補(bǔ)腎活血方對(duì)卵巢功能早衰大鼠卵巢組織外泌體相關(guān)膜蛋白的影響

李涵 劉慧萍 肖賈麗玨 楊開鋒 辛雨霏

〔摘要〕 目的 觀察補(bǔ)腎活血方對(duì)卵巢功能早衰模型大鼠卵巢組織中外泌體相關(guān)膜蛋白表達(dá)情況及卵巢組織形態(tài)和功能的影響。方法 選取30只大鼠，腹腔注射順鉑建立卵巢功能早衰模型，造模成功后隨機(jī)分為模型組、陽性對(duì)照組和中藥低、中、高劑量組，每組6只。另取6只大鼠為空白組?？瞻捉M和模型組大鼠每天灌胃蒸餾水;中藥低、中、高劑量組分別按每天9.72、19.44、38.88 g/kg劑量補(bǔ)腎活血方灌胃;陽性對(duì)照組大鼠按每天0.09 mg/kg劑量灌胃給藥戊酸雌二醇片，連續(xù)21 d。每周稱體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量增量，每天觀察大鼠動(dòng)情周期。末次給藥后于第2天取血和卵巢、胸腺、脾臟，稱臟器質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù);ELISA檢測大鼠血清中雌二醇（estradiol 2， E2）和抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）水平變化含量;HE染色觀察卵巢形態(tài)變化;免疫組織化學(xué)法檢測卵巢組織中外泌體膜蛋白CD63、CD81、CD82的表達(dá)水平;透射電鏡觀察大鼠外周血外泌體形態(tài);Western blot檢測大鼠外周血外泌體相關(guān)蛋白。結(jié)果 與空白組相比，模型組動(dòng)情周期紊亂、AMH和E2減少（P<0.05，P<0.01），體質(zhì)量和體質(zhì)量增量明顯減少（P<0.01），卵巢指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯減少而脾臟指數(shù)明顯升高（P<0.01），卵泡數(shù)和成熟卵泡明顯減少，閉鎖卵泡增多，卵巢組織CD63、CD81、CD82蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.01）。與模型組相比，中藥中、高劑量組和陽性對(duì)照組AMH和E2顯著升高（P<0.01），中藥高劑量組和陽性對(duì)照組動(dòng)情周期恢復(fù)正常，體質(zhì)量及體質(zhì)量增量明顯升高（P<0.01），卵巢指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯升高而脾臟指數(shù)降低（P<0.05，P<0.01），給藥組卵泡數(shù)依次增多，中藥高劑量組和陽性對(duì)照組蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）。透射電鏡和Western blot證明大鼠外周血外泌體提取成功。結(jié)論 補(bǔ)腎活血方可以明顯改善卵巢功能早衰的情況，其改善卵巢形態(tài)和功能的機(jī)制可能與提高外周血和卵巢中外泌體活性有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 卵巢功能早衰;補(bǔ)腎活血方;外泌體;抗米勒管激素;雌二醇;動(dòng)情周期

〔中圖分類號(hào)〕R271.9 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.003

Effect of Bushen Huoxue Recipe on exosome-related membrane proteins in ovarian

tissue of rats with premature ovarian failure

LI Han， LIU Huiping*， XIAO Jialijue， YANG Kaifeng， XIN Yufei

（Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Bushen Huoxue Recipe on the expression of exosome-related membrane proteins in ovarian tissue and the morphology and function of ovarian tissue in rats with premature ovarian failure. Methods A total of 30 rats were selected and injected with cisplatin intraperitoneally to establish the mode of premature ovarian failure. After successful modeling， they were randomly divided into model group， positive control group， low， middle and high dose groups of traditional Chinese medicine， with six rats in each group. Another six rats were selected as blank group. Rats in the blank group and model group were gavaged with distilled water every day， the rats in the low， middle and high dose groups of traditional Chinese medicine were given intragastric administration of Bushen Huoxue Recipe at the dose of 9.72， 19.44 and 38.88 g/kg， respectively， and the rats in the positive control group were given estradiol valerate tablets at the dose of 0.09 mg/kg every day for 21 d. The body weight was weighed every week， the body weight increment was calculated， and the estrous cycle of rats was observed every day. After the last administration， on the second day， the blood， ovary， thymus and spleen were taken， the organ weight was weighed and the organ index was calculated. The levels of estradiol （estradiol 2， E2） and anti-Müllerian hormone （AMH） in serum were detected by ELISA; the morphological changes of ovary were observed by HE staining; the expression levels of CD63， CD81 and CD82 in ovarian tissue were detected by immunohistochemical method. The morphology of exocrine body in rat peripheral blood was observed by transmission electron microscope， the exocrine related protein in rat peripheral blood was detected by Western blot. Results Compared with the blank group， the estrous cycle disorder， AMH and E2 were decreased （P<0.01， P<0.05）， the body weight and body weight increment were significantly decreased （P<0.01）， the ovarian index and thymus index were significantly decreased， and the spleen index was significantly decreased， the number of follicles and mature follicles decreased significantly， the atretic follicles increased， and the protein expression levels of CD63， CD81， and CD82 in ovarian tissue decreased significantly （P<0.01） in the model group. Compared with the model group， AMH and E2 in the medium and high dose groups of traditional Chinese medicine and the positive control group were significantly increased （P<0.01）. The estrous cycle in the traditional Chinese medicine high-dose group and the positive control group returned to normal， and the body weight and body weight increment increased significantly （P<0.01）， the ovarian index and thymus index were significantly increased while the spleen index was decreased （P<0.01， P<0.05）， the number of follicles in the administration group increased in turn， and the protein expression in the traditional Chinese medicine high-dose group and the positive control group was significantly increased （P<0.01）. Transmission electron microscopy and Western blot proved that the extraction of exosomes from peripheral blood of rats was successful. Conclusion Bushen Huoxue Recipe can significantly improve the situation of premature ovarian failure， and the mechanism of improving ovarian morphology and function may be related to the increase of peripheral blood and ovarian exocrine activity.26B27259-3B61-4944-B236-2C38F1FAA5F1

〔Keywords〕 premature ovarian failure; Bushen Huoxue Recipe; exosome; anti-Müllerian hormone; estradiol 2; estrous cycle

卵巢功能早衰（premature ovarian failure， POF）是指在女性40歲之前出現(xiàn)圍絕經(jīng)期綜合征，而月經(jīng)初潮年齡正常或延遲、第二性征發(fā)育正常[1]。POF導(dǎo)致女性提前老齡化，出現(xiàn)持續(xù)6個(gè)月以上閉經(jīng)，生殖器官萎縮，性功能降低甚至不孕，促卵泡激素和黃體生成素質(zhì)量濃度升高，雌二醇（estradiol 2， E2）和抗米勒管激素（anti-Müllerian hormone， AMH）質(zhì)量濃度降低的一種婦科內(nèi)分泌性疾病[2]。臨床上，POF患者表現(xiàn)為月經(jīng)失調(diào)甚至閉經(jīng)、不孕、性欲低下、陰部干燥、生殖器及第二性征逐漸退化等圍絕經(jīng)期癥狀[3]。POF可以分為兩類，一類是卵泡數(shù)量的消失，一類是卵泡功能的消失[4]。西醫(yī)認(rèn)為此病病因復(fù)雜，治療比較困難，目前主要采用性激素替代療法，但不能恢復(fù)卵巢周期性功能，且有明顯副作用[5]。POF可歸屬于中醫(yī)學(xué)“閉經(jīng)”“不孕”“血枯”等范疇[6]。補(bǔ)腎活血方是國家名老中醫(yī)尤昭玲教授的經(jīng)驗(yàn)方，已在臨床應(yīng)用多年，對(duì)早發(fā)性卵巢功能不全有良好療效[7]。

近幾年外泌體的研究，尤其是在婦科疾病診療領(lǐng)域的研究成為一個(gè)熱點(diǎn)[8]。外泌體是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵參與者，可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、炎癥、感染和腫瘤等病理生理過程[9]。外泌體由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等組成。外泌體的蛋白質(zhì)主要包括膜蛋白（CD9、CD63、CD81、CD82）、熱休克蛋白（HSP60、HSP70、HSP90）、膜聯(lián)蛋白（膜聯(lián)蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ）、胞質(zhì)蛋白（肌動(dòng)蛋白、微管蛋白）和細(xì)胞特異性抗原（MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ）[10-14]。外泌體在卵母細(xì)胞的生長發(fā)育中起著非常重要的作用，POF與外泌體的減少有一定關(guān)聯(lián)。隨著外泌體的研究深入，人們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞中外泌體對(duì)早發(fā)性卵巢功能不全或POF的治療有很好的療效，這也為POF的治療提供新思路[15-17]。本研究通過建立POF大鼠模型，采用具有滋陰、益氣、活血功效的補(bǔ)腎活血方治療，初步研究了補(bǔ)腎活血方對(duì)于POF大鼠的干預(yù)作用以及對(duì)外泌體的調(diào)節(jié)作用，為POF的發(fā)病機(jī)制研究和治療提供新的思路。

1 材料

1.1 ?動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠36只，體質(zhì)量（150±10） g，6周齡，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0009。3只一籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏障環(huán)境中，安靜狀態(tài)下，于消毒滅菌IVC籠里喂養(yǎng)，飲水不受限制、顆粒型飼料喂養(yǎng)，每3天換1次滅菌墊料和水。飼養(yǎng)環(huán)境盡量通風(fēng)，12 h明暗周期，溫度控制在25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。本實(shí)驗(yàn)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查編號(hào)：LLBH-202011140001，大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后繼續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2 ?藥品

所有中藥飲片均購買自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。補(bǔ)腎活血方藥物組成：熟地黃15 g，酒黃精12 g，枸杞子12 g，酒山茱萸12 g，當(dāng)歸15 g，白芍12 g，川芎9 g，丹參12 g，燀桃仁9 g（批號(hào)分別為2008303、200803、NG20090902、TH20082402、TH20090301、TH20091405、TH20082404、HY20091606、2020082901），煎煮后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮為生藥含量4 g/mL;氯氨鉑（25 mg，美國SIGMA公司，批號(hào)：MKCL0026）;戊酸雌二醇片（1 mg/片，德國拜耳公司，批號(hào)：558A）。

1.3 ?主要試劑

兔抗CD63抗體（美國Affinit公司，批號(hào)：Ab-AF5117）;兔抗CD81抗體、兔抗CD82抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)分別為bs-6934R、bs-1470R）;外泌體提取試劑盒（上海貝博生物公司，批號(hào)：BB-39012）;兔抗ALIX抗體、兔抗FLOTILLIN 1、兔抗CD9抗體均購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司（批號(hào)分別為ab88388、ab41927、ab92726）;BSA（武漢華美生物工程有限公司，批號(hào)：CSB-MC00031a0101）;山羊抗鼠（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，批號(hào)：A4416）;ECL發(fā)光試劑盒（美國通用電氣公司，批號(hào)：RPN2109）;AMH、E2 ELISA試劑盒均購于江蘇菲亞生物科技有限公司（批號(hào)分別為201230R35、201230R11）。

1.4 ?主要儀器

切片機(jī)、攤片機(jī)、雙目顯微鏡均購自德國LEICA公司（型號(hào)分別為RM2235、HI1210、DMLB2）;生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司，型號(hào)：Motic BA410）;凝膠成像分析系統(tǒng)、蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備均購自美國Bio-Rad公司（型號(hào)分別為ChemiDoc XRS、1704150）;高速離心機(jī)、高速臺(tái)式離心機(jī)、超速離心機(jī)均購自美國Beckman公司（型號(hào)分別為J2-21、GS-15R、L-90K）;微量移液槍（德國艾本德公司，型號(hào)：3120000240）;脫色搖床（上海新波公司，型號(hào)：Ty-B）。

2 方法

2.1 ?POF大鼠模型制備與分組

將30只大鼠參照文獻(xiàn)[18]建立POF模型，每次予順鉑4.0 mg/kg，隔周腹腔注射1次，共2次，通過每天觀察動(dòng)情周期，動(dòng)情周期紊亂，大鼠體質(zhì)量增長緩慢，毛發(fā)粗糙無光澤判斷造模均成功[18]。空白組每次予生理鹽水4.0 mg/kg，隔周腹腔注射1次，共2次。將造模成功后的30只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽性對(duì)照組和中藥低、中、高劑量組，每組6只。另取6只大鼠為空白組。26B27259-3B61-4944-B236-2C38F1FAA5F1

2.2 ?給藥

空白組和模型組大鼠每天灌服蒸餾水;補(bǔ)腎活血中藥組大鼠每天分別按38.88、19.44、9.72 g/kg高、中、低劑量灌胃，其中低劑量是大鼠與70 kg成人臨床用量等效劑量，中劑量和高劑量分別為等效劑量的2倍與4倍;陽性對(duì)照組大鼠每天按0.09 mg/kg的劑量灌胃給藥戊酸雌二醇片，與70 kg成人臨床用量等效劑量相當(dāng)。各組灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)給藥21 d。

2.3 ?檢測指標(biāo)與方法

2.3.1 ?動(dòng)情周期 ?于造模結(jié)束后第5～8天，參照文獻(xiàn)[19]用10 mL移液槍吸取10 mL生理鹽水在大鼠陰道內(nèi)吹打幾次后，吸出液體進(jìn)行涂片。待自然干燥后滴加2滴瑞氏染液，1 min后加1.5倍的PBS，10 min后沖洗，待干燥后封片鏡檢。

2.3.2 ?ELISA檢測大鼠血清中AMH和E2水平變化含量 ?于給藥結(jié)束的第2天，同時(shí)所有大鼠禁食禁水8 h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.4 mL/100 g），腹主動(dòng)脈取血，3500 r/min，離心半徑6 cm，離心15 min后取上清液置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。按ELISA試劑盒說明書步驟操作，在450 nm波長下的酶標(biāo)儀測定光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本指標(biāo)含量。

2.3.3 ?HE染色觀察卵巢組織病理形態(tài) ?取出兩側(cè)卵巢，稱重后一側(cè)置于-80 ℃冰箱內(nèi)，一側(cè)于4%多聚甲醛中浸泡。于多聚甲醛中浸泡的卵巢用梯度乙醇脫水后，用石蠟包埋，然后切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)大小及各級(jí)卵泡數(shù)以及總卵泡數(shù)。

2.3.4 ?臟器指數(shù)及體質(zhì)量增量 ?取卵巢、脾臟、胸腺進(jìn)行稱量，計(jì)算臟器指數(shù)（臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量）。體質(zhì)量增量即取材當(dāng)天的體質(zhì)量減去大鼠進(jìn)動(dòng)物房第1天的體質(zhì)量。

2.3.5 ?免疫組織化學(xué)法檢測卵巢組織中外泌體膜蛋白CD63、CD81、CD82 ?包埋切片后二甲苯脫蠟，過氧化氯溶液滅活后熱修復(fù)，自然冷卻后加CD63、CD81、CD82一抗（均按照1∶100稀釋），PBS沖洗后加二抗（1∶200）。孵育及沖洗后DAB顯色，自來水沖洗后染色，待干燥后封片拍照，并用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析軟件分析圖片，陽性表達(dá)顯示為棕黃色。

2.3.6 ?血清外泌體的提取 ?按外泌體提取試劑盒操作。將血清4 ℃下3000×g離心15 min棄沉淀，再10 000×g離心20 min棄沉淀，加入提取液A混勻后加入提取液B混勻，4 ℃冰箱內(nèi)過夜。第2天10 000×g離心60 min，棄上清液，用外泌體保存液重懸沉淀即得到外泌體樣品。

2.3.7 ?透射電鏡觀察外泌體 ?取PBS重懸的外泌體懸液20 mL，滴于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置2 min，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液30 mL在室溫下負(fù)染5 min，濾紙吸干負(fù)染液，白熾燈烤干，將銅網(wǎng)安裝于樣品槽中，透射電鏡下觀察。

2.3.8 ?Western blot鑒定外泌體 ?提取的外泌體等體積加入RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟，冰上裂解30 min后，樣品分裝凍存于-20 ℃冰箱內(nèi)備用。測定蛋白濃度后制備分離膠，然后加入上樣buffer混勻，沸水煮10 min，冰上5 min。加入樣品開始電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，然后脫脂牛奶室溫封閉90 min后分別加入ALIX、FLOTILLIN和CD9一抗（均按照1∶1000稀釋），4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，ECL顯色后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

2.4 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理

應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以“x±s”表示，如果方差齊，則采用單因素方差分析比較組間數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布且方差齊者用LSD檢驗(yàn)，如果方差不齊者用Tamhane檢驗(yàn)，如果不符合正態(tài)分布者用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?各組大鼠陰道脫落細(xì)胞病理形態(tài)

空白組大鼠有完整的動(dòng)情周期，即動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期;而模型組大鼠則長期處于動(dòng)情前期和動(dòng)情間期。詳見圖1。

3.2 ?各組大鼠血清中AMH和E2水平

與空白組比較，模型組AMH和E2水平均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。與模型組比較，中藥中、高劑量組和陽性對(duì)照組AMH和E2水平均明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，中藥低劑量組AMH水平明顯升高（P<0.05）。中藥低劑量組E2水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與陽性對(duì)照組比較，中藥低劑量組AMH水平明顯降低（P<0.05）。中藥各劑量組E2水平和中藥中、高劑量組AMH水平與陽性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。中藥各劑量組間AMH和E2水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見表1。

3.3 ?各組大鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)

與空白組比較，模型組卵巢指數(shù)、胸腺指數(shù)、體質(zhì)量、體質(zhì)量增量均明顯減少（P<0.01），脾臟指數(shù)明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，中藥高劑量組和陽性對(duì)照組卵巢指數(shù)、胸腺指數(shù)、體質(zhì)量、體質(zhì)量增量均明顯升高（P<0.05，P<0.01），脾臟指數(shù)明顯降低（P<0.05，P<0.01）。與模型組比較，中藥中劑量組胸腺指數(shù)、體質(zhì)量均明顯升高（P<0.05）。中藥中劑量組卵巢指數(shù)、脾臟指數(shù)、體質(zhì)量增量與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。中藥低劑量組卵巢指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、體質(zhì)量、體質(zhì)量增量與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與陽性對(duì)照組比較，中藥低劑量組卵巢指數(shù)、體質(zhì)量和體質(zhì)量增量均明顯降低（P<0.05），脾臟指數(shù)明顯升高（P<0.05）。中藥低劑量組胸腺指數(shù)和中藥中、高劑量組卵巢指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、體質(zhì)量、體質(zhì)量增量與陽性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與中藥高劑量組比較，中藥低劑量組卵巢指數(shù)、體質(zhì)量、體質(zhì)量增量均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。中藥低劑量組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)與中藥高劑量組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。中藥低劑量組與中藥中劑量組、中藥中劑量組與中藥高劑量組間卵巢指數(shù)、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、體質(zhì)量、體質(zhì)量增量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見表2。26B27259-3B61-4944-B236-2C38F1FAA5F1

3.4 ?各組大鼠卵巢組織病理形態(tài)學(xué)觀察

空白組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)清晰，卵巢內(nèi)可見正常卵泡;模型組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)紊亂，以初級(jí)卵泡和閉鎖卵泡居多;中藥低劑量組與模型組相似，但較模型組有一定改善;中藥中劑量組開始出現(xiàn)一些成熟卵泡，且閉鎖卵泡和初級(jí)卵泡減少;中藥高劑量組和陽性對(duì)照組卵巢形態(tài)均明顯改善，卵泡數(shù)量增多，有成熟卵泡，閉鎖卵泡數(shù)量低，與空白組相似。詳見圖2。

3.5 ?各組大鼠卵巢組織中外泌體膜蛋白CD63、CD81、CD82表達(dá)

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織CD63、CD81、CD82蛋白表達(dá)均明顯下降（P<0.01）。與模型組比較，中藥高劑量組和陽性對(duì)照組CD63、CD81、CD82蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.01）。中藥低、中劑量組CD63、CD81、CD82蛋白表達(dá)與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與陽性對(duì)照組比較，中藥低、中劑量組CD63、CD81、CD82蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。中藥高劑量組CD63、CD81、CD82蛋白表達(dá)與陽性對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與中藥高劑量組比較，中藥低劑量組CD63、CD81、CD82蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05，P<0.01），中藥中劑量組CD82蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）。中藥低劑量組與中藥中劑量組、中藥中劑量組與中藥高劑量組間CD82蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。中藥低劑量組與中藥中劑量組、中藥中劑量組與中藥高劑量組間CD63、CD81蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見圖3、表3。

3.6 ?各組大鼠透射電鏡下外泌體形態(tài)觀察

空白組、模型組、中藥各劑量組和陽性對(duì)照組的外泌體均具有外泌體獨(dú)特的雙膜雙杯狀結(jié)構(gòu)，而且電鏡下的粒徑范圍為50～150 nm，符合文獻(xiàn)[15]報(bào)道的外泌體粒徑大小，說明各組外泌體提取成功。詳見圖4。

3.7 ?各組外泌體標(biāo)志性蛋白鑒定

各組外泌體中均有標(biāo)志性蛋白ALIX、FLOTILLIN和CD9的表達(dá)，說明提取的50～150 nm微粒為外泌體。詳見圖5。

4 討論

POF是女性內(nèi)分泌疾病的一種，也是臨床上造成不孕的原因之一，其發(fā)病與免疫功能紊亂、遺傳、放射治療、化學(xué)治療等因素相關(guān)[20-21]。

腎主藏精，主生殖。POF出現(xiàn)天癸衰竭，主要責(zé)之于腎精不足，不能司生殖之職。而腎虛精虧不能充養(yǎng)血脈及心、肝、脾、肺四臟，導(dǎo)致四臟氣機(jī)郁滯，氣為血之帥，氣機(jī)不通則血液流通不暢，進(jìn)而阻滯沖任，形成瘀血。瘀血阻滯經(jīng)絡(luò)胞宮，影響新血生成，進(jìn)一步加重病情。而臨床通過超聲檢查也發(fā)現(xiàn)POF患者卵巢動(dòng)脈血流信號(hào)稀少纖細(xì)，或者流速過低難以探測，證明了瘀血是本病發(fā)展過程中的重要病理因素。這說明POF的中醫(yī)病機(jī)主要為腎虛血瘀，所以補(bǔ)腎活血法也成為POF的主要治法。國家名老中醫(yī)尤昭玲教授經(jīng)多年臨床實(shí)踐，將左歸丸化裁為補(bǔ)腎活血方，主要用來治療腎虛血瘀型POF。補(bǔ)腎活血方由熟地黃、酒黃精、酒山茱萸、白芍、當(dāng)歸、川芎、燀桃仁、枸杞子、丹參這9味藥組成。酒山茱萸為君藥，可以補(bǔ)腎填精滋陰養(yǎng)血，白芍重在養(yǎng)血活血，且白芍可以增加E2的水平，對(duì)女性生殖系統(tǒng)疾病有療效[22]。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血方主要通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來來改善卵巢功能[23]以及可以抑制細(xì)胞凋亡[24-25]，從而達(dá)到治療POF的目的，同時(shí)補(bǔ)腎活血方也可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路修復(fù)大鼠卵巢的自噬損傷[26-27]。

HUANG等[28]發(fā)現(xiàn)將人脂肪干細(xì)胞來源外泌體移植到原發(fā)性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency， POI）小鼠模型后可以抑制顆粒細(xì)胞的凋亡，增加卵泡的數(shù)量，使卵巢功能得以修復(fù)。ZHANG等[29]發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞外泌體通過傳遞功能性miRNAs，抑制化療誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡，同時(shí)還能減輕急性血管損傷，以此保護(hù)卵泡的發(fā)育。DING等[30]發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體可恢復(fù)POI模型小鼠的卵巢表型和功能，促進(jìn)環(huán)磷酰胺損傷的人顆粒細(xì)胞和卵巢細(xì)胞的增殖。HAN等[31]首次證明了將來自中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell， CHO）的外泌體添加到CHO細(xì)胞培養(yǎng)液中，能顯著抑制細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞自噬與POF的發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)，現(xiàn)在一些研究表明外泌體和自噬之間通過共享分子和細(xì)胞器存在直接的聯(lián)系，這對(duì)正常機(jī)體的生理病理有重要意義，自噬相關(guān)分子參與外泌體的生物發(fā)生過程而非自噬過程[32-34]，以自噬內(nèi)涵體的形式進(jìn)行的自噬和外泌體的釋放之間是相互拮抗的關(guān)系。因此，本實(shí)驗(yàn)研究從補(bǔ)腎活血方是否有療效以及是否對(duì)外泌體含量有影響入手，來觀察補(bǔ)腎活血方與外泌體的相關(guān)性，補(bǔ)腎活血方是否可以通過提高外泌體的含量來治療POF。

本研究結(jié)果顯示POF大鼠模型動(dòng)情周期紊亂，體質(zhì)量增長緩慢，卵巢指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)變小，卵巢出現(xiàn)萎縮變小，卵泡數(shù)目減少，閉鎖卵泡增多，而且外周血外泌體和卵巢中的外泌體膜蛋白CD63、CD81、CD82表達(dá)降低。補(bǔ)腎活血方可以使動(dòng)情周期恢復(fù)正常，改善卵巢組織形態(tài)，促進(jìn)卵泡生長發(fā)育成熟，同時(shí)可以使POF大鼠體質(zhì)量增加接近正常，卵巢指數(shù)、胸腺指數(shù)增加，脾臟指數(shù)降低，這可能與其增加外泌體的含量尤其是增加外周血外泌體和卵巢中的外泌體膜蛋白CD63、CD81、CD82有關(guān)。用藥后POF大鼠的胸腺指數(shù)增加和脾臟指數(shù)降低，說明補(bǔ)腎活血方有一定的改善免疫功能作用。通過觀察免疫組織化學(xué)法圖片，可以發(fā)現(xiàn)卵巢組織中外泌體主要存在于卵泡液中。用藥后，除模型組外其余各組都恢復(fù)正常的動(dòng)情周期，因而結(jié)果中只將空白組和模型組進(jìn)行對(duì)比。在用Western blot鑒定外泌體之前，通過其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥低、中劑量組與模型組相比差異不大，因而選取療效更好的中藥高劑量組和陽性對(duì)照組與模型組和空白組進(jìn)行外泌體的Western blot鑒定。上述實(shí)驗(yàn)說明補(bǔ)腎活血方對(duì)POF有一定的療效，其作用機(jī)制可能與補(bǔ)腎活血方增加外周血和卵巢組織中的外泌體來控制和緩解POF有關(guān)。26B27259-3B61-4944-B236-2C38F1FAA5F1

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