CTX聯(lián)合BUS對(duì)小鼠卵巢及早期肺損傷的研究

沈艷玲等

[摘要] 目的 旨在研究CTX聯(lián)合BUS對(duì)Wister小鼠卵巢及早期肺功能損傷組織結(jié)構(gòu)的影響。 方法 選取2～3月齡的雌性Wister小鼠60只，隨機(jī)分成四組：A正常對(duì)照組、B生理鹽水組、C組CTX+BUS組、D組CTX+BUS+生理鹽水組。C、D兩組第1天以腹腔注射CTX負(fù)荷劑量50 mg/（kg·d），第2天開(kāi)始8 mg/（kg·d）連續(xù)注射14 d，后皮下注射BUS10 mg/（kg·w），共2次。C組小鼠于第15天處死。D組于第15天開(kāi)始注射生理鹽水8 mg/（kg·d），共15 d，于第30天處死余組小鼠。在處理期間觀察小鼠的一般情況、體重、各級(jí)卵泡數(shù)水平。以化學(xué)發(fā)光法測(cè)定各組小鼠血清中E2及FSH的水平，觀察卵巢及肺組織常規(guī)病理切片下的形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果 與A、B組卵巢相比，C組E2 顯著下降、FSH水平顯著增加、各級(jí)卵泡數(shù)量減少（P<0.05）。C、D組相比，E2 下降、FSH增加（P<0.05），兩組各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)雖減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B組中E2、FSH、卵泡數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組與A、B、D組肺組織對(duì)比，肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫， 肺泡間隔內(nèi)可見(jiàn)滲出液。A、B、C組肺組織形態(tài)無(wú)異常。 結(jié)論CTX+BUS使原始卵泡和初級(jí)卵泡的顯著減少可能與小鼠卵巢中血E2下降有關(guān)，并且CTX+BUS也會(huì)造成一過(guò)性肺損傷。

[關(guān)鍵詞] 卵巢損傷；性激素；一過(guò)性肺損傷

The effects of cyclophosphamide and busulfan on ovarian injuries and early lung injury

SHEN Yanling WU Hui HUANG Huan YIN Tian LI Pan ZHAO Pin WU Changchu LUO Wenqi

Changsha Medical University， Changsha 410219， China

[Abstract] Objective To assess the effects of cyclophosphamide （CTX） and busulfan （BUS） on ovarian injuries and initial injury of lung. Methods Sixty female SD rats age of 2 to 3 months were divided into four groups： group A （control group）， group B （saline group）， group C （CTX+ BUS group）， group D （CTX+BUS+saline group）. SD rats of group C and group D were processed by intraperitoneal injection of CTX 50 mg/（kg·d） at the 1st day and then 8 mg/（kg·d） from day 2， for 14 days. SD rats of group C and group D were processed by subcutaneous injection of BUS 10 mg/（kg·w） for twice， and SD rats of group C were killed at day 15， whereas SD rats of group D had been processing by 8 mg/（kg·d） saline for another 15 days， and all of SD rats were killed at day 30. General conditions， weight， number of levels of folliole of rats of four group were observel every day. Estrogen （E2） and follicular stimulating hormone （FSH） were detected by chemiluminescence method. The lung and ovaries of each group were prepared for HE sections. Results Compared with A， B group of ovarian， levels of E2， number of levels of follicular， FSH in the group C decreased and increased significantly （P<0.05）. Compared with group D， C， E2 decreased， FSH increased （P<0.05）， two groups of follicle count at all levels was reduced， but there was no statistically significant difference. In group B and A， E2， FSH， number of follicles were compared， there was no statistically significant difference. Group C compared with group A， B， D in lung tissue， lung tissue vascular endothelial edema， can be seen in the alveolar interval exudate. Lung tissue form of A， B， C group without exception. Conclusion CTX together with BUS can induce primodial follicles and primary follicles undergo atresia， which can be close to the decreased level of E2. CTX together with BUS can also induce transitory pulmonary injury in early stage.

[Key words] Ovarian injury； Sex hormone； Transitory pulmonary injury

近年來(lái)惡性腫瘤趨于年輕化，雖經(jīng)化療后患者的存活率顯著提高，但同時(shí)對(duì)女性卵巢也造成一定的損害，如卵泡過(guò)早排空，包膜增厚，間質(zhì)纖維化，進(jìn)而卵巢早衰[1，2]。如今化療藥物對(duì)卵巢的副作用損傷已逐漸成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。其中，CTX和BUS為細(xì)胞周期非特異性烷化劑，其毒性不僅作用于分裂增殖期細(xì)胞，也可作用于未發(fā)育的卵母細(xì)胞或原始卵泡中的前顆粒細(xì)胞，影響卵泡的發(fā)育和成熟[3]。另有報(bào)道部分化療藥物誘發(fā)肺纖維化所需的時(shí)間較長(zhǎng)，患者發(fā)病隱匿，不易引人注意[4]。如何在化療時(shí)保護(hù)卵巢功能和肺功能是亟待解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)選取經(jīng)典化療藥物環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）和白消安（Busulfex，BUS），觀察其對(duì)卵巢功能和肺功能損傷的影響，為深入探索化療藥物對(duì)卵巢功能及早期肺損傷的預(yù)防及治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

具有正常性周期2～3月齡的雌性Wister小鼠60只，體重（23±2）g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，使用準(zhǔn)可證編號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，鼠料及飲用水均經(jīng)滅菌處理，自由攝食，室溫20℃～24℃，相對(duì)濕度45%～55%，每日光照12 h，晝夜交替。飼養(yǎng)1周后每日晨取陰道分泌物涂片，光鏡下觀察性周期。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

注射用環(huán)磷酰胺購(gòu)自山西普德藥業(yè)股份有限公司（粉劑，200 mg/支），國(guó)藥準(zhǔn)字：H14023686。白消安，購(gòu)于Sigma公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：B2635。實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水配成相應(yīng)濃度的水溶液注射。

1.3 方法

1.3.1 分組及用藥 將60只小鼠隨機(jī)分成四組，每組15只。A組（正常組）。B組（生理鹽水組）：每天腹腔注射同等劑量的0.9%生理鹽水，連續(xù)30 d。C組（CTX+BUS組）和D組（CTX+BUS+生理鹽水組）第1天以腹腔注射環(huán)磷酰胺負(fù)荷劑量50 mg/（kg·d），后以8 mg/（kg·d）的維持劑量連續(xù)注射14 d，注射環(huán)磷酰胺后皮下注射白消安10 mg/（kg·w），共2次。C組小鼠于第15天處死。D組于第15天開(kāi)始注射生理鹽水8 mg/（kg·d），共15 d，于第30天處死A、B、D組小鼠。以上所用動(dòng)物均摘小鼠眼球以取血，4℃放置過(guò)夜后，2000 r/min離心10 min，分離血清于-20℃保存。用藥期間觀察小鼠一般狀態(tài)（生命體征、進(jìn)食情況、大小便、每日測(cè)體重1次）。

1.3.2 動(dòng)情周期的確定 每天9：00取自制微細(xì)棉簽蘸以0.9%生理鹽水后，輕輕于小鼠陰道內(nèi)旋轉(zhuǎn)1圈，行陰道涂片，用95%乙醇固定5 min，顯微鏡下觀察細(xì)胞的種類(lèi)和形態(tài)。

1.3.3性激素水平的測(cè)定方法 采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定小鼠血清中的雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）水平，試劑盒為德國(guó)Bayer公司生產(chǎn)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3.4 組織形態(tài)學(xué)觀察 C組小鼠第15天處死，取出雙側(cè)卵巢及肺，第30天處死余下組的小鼠。進(jìn)行石蠟切片后，HE染色并光鏡下觀察雙側(cè)卵巢和肺組織的形態(tài)學(xué)變化。分別計(jì)數(shù)各組小鼠的各級(jí)卵泡數(shù)并比較各組間的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用兩樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般情況

A、B兩組小鼠活動(dòng)、攝食等一般情況正常，體重?zé)o下降，對(duì)外界刺激的反應(yīng)性好，靈活性強(qiáng)。C、D兩組小鼠在腹腔注射CTX及皮下注射BUS后，體重逐漸下降，活動(dòng)減少，體毛黯淡無(wú)光澤，部分體毛剝脫，注射處皮膚出現(xiàn)小潰瘍，但可自愈。C、D兩組于處理后第2天小鼠體重即下降，至第15天體重達(dá)到最低值；結(jié)束注射化療藥后D組小鼠體重均略有增長(zhǎng)，但仍低于對(duì)照組（t=6.776，P<0.05）。D組的體重與C組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.266，P<0.05）。A、B兩組的體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2小鼠動(dòng)情周期的測(cè)定

A、B組小鼠的動(dòng)情周期為4～5 d，動(dòng)情間期為1.5～2.5 d。A、B組涂片內(nèi)上皮細(xì)胞、白細(xì)胞、角化細(xì)胞交替的周期性變化。C、D兩組注入CTX及BUS后在出現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間上皮細(xì)胞及白細(xì)胞后，偶有一個(gè)角化細(xì)胞類(lèi)型變化。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，角化細(xì)胞出現(xiàn)的頻率減少。

2.3性激素水平的測(cè)定

注藥結(jié)束后，C、D兩組小鼠激素水平發(fā)生明顯變化。與A組比較，C、D兩組E2水平明顯降低（t=33.999、24.682，P<0.05），F(xiàn)SH水平明顯升高（t=-11.296、-14.333，P<0.05）。其中D組與C組比較E2濃度低，F(xiàn)SH比C組高，有顯著性差異（t=12.276、-10.207，P<0.05）。A、B組E2、FSH的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.036、0.702，P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.4小鼠卵泡計(jì)數(shù)

C、D組各級(jí)卵泡數(shù)量低于A、B組（P<0.05），其中以原始卵泡及初級(jí)卵泡下降最為明顯，D組與C組相比卵泡數(shù)均有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這說(shuō)明CTX+BUS主要作用于原始卵泡和初級(jí)卵泡，影響卵泡的發(fā)育和成熟。見(jiàn)封三圖2。

2.5 卵巢及肺形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)A、B組卵巢皮質(zhì)的各級(jí)卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu)與髓質(zhì)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常。肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)也未見(jiàn)異常。C、D兩組可見(jiàn)卵泡數(shù)目均明顯減少，卵巢髓質(zhì)萎縮，間質(zhì)纖維化。C組肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫， 肺泡間隔內(nèi)可見(jiàn)滲出液。D組內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞均正常，說(shuō)明化療藥物可導(dǎo)致一過(guò)性肺損傷。見(jiàn)封三圖3。

3 討論

化療是臨床上治療免疫性疾病、血液病和腫瘤的重要手段之一，療效確切?；熕幬飳?duì)靶細(xì)胞選擇性較差，在殺滅病變細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常組織細(xì)胞也有不同程度的損害。其中，女性卵巢是化療敏感器官，化療可造成卵巢功能損害，改變性激素水平，可使患者發(fā)生暫時(shí)或永久性閉經(jīng)，甚至喪失生育力，生活質(zhì)量下降。目前有明確卵巢毒性損害的烷化劑如環(huán)磷酰胺、白消安、氮芥等可致閉經(jīng)、生育能力低下，其中白消安是聯(lián)合化療、手術(shù)的常用藥物之一[5]，目前有數(shù)據(jù)表明每增加1.0 g劑量的環(huán)磷酰胺，發(fā)生卵巢功能衰竭的幾率大約增加 0.13倍[6]。因此本研究選擇CTX腹腔注射+BUS皮下注射處理小鼠進(jìn)行觀察，卵巢HE染色可見(jiàn)C、D組小鼠卵巢組織中原始卵泡和初級(jí)卵泡的明顯少于正常組，說(shuō)明CTX+BUS主要破壞處于發(fā)育中的卵泡，與王方圓的實(shí)驗(yàn)一致[7]。另外血清雌激素來(lái)源于卵巢的顆粒細(xì)胞，被視為卵巢儲(chǔ)備功能的直接指標(biāo)[8]。本研究顯示，C、D組小鼠在給藥后15 d，血清中E2顯著下降，F(xiàn)SH顯著上升，說(shuō)明CTX+BUS損傷了卵巢的顆粒細(xì)胞從而使E2分泌下降，而D組繼續(xù)給予同等劑量的生理鹽水，在不傷害小鼠卵巢的情況下卵巢損傷的程度有所減慢，這可能與小鼠機(jī)體應(yīng)激因素有關(guān)[9]。同時(shí)已有大量資料表明CTX可導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞的損傷，其機(jī)制為卵泡內(nèi)的某種信號(hào)被激活而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]，而這種機(jī)制有學(xué)者提出Bcl-2/bax的比例決定卵泡是否接受誘導(dǎo)凋亡的信號(hào)[11]。目前，Bcl-2家族是較公認(rèn)的凋亡調(diào)控因子之一，大量學(xué)者對(duì)此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，梁欣韞研究自身免疫性卵巢早衰小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)生率高，同時(shí)Bax蛋白的表達(dá)明顯上升，Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯下降[12]。朱玲研究表明免疫性卵巢早衰大鼠Bcl-2蛋白的表達(dá)減弱，Bax蛋白的表達(dá)增加從而促進(jìn)了卵泡過(guò)早過(guò)快的凋亡[13]。邱明寧進(jìn)一步以山羊卵巢間質(zhì)體外分離實(shí)驗(yàn)證實(shí)顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖與局部Bax基因的表達(dá)有關(guān)[14]。此時(shí)有學(xué)者研究去卵巢大鼠外源性補(bǔ)充E2后，大鼠下丘腦各核團(tuán)Bcl-2蛋白的表達(dá)增加，而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)減少或變化不明顯的實(shí)驗(yàn)，證明了E2能調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的表達(dá)[15]。然而可能由于種屬特異性，各實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異。而本實(shí)驗(yàn)主要研究CTX+BUS對(duì)卵巢的破壞結(jié)果，主要是小鼠卵巢原始卵泡和初級(jí)卵泡的耗竭和E2的顯著下降，其實(shí)驗(yàn)機(jī)制可能是化療藥物促使E2減少，從而異常激活Bax基因的表達(dá)，誘導(dǎo)卵泡凋亡甚至耗竭[16]，由此猜測(cè)原始卵泡和初始卵泡的顯著減少可能與E2的下降有關(guān)，而E2與卵泡凋亡及bcl-2/Bax三者間調(diào)節(jié)具體的作用機(jī)制，有待后續(xù)的相關(guān)研究來(lái)證明。

另外，抗腫瘤藥物可使很多惡性腫瘤患者受益，但這種獲益是以藥物毒性的產(chǎn)生為代價(jià)的，其中一部分患者可發(fā)生肺損傷。化療藥物是引起藥物性肺損傷的重要原因，其中包括環(huán)磷酰胺、白消安、博來(lái)霉素等[17]。研究表明白消安治療慢性粒細(xì)胞白血病2～3年后，可引起肺纖維化，且常因呼吸衰竭或并發(fā)肺炎而死亡[18]。有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究在治療相關(guān)的劑量濃度范圍內(nèi)，環(huán)磷酰胺及白消安對(duì)肺的影響小[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化療第15天時(shí)小鼠HE染色示肺部損傷，第30天肺部HE肺組織內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞正常，考慮化療藥物使小鼠處于應(yīng)激狀態(tài)致早期肺損傷，停藥后肺部結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。

化療對(duì)卵巢功能的影響可引起不孕，對(duì)年輕女性癌癥患者化療前如何評(píng)估化療可能對(duì)生育功能產(chǎn)生的影響，從而使患者獲得更好的卵巢功能和生育能力，是目前臨床婦科腫瘤醫(yī)師必須重視的課題，也是未來(lái)卵巢惡性生殖細(xì)胞腫瘤研究的方向。同時(shí)繼續(xù)探討化療藥物對(duì)早期肺功能的影響，相信經(jīng)過(guò)研究者們的共同努力，將會(huì)為年輕女性癌癥患者化療后保留生育力和正常肺功能提供更多、更有效、更安全以及更經(jīng)濟(jì)的治療方法[20]。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 林寶釵. 化療對(duì)卵巢功能的影響及預(yù)防措施[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2012，18（5）：677-680.

[2] 鄭偉，趙春麗. 卵巢惡性生殖細(xì)胞腫瘤術(shù)后化療對(duì)卵巢功能的影響研究[J]. 中國(guó)性科學(xué) 2014，55（6）：38-41.

[3] 李彩霞，王鳳英，李玉艷，等. 小鼠卵巢早衰動(dòng)物模型的構(gòu)建[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（6）：506-509.

[4] 蘇永華. 化療常見(jiàn)副作用——肺損傷[N]. 上海中醫(yī)藥報(bào)，2013-07-05（4）.

[5] Greten TF，Ormandy LA，F(xiàn)ikuart A，et al. Low-dose cyclophosphamide treatment impairs regulatory T cells and unmasks AFP-specific CD4+ T-cell responses in Patients with advanced HCC[J]. Journal of Immunotherapy，2010， 33（2）：211-218.

[6] 楊岫巖，朱旬，梁柳琴. 環(huán)磷酰胺治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡導(dǎo)致卵巢功能衰竭的相關(guān)因素分析[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85（14）：960-962.

[7] 王方圓，謝超，程蔚蔚，等. 環(huán)磷酰胺化療導(dǎo)致小鼠卵巢功能損傷模型的建立[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，31（10）：1398-1408.

[8] 韓麗萍，何援利. 雌激素對(duì)化療損傷性卵巢早衰保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29（5）：872-875.

[9] 鄭翠紅，黃光英. 卵巢早衰動(dòng)物模型及其相關(guān)研究[J]. 中西醫(yī)結(jié)合研究，2012，4（5）：260-263.

[10] Adams J，Cory S. The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy[J]. Oncogene，2007，26（9）：1324-1337.

[11] 李潔，楊菁. 卵巢早衰動(dòng)物模型建立的研究進(jìn)展[J]. 生殖與避孕，2006，26（9）：550-553.

[12] 梁欣韞，牛建昭，楊美娟. 育泡飲對(duì)自身免疫性POF小鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（1）：21-23.

[13] 朱玲，羅頌平，許麗綿，等. 左歸丸對(duì)免疫性卵巢早衰小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2012，23（4）：381-386.

[14] 邱明寧. 山羊卵巢間質(zhì)細(xì)胞體外功能研究及其小腔卵泡發(fā)育的影響[D]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

[15] 趙慧英，龍敏，徐永平，等. 雌激素和IFN-γ對(duì)去卵巢大鼠下丘腦中Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，39（10）：58-62.

[16] Huang X，Choi JK，Park SR，et al. GM-CSF inhibits apoptosis of neural cells via regulating the expression of apoptosis-related Proteins[J]. Neuroscience Research，2007， 58（1）：50-57.

[17] 蔡英全. 輻射線(xiàn)——化療藥物致肺損傷的原理與防治[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2010，18（3）：626-628.

[18] Libo Zhao，Xiaomin Wang，Qing Chang，et al. Neferine，a bisbenzylisoquinline alkaloid attenuates bleomycin induced pulmonary fibrosis[J]. European Journal of Pharmacology，2009，627（1）：304-312.

[19] 王莉，張偉京，張秀森，等. 細(xì)胞毒藥物對(duì)小鼠肺組織和骨組織間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的影響[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（32）：6279-6283.

[20] 張李松，賴(lài)愛(ài)鸞. 卵巢未成熟畸胎瘤2例分析[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2008，14（12）：44-45.