社會(huì)隔離對(duì)雌性小鼠動(dòng)情周期及中樞ERα和TH免疫活性表達(dá)的影響

程廣超 楊萍 赫晨

摘要：雌激素受體（ERα）和多巴胺（DA）可參與雌性動(dòng)物動(dòng)情周期調(diào)節(jié)，故本研究通過酪氨酸羥化酶（TH）標(biāo)記DA神經(jīng)元，探討了社會(huì)隔離對(duì)雌性動(dòng)情周期及ERα和DA的影響。成年雌性ICR小鼠社會(huì)隔離10 d后，檢測(cè)其動(dòng)情周期變化及動(dòng)情期和動(dòng)情間期中樞ERα-IR和TH-IR神經(jīng)元表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，社會(huì)隔離延長(zhǎng)了雌鼠的動(dòng)情前期和動(dòng)情期（P<0.05），但對(duì)動(dòng)情后期和動(dòng)情間期沒有影響;社會(huì)隔離和動(dòng)情周期均會(huì)顯著影響終紋床核（BNST）、內(nèi)側(cè)視前區(qū)（MPOA）和下丘腦弓狀核（AR）的ERα-IR神經(jīng)元表達(dá)（P<0.05），并對(duì)AR的ERα-IR表達(dá)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）的TH-IR神經(jīng)元表達(dá)有交互影響（P<0.05），表現(xiàn)為社會(huì)隔離減少動(dòng)情期AR的ERα-IR表達(dá)（P<0.05），增加動(dòng)情期和動(dòng)情間期TH-IR表達(dá)（P<0.05），且對(duì)動(dòng)情期的影響更明顯。提示社會(huì)隔離會(huì)干擾雌鼠的動(dòng)情周期，ERα和DA在特定腦區(qū)的變化對(duì)此具有重要調(diào)制作用。

關(guān)鍵詞：隔離;雌性小鼠;動(dòng)情周期;雌激素;多巴胺;免疫活性表達(dá)

中圖分類號(hào)： Q492 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）14-0197-05

雌性哺乳動(dòng)物的動(dòng)情周期分為動(dòng)情前期（proestrus）、動(dòng)情期（estrus）、動(dòng)情后期（metestrus） 和動(dòng)情間期（diestrus）4 個(gè)階段。在雌性的非妊娠生殖活動(dòng)中，動(dòng)情狀態(tài)呈周期性變化，卵子的形成和性激素的分泌也呈周期性波動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)情周期會(huì)影響雌性動(dòng)物的行為和情緒，如配偶選擇[1]、焦慮水平[2]、社會(huì)性學(xué)習(xí)[3]、空間記憶或目標(biāo)識(shí)別[4-5]以及對(duì)成癮藥物的敏感性等[6-7]。內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂如免疫或炎癥應(yīng)激會(huì)干擾大鼠、母羊和獼猴（rhesus macaques）的排卵周期[8-10]。此外，心理社會(huì)性應(yīng)激也會(huì)抑制促性腺激素分泌。對(duì)獼猴研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激增加再結(jié)合其他應(yīng)激源能干擾生殖激素分泌，破壞月經(jīng)周期[11-12];母羊的動(dòng)情周期對(duì)于急性及反復(fù)的心理社會(huì)應(yīng)激具有低抗性[13]。動(dòng)情周期的變化是下丘腦-垂 體- 性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）軸周期變化所致。雌激素α受體（estrogen receptor alpha，ERα）參與對(duì)HPG軸的調(diào)節(jié)，在調(diào)制生殖行為中具有關(guān)鍵作用[14-15]。多巴胺（dopamine，DA）也會(huì)影響動(dòng)情周期和排卵[16]。作為一種心理社會(huì)性應(yīng)激，長(zhǎng)期社會(huì)隔離會(huì)影響嚙齒動(dòng)物的行為、情緒和神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)[17-18]。酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）是DA合成的限速酶，本研究探討了長(zhǎng)期社會(huì)隔離對(duì)雌性小鼠動(dòng)情周期的影響及ERα和TH在動(dòng)情期和動(dòng)情間期的變化，以期探討隔離應(yīng)激對(duì)動(dòng)情周期影響的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR雌性小鼠由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)房，塑料飼養(yǎng)籠（32 cm×21.5 cm×17 cm）飼養(yǎng)，飼料和飲水充足。室溫25 ℃，光—暗周期12 h—12 h，食物、飲水充足。2016年5月開始試驗(yàn)，小鼠10周齡，共44只，平均體質(zhì)量約32 g，其中22只進(jìn)行單獨(dú)飼養(yǎng)（社會(huì)隔離），另外22只進(jìn)行群居飼養(yǎng)（每籠4～6只）。隔離10 d后，隨機(jī)取隔離和群居鼠各10只檢測(cè)動(dòng)情周期，剩下24只檢測(cè)動(dòng)情期和動(dòng)情間期的ERα和TH表達(dá)，共分為4組：隔離動(dòng)情期組（IE，n=6）、隔離動(dòng)情間期組（ID，n=6）、群居動(dòng)情期組（CE，n=6）和群居動(dòng)情間期組（CD，n=6）。

1.2 動(dòng)情周期的檢測(cè)

取小鼠陰道上皮組織涂片進(jìn)行亞甲基藍(lán)染色，根據(jù)上皮細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)確定動(dòng)情周期各階段[19]，并記錄各階段的持續(xù)時(shí)間。

1.3 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)

動(dòng)物經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉。先用4%多聚甲醛進(jìn)行灌注固定;取出腦組織放入4%多聚甲醛后固定過夜（4 ℃），后4 ℃置于30%蔗糖溶液直至組織沉底。用冰凍切片機(jī)將腦作冠狀切，片厚40 μm。用山羊血清封閉液37 ℃濕盒內(nèi)封閉1 h。滴加由抗體稀釋液稀釋的一抗：ERα（1 ∶ 100;sc-542，Santa Cruz，中杉金橋生物技術(shù)有限公司分裝）和TH（1 ∶ 2 000;ab112，Abcam，Hong Kong），4 ℃孵育72 h。0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次，共3次。滴加生物素化羊抗兔IgG（博士德生物工程有限公司，武漢），37 ℃濕盒內(nèi)孵育 1.5 h。0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次，共3次。滴加SABC試劑（博士德生物工程有限公司，武漢），37 ℃濕盒內(nèi)孵育2.5 h。采用0.01 mol/L的PBS漂洗10 min/次，共4次。DAB顯色劑顯色。常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

終紋床核（bed nucleus of the stria terminalis，BNST）、內(nèi)側(cè)視前區(qū)（medial preoptic area，MPOA）、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核（ventromedial hypothalamic nucleus，VMH）和下丘腦弓狀核（arcuate hypothalamic nucleus，AR）是ERα的重要分布區(qū)域。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）、未定帶（zona incerta，ZI）和下丘腦室旁核（paraventricular nucleus，PVN）是TH的重要分布區(qū)域，因此本研究檢測(cè)了這些腦區(qū)的ERα和TH神經(jīng)元表達(dá)。各腦區(qū)參照Paxinos & Franklin的著書以定位[20]。每只鼠選擇3張連續(xù)的切片量化，利用顯微測(cè)微尺，計(jì)算1 mm2內(nèi)單側(cè)腦區(qū)核團(tuán)的陽性神經(jīng)元數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較隔離組與對(duì)照組（群居組）的動(dòng)情周期。以隔離和動(dòng)情周期作為2個(gè)固定因素，采用two-way ANOVA分析及post hoc檢驗(yàn)ERα-IR和TH-IR神經(jīng)元數(shù)量的組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 動(dòng)情周期

3 討論

動(dòng)情周期的規(guī)律性是卵巢生殖功能正常的直接標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)，社會(huì)隔離后雌性ICR小鼠的動(dòng)情前期和動(dòng)情期延長(zhǎng)，動(dòng)情后期和動(dòng)情間期沒有變化，總的動(dòng)情周期變長(zhǎng)。動(dòng)情前期和動(dòng)情期是排卵期，動(dòng)情后期是分泌孕酮及黃體形成的時(shí)期，該結(jié)果暗示社會(huì)隔離延長(zhǎng)了排卵時(shí)間。與本試驗(yàn)結(jié)果不同的是， 有研究發(fā)現(xiàn)隔離14 d的成年雌性C57BL/6J小鼠動(dòng)情周期縮短并且腎上腺質(zhì)量增加[21]。有種觀點(diǎn)認(rèn)為，在低群體密度下，延長(zhǎng)動(dòng)情期能增加受孕的可能性，這可能是對(duì)隔離應(yīng)激的一種適應(yīng)性反應(yīng)[22]。生殖周期的形成是性類固醇激素通過作用于腦和垂體的正反饋和負(fù)反饋機(jī)制調(diào)制了黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡激素（ follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）分泌產(chǎn)生的，其中雌二醇扮演了關(guān)鍵作用。對(duì)于成年雌性，促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的分泌受到性激素正反饋和負(fù)反饋調(diào)節(jié)，排卵前高水平的雌二醇通過正反饋使GnRH形成高峰，誘導(dǎo)LH釋放并促進(jìn)排卵[23]。應(yīng)激對(duì)促性腺激素的分泌有損害，皮質(zhì)酮和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（corticotropinreleasing factor，CRF）可以干擾促性腺激素對(duì)性激素生成細(xì)胞的刺激作用[24]，并且心理社會(huì)應(yīng)激可通過減少GnRH抑制LH的分泌[25]。因此，本試驗(yàn)中小鼠動(dòng)情前期和動(dòng)情期的延長(zhǎng)，可能也是一種對(duì)隔離應(yīng)激的適應(yīng)，通過延長(zhǎng)動(dòng)情期和動(dòng)情前期補(bǔ)償排卵的下降。

動(dòng)情期隔離組與動(dòng)情期群居組相比，在BNST、MPOA和AR的ERα-IR表達(dá)減少;動(dòng)情間期隔離組與動(dòng)情間期群居組相比ERα-IR表達(dá)僅在MPOA減少，說明社會(huì)隔離在動(dòng)情期和動(dòng)情間期均會(huì)在一定腦區(qū)減少ERα的表達(dá)，但動(dòng)情期的影響似乎更廣泛。BNST的活動(dòng)與焦慮和應(yīng)激有關(guān)，BNST的差異表明社會(huì)隔離更易引起動(dòng)情期應(yīng)激和情緒的變化。ERα 表達(dá)受到外周雌激素的影響，MPOA區(qū)的雌激素受體mRNA水平在動(dòng)情期比動(dòng)情間期高[26];對(duì)雌性布氏田鼠（Lasiopodomys brandtii）研究表明，動(dòng)情期較動(dòng)情間期和動(dòng)情前期在MPOA有更高的ERα-IR細(xì)胞[27]。動(dòng)情期和動(dòng)情間期的雌二醇的基礎(chǔ)水平不同，這可能是社會(huì)隔離引起ERα 在2個(gè)階段表達(dá)水平不同的一個(gè)重要原因。MPOA主要調(diào)節(jié)性行為，并影響對(duì)異性氣味的偏好[28]。AR可調(diào)節(jié)不同的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，其功能依賴于內(nèi)在的不同神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，其中GnRH 神經(jīng)元分泌GnRH[29]，AR的ERα神經(jīng)元對(duì)雌性小鼠動(dòng)情周期和雌激素負(fù)反饋機(jī)制具有關(guān)鍵作用。雌二醇通過

AR細(xì)胞間接、跨突觸地抑制GnRH神經(jīng)元的活動(dòng)，從而抑制GnRH分泌進(jìn)入正中隆起（median eminence） [30]。因此，社會(huì)隔離可通過調(diào)節(jié)ERα繼而影響動(dòng)情周期。至于VMH，雖然參與雌性性行為[31]，但沒有證據(jù)表明VMH神經(jīng)元參與GnRH神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)[30]。

隔離組的動(dòng)情期和動(dòng)情間期分別與群居組的相比，VTA的TH表達(dá)增加，隔離組的動(dòng)情期與群居組的相比，ZI的TH表達(dá)也有增加。此外，社會(huì)隔離和動(dòng)情周期對(duì)VTA的TH表達(dá)有交互作用，隔離動(dòng)情期組和群居動(dòng)情期組分別與隔離動(dòng)情間期組及群居動(dòng)情間期組相比TH表達(dá)顯著增加。DA能神經(jīng)元的胞體主要位于VTA，TH是DA合成的限速酶，因此，這些結(jié)果說明社會(huì)隔離增加了動(dòng)情期和動(dòng)情間期的VTA的DA合成，且在動(dòng)情期這種影響更明顯。對(duì)八齒鼠（Octodon degus）研究發(fā)現(xiàn)，早期親本隔離及斷乳隔離會(huì)增加伏核（NAc）核區(qū)和殼區(qū)的TH-IR神經(jīng)纖維密度[32];大鼠長(zhǎng)期隔離后額葉皮質(zhì)中TH活性也會(huì)增加[33]。從斷乳后至成年的社會(huì)隔離會(huì)引起大鼠在VTA和NAc的DA釋放和攝取增強(qiáng)[34]。DA通過控制黃體生成激素釋放因子（luteinizing hormone releasing factor，LRF）誘導(dǎo)LH釋放[35]，并可刺激促卵泡激素釋放因子（follicle stimulating hormone releasing factor，F(xiàn)SF）分泌和LRF釋放[36]，LRF可促進(jìn)排卵，而DA水平的改變可以影響動(dòng)情周期的持續(xù)時(shí)間，例如，高水平DA會(huì)延長(zhǎng)大鼠的動(dòng)情期[16]。本研究中，隔離組在動(dòng)情期高水平的TH表達(dá)，暗示了更多的DA釋放，這可能是引起動(dòng)情期延長(zhǎng)的重要機(jī)制之一。此外，DA可以調(diào)節(jié)情緒和社會(huì)行為[37]，邊緣系統(tǒng)如BNST、MPOA、VMH的ERα也與調(diào)節(jié)社會(huì)行為有關(guān)[38]。因此，隔離應(yīng)激引起的動(dòng)情期和動(dòng)情間期ERα和TH的不同表達(dá)，改變動(dòng)情周期，并可能影響到雌性在不同動(dòng)情階段的情緒和行為。

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