng)物進(jìn)行X線片檢查,X線下見(jiàn)兔右膝關(guān)節(jié)間隙變窄、關(guān)節(jié)面呈高密度影、關(guān)節(jié)周?chē)琴樞纬桑崾驹炷3晒5]。造模成功后開(kāi)始灌胃給藥,給藥量按照70 kg成人與1.5 kg兔體表面積等效換算(成人劑量×70 kg×0.07/1.5 g/kg)。中藥組給予臨床等效劑量的活血化瘀合劑(1.4 g/kg),陽(yáng)性藥組給予臨床等效劑量的硫酸氨基葡萄糖溶液(0.07 g/kg),對(duì)照組及模型組給予等體積蒸餾水,均持續(xù)給藥28 d。

    1.5 ?動(dòng)物處理

    實(shí)驗(yàn)過(guò)程中共有5只動(dòng)物死亡,其中模型組2只,中藥組2只,陽(yáng)性藥組1只。末次給藥完成后,采用空氣栓塞法處死動(dòng)物,取右后膝后髕上囊處常規(guī)脫毛,作長(zhǎng)約0.5 cm的縱形切口,用1 mL生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔3次后,收集關(guān)節(jié)液,而后切除右后膝關(guān)節(jié)軟骨,切斷軟骨,一半置于4%多聚甲醛中固定,一半保存于液氮中。

    1.6 ?HE染色觀察兔關(guān)節(jié)軟骨病理?yè)p傷情況

    取固定的兔關(guān)節(jié)軟骨,常規(guī)石蠟包埋后切片,經(jīng)脫蠟、水化后進(jìn)行HE染色,脫水、透明、封片,裝盒待用。于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照,分析病理?yè)p傷情況,并在光鏡下對(duì)切片進(jìn)行Mankin評(píng)分[6],Mankin評(píng)分用來(lái)評(píng)價(jià)軟骨組織病理變化程度,包含對(duì)軟骨結(jié)構(gòu)(0~6分)、軟骨細(xì)胞(0~3分)、基質(zhì)染色(0~3分)、潮線(0~1分)等方面的觀察判定,評(píng)分越高,提示軟骨受損程度越嚴(yán)重。每個(gè)樣本取3次評(píng)分的平均值。

    1.7 ?ELISA檢測(cè)兔關(guān)節(jié)液MMPs含量

    收集關(guān)節(jié)液后,于4 ℃、4 000 ?r/min條件下離心10 min(離心半徑6 cm),取上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的詳細(xì)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作,檢測(cè)右膝關(guān)節(jié)液中MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量。

    1.8 ?Western blot檢測(cè)兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMPs蛋白表達(dá)水平

    取兔關(guān)節(jié)軟骨組織,勻漿,測(cè)定總蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠,蛋白變性,上樣,SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,裁剪條帶,加入稀釋后的一抗(按1∶1 000稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜。洗滌條帶,加入二抗室溫下孵育4 h,洗滌條帶,化學(xué)發(fā)光法顯影。采用Image J成像軟件分析條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,計(jì)算關(guān)節(jié)軟骨中MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

    1.9 ?RT-qPCR檢測(cè)兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMPs mRNA表達(dá)水平

    取兔關(guān)節(jié)軟骨組織,加入Trizol試劑,勻漿,提取組織總RNA,并進(jìn)行含量檢測(cè)。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,之后進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因,擴(kuò)增條件為:95 ℃ 15 min預(yù)變性,95 ℃ 10 s變性,60 ℃ 30 s退火延伸,35個(gè)循環(huán),以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參。引物由深圳華大基因公司合成,序列見(jiàn)表1。

    1.10 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“x±s”表示,用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布,方差齊者采用單因素方差分析,多重比較用LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí)用TambaneS T2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ?各組兔關(guān)節(jié)軟骨HE染色情況

    對(duì)照組兔關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)清晰,表面光滑,細(xì)胞排列整齊,基質(zhì)染色基本均勻;模型組軟骨淺表層纖維化,軟骨細(xì)胞成簇、排列無(wú)規(guī)則、部分壞死,滑膜增厚,基質(zhì)染色丟失;中藥組及陽(yáng)性藥組關(guān)節(jié)軟骨表層偶見(jiàn)少量簇集的軟骨細(xì)胞,無(wú)細(xì)胞壞死,滑膜稍微增厚,基質(zhì)染色尚可。Mankin評(píng)分結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組、中藥組、陽(yáng)性藥組兔軟骨組織評(píng)分均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,中藥組及陽(yáng)性藥組評(píng)分顯著下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);中藥組與陽(yáng)性藥組比較,評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

    2.2 ?各組兔關(guān)節(jié)液MMPs含量比較

    與對(duì)照組比較,模型組、中藥組及陽(yáng)性藥組關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,中藥組及陽(yáng)性藥組關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、MMP-13含量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);中藥組與陽(yáng)性藥組比較,MMP-3、MMP-9、MMP-13含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

    2.3 ?各組兔關(guān)節(jié)軟骨MMPs蛋白表達(dá)水平比較

    與對(duì)照組比較,模型組及陽(yáng)性藥組關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平均顯著升高,中藥組MMP-3、MMP-13表達(dá)升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,中藥組MMP-3、MMP-9表達(dá)水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),MMP-13降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,陽(yáng)性藥組MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白表達(dá)水平顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);中藥組與陽(yáng)性藥組比較,MMP-3、MMP-9、MMP-13表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表4。

    2.4 ?各組兔關(guān)節(jié)軟骨MMPs mRNA表達(dá)水平比較

    與對(duì)照組比較,模型組、中藥組及陽(yáng)性藥組關(guān)節(jié)軟骨MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá)水平均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,中藥組及陽(yáng)性藥組MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與中藥組比較,陽(yáng)性藥組MMP-13 mRNA表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

    3 討論

    膝骨性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,與“痹病”“骨痹”類(lèi)似,是由于風(fēng)、寒、濕邪獨(dú)立或合而入侵致經(jīng)絡(luò)閉阻、氣血不通而發(fā)生。《素問(wèn)·痹論》云:“風(fēng)寒濕三氣雜至,合而為痹也?!痹摬《喟l(fā)于中老年人群,是由于其長(zhǎng)期勞損、氣血不足,累及筋骨關(guān)節(jié),致氣血不和、瘀血內(nèi)生、阻塞經(jīng)絡(luò)、瘀熱互結(jié),故而成痹。清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》中明確提出“痹有瘀血”,提示可用活血化瘀法治療痹證。課題組前期運(yùn)用活血化瘀法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎已取得良好的療效,以當(dāng)歸、赤芍、姜黃為主要活血化瘀藥物的消炎散治療瘀阻脈絡(luò)、氣滯血瘀型關(guān)節(jié)炎療效尤為明顯[7]。當(dāng)歸、赤芍是臨床常用的活血補(bǔ)血藥對(duì),當(dāng)歸味甘而重,氣輕而辛,專(zhuān)補(bǔ)血行血,為血中氣藥,又通經(jīng)活絡(luò),常用于治療瘀血腫痛、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛等;赤芍苦而微寒,善清熱涼血、散瘀止痛,主治瘀滯經(jīng)閉、脅痛、跌撲損傷;姜黃可破血行氣、通經(jīng)止痛,常用于跌打損傷。臨床與基礎(chǔ)研究均證實(shí),活血化瘀合劑對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎有良好的治療效果[8-9]。

    膝骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵病理特征之一是軟骨細(xì)胞的大量降解,而關(guān)節(jié)軟骨主要由細(xì)胞外基質(zhì)組成,抑制基質(zhì)降解和軟骨細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵[10]。MMPs是基質(zhì)合成和降解的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,其過(guò)量表達(dá)會(huì)加速軟骨基質(zhì)中蛋白聚糖的分解,并促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡,誘發(fā)疾病的發(fā)生[11]。MMP-9是與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生聯(lián)系最為緊密的MMPs亞型,其含量的異常升高與其組織金屬蛋白酶抑制劑水平的相對(duì)下降與骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨退變過(guò)程密切相關(guān)[12];同時(shí),MMP-3和MMP-13表達(dá)的異常在膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[13]。此外,MMP-1、MMP-7等亞型也被報(bào)道參與了膝骨疾病的發(fā)生[14-15]。由此可見(jiàn),MMPs多種亞型均參與了關(guān)節(jié)軟骨退變過(guò)程,但MMP-3、MMP-9和MMP-13可能在疾病發(fā)生過(guò)程中扮演了更為關(guān)鍵的角色。RYU JH等[16]研究發(fā)現(xiàn),炎癥因子在與其受體結(jié)合后會(huì)通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶相關(guān)通路,誘導(dǎo)軟骨組織釋放MMP-3、MMP-9及MMP-13,增加II型膠原和聚集蛋白聚糖的剪切和降解,破壞關(guān)節(jié)軟骨。

    本研究中,膝骨性關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨病理?yè)p傷明顯,軟骨細(xì)胞成簇肥大、排列紊亂、部分細(xì)胞凋亡甚至壞死,滑膜增厚。與對(duì)照組比較,模型組軟骨組織Mankin評(píng)分、關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)軟骨中MMPs含量均顯著升高(P<0.05或P<0.01);與模型組比較,中藥組及陽(yáng)性藥組軟骨組織Mankin評(píng)分、關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)軟骨中MMPs含量顯著下降(P<0.05或P<0.01)。硫酸氨基葡萄糖為天然的氨基單糖,是人體關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中合成蛋白聚糖的必需成分,臨床廣泛用于預(yù)防和治療各種類(lèi)型的骨性關(guān)節(jié)炎,研究[17-18]表明,硫酸氨基葡萄糖可參與抗氧化、抗炎,并抑制MMPs、氧化自由基的形成,預(yù)防糖皮質(zhì)激素及非甾體抗炎藥對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的損害。本研究結(jié)果也證實(shí),硫酸氨基葡萄糖能夠抑制膝骨性關(guān)節(jié)炎MMPs的產(chǎn)生,保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

    本研究結(jié)果提示,活血化瘀合劑能夠緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎模型兔關(guān)節(jié)軟骨的病理?yè)p傷,其機(jī)制與抑制關(guān)節(jié)液及軟骨中MMP-3、MMP-9、MMP-13水平有關(guān)。本研究證實(shí)活血化瘀法能通過(guò)調(diào)控MMPs水平發(fā)揮治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的功效,一定程度闡明了活血化瘀法的療效機(jī)制,為其臨床治療膝骨性關(guān)節(jié)炎提供了良好的理論依據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

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