低溫治療腦損傷的相關(guān)分子和細胞通路研究進展

陳帥+黃克剛

[摘要] 急性腦損傷發(fā)病機制尚未完全闡明，目前在臨床上無特效治療方法，病死率較高。低溫能降低機體代謝，低溫可以保護神經(jīng)元免受損傷，阻滯神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活（尤其是小膠質(zhì)細胞），緩解內(nèi)皮和血腦屏障的功能障礙。另一方面，低溫可以改變細胞內(nèi)的信號通路、基因調(diào)控系統(tǒng)和細胞的微結(jié)構(gòu)。本文就低溫治療腦損傷的相關(guān)分子和細胞通路的研究進展進行簡要綜述。

[關(guān)鍵詞] 低溫；急性腦損傷；腦保護

Molecular and cellular pathways of low temperature in treatment of brain injury

CHEN Shuai HUANG Kegang

ICU， Qinzhou First People's Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Qinzhou 535000， China

[Abstract] It has not been fully elucidated to the pathogenesis of acute brain injury， which has high mortality rate. Low temperature can protect neurons， block glial cell activation（especially microglia） and alleviate the dysfunction of endothelium and blood brain barrier by reducing the metabolism. On the other hand， low temperature can change cellular signal pathways， gene regulatory system and cell micro-structure. In this review， we summed up there lated molecules and cellular pathways of low temperature to treat brain damage.

[Key words] Hypothermia； Acute brain injury； Cerebral protection

體溫的改變可以干擾機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，引起分子、細胞以及整個機體系統(tǒng)等各個水平的改變?，F(xiàn)已證明，低溫可以保護神經(jīng)元免受損傷，阻滯神經(jīng)膠質(zhì)細胞的激活（尤其是小膠質(zhì)細胞），緩解內(nèi)皮和血腦屏障的功能障礙[1]。小膠質(zhì)細胞維持腦內(nèi)神經(jīng)脈管的營養(yǎng)，是調(diào)節(jié)炎癥和血腦屏障功能的主要細胞，所以治療性低溫的保護性機制除了直接保護神經(jīng)元免受損傷以外，還包括保護其免受炎癥和血腦屏障異常所誘導(dǎo)的二次損傷。另外，低溫可以改變細胞內(nèi)的信號通路、基因調(diào)控系統(tǒng)和細胞的微結(jié)構(gòu)。當(dāng)治療性低溫應(yīng)用于腦損傷模型，如外傷性腦損傷、中風(fēng)、心臟停搏、圍產(chǎn)期窒息、主動脈瘤破裂等等，由于腦組織損傷時異常的病理環(huán)境，低溫誘導(dǎo)的分子機制會變得更加復(fù)雜。所以，在研究過程中除了低溫本身，還要去除損傷相關(guān)的干擾。一般來說，低溫效果及機制的不同依靠降溫的深度，低溫分為輕度（32℃～35℃），中度（28℃～32℃）和重度（低于28℃），目前大多數(shù)低溫研究都集中于輕度和重度低溫。保護性低溫機制的研究可為將來發(fā)展保護性藥物提供有力的支持和線索。

1 低溫治療腦損傷相關(guān)的分子和細胞通路

1.1 低溫誘導(dǎo)的信號通路改變

近年來，微點陣研究的發(fā)展為低溫治療在轉(zhuǎn)錄水平提供了大量的信息。低溫治療后，大量的候選基因被篩選出來，其功能也被逐一研究，大部分集中于細胞死亡或活力、炎癥和氧化自由基相關(guān)的基因。

1.1.1 MAPK通路 已經(jīng)證實，低溫可以誘導(dǎo)許多細胞內(nèi)信號的級聯(lián)反應(yīng)，最常見的是細胞分裂素活化蛋白激酶（MAPK）通路[2]。MAPKs是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白酶，依賴于細胞外刺激如分裂素、應(yīng)激或休克、炎癥等發(fā)揮作用。MAPKs調(diào)控各種細胞行為，包括基因誘導(dǎo)、細胞活力和死亡等。有文獻報道，低溫可激活細胞外的信號調(diào)節(jié)激酶-1/2（ERK1/2），促進其保護性作用[3]；而有文獻報道低溫可阻斷ERK1/2的激活，抑制炎癥和細胞死亡的發(fā)生[4]。結(jié)果看似是相反的，但是實際上是因為ERK1/2的作用是雙向的，低溫增加了其保護性作用，降低了其有害作用。JNK（Jun N-terminal kinase）是MAPK家族的另外一個成員。低溫通過早期抑制JNK的激活，后期預(yù)防細胞凋亡或死亡來保護缺血內(nèi)皮細胞、外傷性腦損傷和血腦屏障損傷。低溫對p38的作用與JNK相似，通過抑制p38的激活來抑制炎癥、凋亡和內(nèi)皮功能障礙。所以，抑制p38或p38信號通路中的某個因子可能是一個低溫治療靶向?？傊?，輕度低溫可抑制MAPK通路有害的方面，促進保護性的方面。而對于重度低溫，低體溫則由p38、ERK1/2和核因子kappa B（NFγB）共同調(diào)節(jié)[5]。

1.1.2 NFγB NFγB是一種控制DNA轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)復(fù)合物。幾乎所有的動物細胞受到刺激后均會產(chǎn)生NFγB。NFγB在免疫反應(yīng)和炎癥的調(diào)控中起著重要的作用。很多研究均顯示，低溫可以下調(diào)炎癥相關(guān)的NFγB活性。但是，另外一些研究發(fā)現(xiàn)低溫可增強NFγB的活性。深度低溫的復(fù)溫過程中也可以發(fā)現(xiàn)NFγB的表達增加[6]。雖然目前這些相矛盾的結(jié)論還尚未清楚，但是研究低溫誘導(dǎo)的NFγB活性變化對于更好地理解低溫的細胞分子機制是非常必要的。

1.1.3 STAT家族 信號傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子（STATs）是一個轉(zhuǎn)錄因子家族。局部缺血模型中，STAT3和STAT5具有神經(jīng)保護性。STATs在線粒體介導(dǎo)的神經(jīng)保護中產(chǎn)生的缺血預(yù)適應(yīng)也發(fā)揮作用。常溫下缺血-再灌注能夠引起磷酸化的STAT-1和STAT-3顯著增加，而中度低溫則使其下降，趨于正常[7]。Choi等也報道，輕度低溫可以使中風(fēng)動物模型的血管系統(tǒng)中STAT-3和細胞內(nèi)黏附分子磷酸化水平降低[8]。但是，嚴重低溫條件下STAT-3被激活，引起腫瘤壞死因子（TNF）表達下降，從而產(chǎn)生抗炎癥反應(yīng)，保護肝臟[9]。也就是說，低溫都會引起抗炎癥反應(yīng)，但是其作用機制要依賴于低溫的深度。

1.1.4 PI3K/Akt Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在多個細胞過程包括葡萄糖代謝、細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄和細胞遷移中起關(guān)鍵作用。術(shù)后低溫條件通過Akt1可以抑制細胞的線粒體凋亡途徑，Akt1活性下降會加劇中樞系統(tǒng)的缺血/再灌注。Akt可能是術(shù)后保護腦損傷的一種潛在的分子治療靶向。另外，Akt通路活化不僅在腦損傷模型中，而且在其他組織系統(tǒng)中也可以起到一定的保護作用。例如，低溫治療可以提高Akt的活性，從而保護心肌細胞減少凋亡。治療性低溫可以通過增強Akt信號通路，減少細胞凋亡，緩解多種微生物膿毒敗血癥模型大鼠的肝損傷[10]。

1.1.5 PTEN PTEN（磷酸酯酶-張力蛋白同系物）是一個與低溫保護性密切相關(guān)的非常著名的存活因子。低溫抑制大腦局部缺血/再灌注引起的GluR6-PSD95-MLK3信號分子增加是其中的一種保護性機制[11]。低溫能夠減少腦缺血大鼠模型的腦組織氧化性DNA損傷和細胞死亡前信號通路的激活。低氧也可以改變其他的信號通路，如鈣離子通路和三磷酸腺苷等。輕度的低溫通過修復(fù)鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白酶Ⅱ介導(dǎo)的信號通路，可以延遲神經(jīng)元損傷。低溫還可以顯著增加AMP依賴的蛋白激酶的磷酸化水平[12]。值得注意的是不同的低溫條件如低溫持續(xù)時間和溫度的差異可以導(dǎo)致信號系統(tǒng)的不同響應(yīng)性，損傷模型的不同也導(dǎo)致了結(jié)果的復(fù)雜性。

1.1.6 其他 目前，還有一些研究集中于c-fos、c-jun、zif/268、pCREB和AP-1。另外，低溫可以抑制低氧誘導(dǎo)因子-1 alpha（HIF-1 alpha）的合成及其介導(dǎo)的基因表達。HIF 家族是對細胞環(huán)境中的氧反應(yīng)敏感的一類轉(zhuǎn)錄因子，在低氧狀態(tài)下呈高表達[13]。

1.2 低溫誘導(dǎo)的細胞結(jié)構(gòu)改變

1.2.1 脂質(zhì) 低溫治療中，細胞結(jié)構(gòu)的變化很大程度上依賴于溫度下降的程度。脂質(zhì)是細胞的主要成分，細胞膜的脂質(zhì)組分隨著外部環(huán)境的變化而改變。細胞膜和細胞器的脂質(zhì)組成參與細胞對低溫的適應(yīng)過程。低溫狀態(tài)下，神經(jīng)膠質(zhì)細胞核的膽固醇含量以及膽固醇/磷脂比增加，微粒體的磷脂酰肌醇的比例降低。另外，冷的環(huán)境可引起細胞能量代謝加快，低溫可以增加機體內(nèi)的脂解作用、自由脂肪酸轉(zhuǎn)換率和甘油三酯/自由脂肪酸循環(huán)，從而增加儲存的甘油三酯對能量消耗的反應(yīng)。

1.2.2 樹突棘 神經(jīng)元樹突棘的形狀可以影響突觸傳遞的多個關(guān)鍵步驟，包括突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體的分布、突觸后離子流、突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放等。低溫可以使樹突棘形狀發(fā)生改變。樹突棘對低溫高度敏感，低溫情況下肌動蛋白快速失去活力，導(dǎo)致可逆的棘的形態(tài)改變，從而影響突觸轉(zhuǎn)運。低溫導(dǎo)致的突觸棘形態(tài)改變可以顯著影響腦功能[14]。

1.2.3 血腦屏障（BBB） 血腦屏障是低溫的重要靶標(biāo)。只有維持血腦屏障的完整性，才能保證正常的腦環(huán)境。腦損傷使血腦屏障受損，血腦屏障受損就不能保護大腦免受腦水腫及顱內(nèi)壓升高帶來的損傷，從而威脅生命。目前，低溫對血腦屏障影響的研究很多。已經(jīng)證實，低溫可以保護血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能，其機制主要是維持血腦屏障中血管基底膜蛋白[1]以及其他組成蛋白的含量，減少基質(zhì)金屬蛋白酶的表達[15]，增加組織抑制子的表達。

低溫除了直接保護血腦屏障的完整性，還會影響周細胞遷移、多藥抑制蛋白1-介導(dǎo)的跨上皮轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)錄因子表達。血腦屏障受損增加水通道蛋白-4（AQP-4）的表達，輕度低溫通過抑制AQP-4蛋白的表達水平，顯著降低顱內(nèi)出血引起的腦水腫形成[16]。

2 藥物和低溫結(jié)合治療腦損傷相關(guān)的分子和細胞通路

外傷性腦損傷或中風(fēng)患者一般會接受多種藥物治療。當(dāng)藥物治療結(jié)合低溫治療時，藥物和低溫之間的相互作用也應(yīng)該考慮。當(dāng)整個機體體溫較低時，藥物代謝、清除以及攝取受到影響。腦局部低溫可能更適合治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷。

2.1 低溫和藥物相互作用

低溫對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用機制包括代謝和血液動力學(xué)、中毒、血腦屏障、鈣依賴的細胞內(nèi)化信號通路、炎癥、水腫和神經(jīng)細胞死亡。這些機制能被許多藥物調(diào)節(jié)。有文獻報道，低溫能保護星形膠質(zhì)細胞抵制缺血/再灌注導(dǎo)致的損傷，而天然產(chǎn)物銀杏糖甙可以影響低溫的效果[17]。Schmitt等[4]發(fā)現(xiàn)，類固醇甲基氫化潑尼松可以減輕低溫/復(fù)溫誘導(dǎo)的細胞毒性和星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞釋放IL-6。低溫可以誘導(dǎo)神經(jīng)元軸突生長，神經(jīng)膠質(zhì)鈣結(jié)合蛋白通過抑制這個過程，不同程度地影響細胞因子的釋放，直接對腦細胞產(chǎn)生細胞毒性。輕度低溫阻滯創(chuàng)傷誘導(dǎo)星形細胞表達外周苯二氮■受體（PBR），降低神經(jīng)甾體的產(chǎn)生，從而減輕星形膠質(zhì)細胞溶脹和水腫[18]。

2.2 藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的低溫

大麻素是一類從植物（植物性大麻素）、動物神經(jīng)免疫系統(tǒng)（內(nèi)源性大麻素）提取或人工合成（合成性大麻素）的化學(xué)物質(zhì)。大麻素調(diào)控神經(jīng)興奮性，參與不同的生理過程，如情緒、食欲、記憶、痛覺等。大麻素通過與大麻素受體-1（CB1R）和受體-2（CB2R）兩種受體結(jié)合起作用。神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和大腦微血管上皮細胞均表達CB2R，調(diào)控細胞的免疫和炎癥反應(yīng)。神經(jīng)變性疾病或局部缺血發(fā)生時CB1R表達增加，可以調(diào)節(jié)大麻素產(chǎn)生的低溫效應(yīng)[19]，且CB1R激動劑HU-210可通過誘導(dǎo)低溫而減輕局部缺血產(chǎn)生破壞。CB1R可增加下丘腦前核和體溫中樞GABA的釋放。因此，大麻素的神經(jīng)保護功能與藥物誘導(dǎo)的低溫密切相關(guān)。同樣，二氫辣椒堿（DHC）也可以誘導(dǎo)猴子和牛輕度治療性低溫[20]。

3 討論與展望

治療性低溫可以全身應(yīng)用或局部應(yīng)用。因為全身性低溫副作用較大，部分患者會出現(xiàn)感染、心律失常、低血鉀和凝血紊亂等，所以局部低溫治療被認為是一種可廣泛應(yīng)用的降溫方法。治療性低溫引起了醫(yī)療工作者極大的興趣，其過程中起保護作用的分子機制也得到了深入的研究。由于全身性低溫的局限性，基于其分子機制的靶向性低溫治療將促進副作用小、療效高新藥物的發(fā)展。而且，藥物和局部低溫結(jié)合治療將成為未來研究的核心。例如，低溫治療的一個主要機制就是減弱神經(jīng)系統(tǒng)炎癥。而目前，伴隨大量抗炎藥物的問世，局部低溫可能為其提供了一個協(xié)同神經(jīng)保護策略。同時，低氧誘導(dǎo)藥物如大麻素和二氫辣椒堿也可能參與局部降溫作用，以得到更好的神經(jīng)保護作用。

[參考文獻]

[1] Baumann E，Preston E，Slinn J，et al. Post-ischemic hypothermia attenuates loss of the vascular basement membrane proteins，agrin and SPARC，and the blood-brain barrier disruption after global cerebral ischemia[J]. Brain Res，2009，1269：185-197.

[2] Atkins CM，Oliva AA Jr，Alonso OF，et al. Hypothermia treatment potentiates ERK1/2 activation after traumatic brain injury[J]. Eur J Neurosci，2007，26（4）：810-819.

[3] Sakurai T，Itoh K，Higashitsuji H，et al. Cirp protects against tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis via activation of extracellular signal regulated kinase[J]. Biochim Biophys Acta，2006，1763（3）：290-295.

[4] Schmitt KR，Diestel A，Lehnardt S，et al. Hypothermia suppresses inflammation via ERK signaling pathway in stimulated microglial cells[J]. J Neuroimmunol，2007，189：7-16.

[5] Roberts JR，Rowe PA，Demaine AG. Activation of NF-kappaB and MAP kinase cascades by hypothermic stress in endothelial cells[J]. Cryobiology，2002，44（2）：161-169.

[6] Diestel A，Troeller S，Billecke N，et al. Mechanisms of hypothermia-induced cell protection mediated by microglial cells in vitro[J]. Eur J Neurosci，2010，31（5）：779-787.

[7] Parkinson EJ，Townsend PA，Stephanou A，et al. The protective effect of moderate hypothermia during intestinal ischemia-reperfusion is associated with modification of hepatic transcription factor activation[J]. J Pediatr Surg，2004， 39：696-701.

[8] Choi JS，Park J，Suk K，et al. Mild Hypothermia attenuates intercellular adhesion molecule-1 induction via activation of extracellular Signal-regulated kinase-1/2 in a focal cerebral ischemia model[J]. Stroke Res Treat，2011，2011：846716.

[9] Qing M，Nimmesgern A，Heinrich PC，et al. Intrahepatic synthesis of tumor necrosis factor-alpha related to cardiac surgery is inhibited by interleukin-10 via the Janus kinase （Jak）/signal transducers and activator of transcription （STAT） pathway[J]. Crit Care Med，2003，31（12）：2769-2675.

[10] Lee JH，Kim K，Jo YH，et al. Therapeutic hypothermia attenuates liver injury in polymicrobial sepsis model of rats via Akt survival pathway[J]. J Surg Res，2013，181（1）：114-120.

[11] Hu WW，Du Y，Li C，et al. Neuroprotection of hypothermia against neuronal death in rat hippocampus through inhibiting the increased assembly of GluR6-PSD95-MLK3 signaling module induced by cerebral ischemia/reperfusion[J]. Hippocampus，2008，18（4）：386-397.

[12] Muzzi M，Blasi F，Chiarugi A. AMP-dependent hypothermia affords protection from ischemic brain injury[J]. J Cereb Blood Flow Metab，2013，33（2）：171-174.

[13] Tanaka T，Wakamatsu T，Daijo H，et al. Persisting mild hypothermia suppresses hypoxia-inducible factor-1alpha protein synthesis and hypoxia-inducible factor-1-mediated gene expression[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2010，298（3）：R661-R671.

[14] Drury PP，Bennet L，Gunn AJ，et al. Mechanisms of hypothermic neuroprotection[J]. Semin Fetal Neonatal Med，2010，15（5）：287-292.

[15] Nagel S，Su Y，Horstmann S，et al. Minocycline and hypothermia for reperfusion injury after focal cerebral ischemia in the rat： Effects on BBB breakdown and MMP expression in the acute and subacute phase[J]. Brain Res，2008，1188：198-206.

[16] Dai DW，Wang DS，Li KS，et al. Effect of local mild hypothermia on expression of aquaporin-4 following intracerebral hemorrhage in rats[J]. Natl Med J China，2006， 86（13）：906-1010.

[17] Fang D，Ming QZ，Li Z，et al. Hypothermia attenuates protective effects of ginkgolides on astrocytes from ischemia/reperfusion injury[J]. Neurochem Int，2009，55（4）：181-186.

[18] Belanger M，Desjardins P，Chatauret N，et al. Mild hypothermia prevents brain edema and attenuates up-regulation of the astrocytic benzodiazepine receptor in experimental acute liver failure[J]. J Hepatol，2005，42（5）：694-699.

[19] Rawls SM，Cabassa J，Geller EB，et al. CB1 receptors in the preoptic anterior hypothalamus regulate WIN 55212-2 [（4，5-dihydro-2-methyl-4（4-morpholinylmethyl）-1-（1-naphthalenyl-carbonyl）-6H-pyrrolo[3，2，1ij] quinolin-6-one]-induced hypothermia[J]. J Pharmacol Exp Ther，2002，301（3）：963-968.

[20] Fosgerau K，Weber UJ，Gotfredsen JW，et al. Drug-induced mild therapeutic hypothermia obtained by administration of a transient receptor potential vanilloid type 1 agonist[J]. BMC Cardiovasc Disord，2010，10：51.