仙藕乳蒲方雙向調(diào)節(jié)整合素β1、α-SMA對小鼠皮膚移植創(chuàng)面愈合的影響

黃新宇 陳麗 周忠志 胡晉婷 王霄霜 楊丁丁 王巍 葉永鑫 袁忠行 丁雅容 禚昭欽 劉平安

〔摘要〕 目的 從調(diào)節(jié)整合素β1、α-SMA探究仙藕乳蒲方促小鼠皮膚移植創(chuàng)面愈合的機制。方法 選用40只雌性C57BL/6小鼠，制作背部直徑為1.2 cm圓形全層皮膚缺損模型，后進行自體原位皮膚移植，隨機分為對照組和實驗組，實驗組給予仙藕乳蒲方粉末敷于皮膚移植區(qū)，對照組不予處理。免疫組織化學染色法比較組織整合素β1、α-SMA的含量;Masson染色比較兩組皮膚移植區(qū)膠原纖維分布。結(jié)果 （1）免疫組化統(tǒng)計結(jié)果示：皮膚移植14 d，實驗組整合素β1、α-SMA表達明顯高于對照組（P<0.05）;皮膚移植21 d，實驗組整合素β1、α-SMA表達則低于對照組（P<0.05）。（2）Masson染色顯示：與對照組相比，皮膚移植14 d，實驗組真皮層膠原纖維豐富，排列致密有序;皮膚移植21 d，實驗組真皮層膠原纖維更少沉積，且排列疏松規(guī)則。結(jié)論 仙藕乳蒲方在皮膚移植創(chuàng)面愈合早期，可提高整合素β1、α-SMA的表達，加強膠原纖維的合成分泌并加快創(chuàng)面收縮;在創(chuàng)面愈合晚期，降低整合素β1、α-SMA的表達，減少膠原纖維的合成分泌并防止創(chuàng)面過度收縮。仙藕乳蒲方可能通過雙向調(diào)節(jié)整合素β1、α-SMA的表達，發(fā)揮促進皮膚移植創(chuàng)面愈合及降低纖維化的作用，為仙藕乳蒲方運用于臨床皮膚移植創(chuàng)面愈合提供依據(jù)。

〔關鍵詞〕 仙藕乳蒲方;皮膚移植;創(chuàng)面愈合;整合素β1;α-SMA

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? ?〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.008

〔Abstract〕 Objective To investigate the mechanism of the Xian'ou Rupu Recipe promoting the healing of mouse skin graft wounds by regulating integrin β1 and α-SMA. Methods 40 female C57BL/6 mice were used to make a circular full-thickness skin defect model with a diameter of 1.2 cm on the back， autologous orthotopic skin graft were performed and divided into control group and experimental group. In the experimental group， the Xian'ou Rupu Recipe powder was applied to the skin grafting area， and the control group was not treated. Immunohistochemical staining was used to compare the content of integrin β1 and α-SMA; Masson staining was used to compare the distribution of collagen fibers in the skin graft area between the two groups. Results （1） The statistical results of immunohistochemistry showed that the expression levels of integrin β1 and α-SMA in the experimental group were significantly higher than that in the control group at 14 days after skin transplantation （P<0.05）; at 21 days after the skin transplantation， the expression levels of integrin β1 and α-SMA in the experimental group were lower than that in the control group （P<0.05）. （2） Masson staining showed that compared with the control group， 14 days after skin transplantation， the experimental group had rich collagen fibers in the dermis layer， and the arrangement was dense and orderly; 21 days after skin transplantation， the experimental group had less deposition of collagen fibers in the dermis layer， and the arrangement was loose and regular. Conclusion The Xian'ou Rupu Recipe can increase the expression of integrin β1， α-SMA， strengthen the synthesis and secretion of collagen fibers and accelerate the contraction of wounds in the early stage of skin graft wound healing; in the late stage of wound healing， reduce the expression of integrin β1， α-SMA， reduce synthesis and secretion of collagen fibers and prevent excessive contraction of the wound surface. It was confirmed that the Xian'ou Rupu Recipe may play a role in promoting skin graft wound healing and reducing fibrosis by bidirectionally regulating the expression of integrin β1 and α-SMA， providing a basis for the application of the Xian'ou Rupu Recipe in clinical skin graft wound healing.

〔Keywords〕 Xian'ou Rupu Recipe; skin transplantation; wound healing; integrin β1; α-SMA

皮膚移植是一種廣泛應用于臨床的有效治療手段，但如何提高植皮后創(chuàng)面愈合率仍需進一步探索[1-2]。移植創(chuàng)面愈合是涉及細胞與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）相互作用的動態(tài)的復雜過程，整合素β1是整合素家族的重要成員，通過“ECM-整合素-肌動蛋白骨架”系統(tǒng)參與多種細胞生物學進程，如細胞信號傳導、細胞黏附與遷移等[3-4]。α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）是細胞骨架的重要組分之一，在整合素胞內(nèi)端傳遞的信號作用下，發(fā)生聚合或解聚引起細胞骨架構(gòu)象的改變，影響細胞遷移運動、膠原分泌及組織收縮[5-6]。

仙藕乳蒲方基于益氣活血、祛腐生新而立方，由仙鶴草、藕節(jié)、乳香和蒲黃按君臣佐使原則精密配伍而成，中醫(yī)學認為其具有收斂止血、活血祛瘀、消腫生肌的功效[7]，是臨床治療創(chuàng)傷療效顯著的經(jīng)驗方。前期研究[7]證實：仙藕乳蒲方在兔耳增生性瘢痕模型和小鼠背部皮層缺損模型中具有促進肉芽組織生成及調(diào)節(jié)Ⅰ/Ⅲ型膠原比值，發(fā)揮促愈抑疤作用，但尚不清楚的是其能否通過雙向調(diào)控整合素β1、α-SMA的表達影響皮膚移植創(chuàng)面愈合。

本實驗通過建立小鼠背部全層皮膚原位自體移植模型，比較創(chuàng)面整合素β1、α-SMA的表達變化及膠原纖維表達的差異，探究仙藕乳蒲方對皮膚移植創(chuàng)面愈合的影響機制，為其臨床應用于皮膚移植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 ?倫理審查

本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心批準，批準號：LL2018011902。

1.2 ?實驗動物

40只成年雌性C57BL/6小鼠，4～6周，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗期間動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院SPF級實驗室（許可證號：SYXK湘2015-0003），溫度維持在20～22 ℃。動物飼養(yǎng)及操作均嚴格按照實驗動物倫理準則和操作指南規(guī)范執(zhí)行。

1.3 ?實驗試劑

（1）仙藕乳蒲方（專利號：201210467065.8）由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室按照本課題組已有方法制備[7];（2）免疫組化試劑：兔抗小鼠整合素β1（英國Abcam公司，批號：ab17947）;α-SMA抗體（英國Abcam公司，批號：ab5694）;通用型二步法檢測試劑盒（北京諾博萊德科技有限公司，批號：WK151518r）。

1.4 ?模型制作及分組

完成小鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，用10%水合氯醛以2.5～3.0 mL/kg的劑量腹腔注射麻醉小鼠，再在小鼠背部正中備皮形成1個4 cm×4 cm正方形裸皮區(qū)域，用絡合碘與酒精消毒處理后，在小鼠背部正中用打孔器創(chuàng)設1個直徑為1.2 cm的圓形全層皮膚缺損區(qū)域，到達深筋膜，取下來的皮片去除皮下脂肪、筋膜、血管等皮下組織，將皮片原位覆蓋于創(chuàng)面處，用4-0的無菌縫合線沿創(chuàng)緣進行間斷縫合固定。隨機將移植皮膚的小鼠分為對照組（n=20）和實驗組（n=20）。實驗組：將仙藕乳蒲方粉末均勻敷于植皮區(qū)域;對照組：不予藥物粉末特殊處理。隨后用細小無菌紗布條對移植區(qū)進行加壓包扎，于10 d后打開包扎。實驗過程中有1例（實驗組）由于麻醉不耐受死亡，2例（對照組）由于皮片感染未能成活，均視為造模失敗停止后續(xù)觀察，其余皮片均存活。

1.5 ?標本采集與檢測

分別于皮膚移植14 d、21 d采用10%的水合氯醛麻醉，在其背部切取以皮膚移植區(qū)為中心的包括皮下組織的2 cm×2 cm的標本，用4%多聚甲醛固定，常溫保存，送至湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院實驗室進行Masson染色、免疫組組織化學染色。

1.6 ?免疫組織化學染色切片觀察

將兩組免疫組織化學染色切片在Nikon 80i正置顯微鏡下觀察并攝片。兩組各時間點分別使用DSAssistant Lite軟件隨機選取6個不連續(xù)的高倍鏡視野（×400）截圖，運用Image-Pro Plus 6.0計算兩組不同時間點整合素β1及α-SMA的平均光密度值（average optical density， AOD）。

1.7 ?Masson染色切片觀察

石蠟切片脫蠟至水，依次自來水和蒸餾水洗后用Regaud蘇木精染液或Weigert蘇木精液染核5～10 min，過水充分水洗，用Masson麗春紅酸性復紅液5～10 min，再以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻并用1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min。后不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍或光綠液染5 min，再以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，最后用95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。將兩組Masson染色切片在Nikon 80i正置顯微鏡下觀察膠原纖維含量及分布，并攝片。

1.8 ?統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，兩個樣本間的比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U秩和檢驗。計量資料符合正態(tài)性以“x±s”表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ?仙藕乳蒲方對整合素β1及α-SMA的雙向調(diào)節(jié)

與對照組相比，皮膚移植術14 d，實驗組整合素β1（陽性表達部位在胞漿和胞膜中）著色更深，陽性表達多，AOD高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;而皮膚移植術21 d，實驗組整合素β1著色變淺，陽性表達降低，AOD低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1、表1。

與對照組相比，皮膚移植術14 d，實驗組α-SMA（陽性表達部位在胞漿中）著色更深，陽性表達多，AOD高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;而皮膚移植術21 d，實驗組α-SMA著色變淺，陽性表達降低，AOD低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2、表1。

2.2 ?仙藕乳蒲方對膠原纖維的影響

Masson染色顯示，皮膚移植14 d，對照組真皮層膠原纖維縱橫交錯，結(jié)構(gòu)紊亂，且分布不均勻;實驗組膠原纖維排列規(guī)律，含量豐富，分布均一。皮膚移植21 d，對照組真皮層大量粗細不均膠原顯著沉積，結(jié)構(gòu)仍紊亂無規(guī)則;實驗組真皮層沉積的膠原纖維較少，排列疏松規(guī)則。見圖3。

3 討論

皮膚移植創(chuàng)面愈合是一個涉及多種細胞和不同蛋白質(zhì)參與的復雜有序的過程，整合素β1是細胞表面重要的跨膜黏附分子，ECM中的諸多蛋白與整合素胞外段結(jié)合，胞內(nèi)段與細胞內(nèi)骨架蛋白α-SMA結(jié)合，形成ECM-整合素-細胞骨架黏附物，從而細胞內(nèi)外信號可實現(xiàn)雙向傳導，信號的雙向傳導在調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、黏附等多種生物過程都發(fā)揮了重要作用，這種機制是創(chuàng)面修復的重要一環(huán)[3-4]。李哲[8]發(fā)現(xiàn)在燒傷創(chuàng)面愈合過程中提高創(chuàng)面整合素的表達，可有效促進創(chuàng)面修復。α-SMA通過調(diào)節(jié)細胞骨架構(gòu)象，影響肌成纖維細胞遷移運動、組織收縮，是參與創(chuàng)面修復的重要物質(zhì)[9]，陳志勇等[10]在對山萘酚促進皮膚瘢痕大鼠模型創(chuàng)面愈合過程的研究中證實α-SMA的表達和創(chuàng)面肉芽組織形成以及創(chuàng)面愈合率高度正相關;張玉婷等[11]在對燒傷患者增生性瘢痕研究中發(fā)現(xiàn)，瘢痕的厚度隨整合素表達量升高而增厚;張文奪等[12]發(fā)現(xiàn)通過降低組織內(nèi)α-SMA的表達，可調(diào)節(jié)Ⅰ、Ⅲ型膠原含量比例及降低增生瘢痕的形成。

本實驗觀察到，皮膚移植14 d，實驗組整合素β1和α-SMA表達水平明顯高于對照組，而皮膚移植21 d，實驗組兩者表達水平均低于對照組（P<0.05）。Masson染色結(jié)果顯示，與對照組相比，皮膚移植14 d，實驗組膠原纖維含量較多，排列緊湊有規(guī)律;皮膚移植21 d，實驗組膠原纖維疏松、有序，更少沉積。以上結(jié)果提示，仙藕乳蒲方一方面在皮膚移植愈合早期增加整合素β1的表達，促進ECM等胞外信號向胞內(nèi)傳導，激活并聚合α-SMA，促使成纖維細胞增殖、遷移并分泌膠原纖維以填充創(chuàng)面，促進創(chuàng)面收縮，加速創(chuàng)面愈合;另一方面，在皮膚移植愈合晚期，降低整合素β1的表達，使α-SMA解聚，抑制細胞運動及膠原分泌功能，減少創(chuàng)面膠原纖維沉積，創(chuàng)面組織不至于過度收縮，降低纖維化作用使創(chuàng)面更好地塑形。綜上，仙藕乳蒲方可能對整合素β1及α-SMA的表達具有雙向調(diào)節(jié)的作用，達到促進小鼠背部皮膚移植創(chuàng)面愈合的同時降低纖維化作用。因此，我們推測仙藕乳蒲方可能對于人體皮膚移植創(chuàng)面愈合具有促愈抑疤的療效，但是有待進步一研究證實。

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