急性髓系白血病動物模型及中藥干預(yù)的研究進展

李位智子 余湘雪 高姚 余文超 伍振輝 曾英堅

〔摘要〕 急性髓系白血病（acute myeloid leukemia， AML）是一種惡性增殖性疾病，發(fā)病機制尚未明確，目前臨床治療措施有限且進展緩慢。中藥治療AML具有一定優(yōu)勢，但其作用機制仍有待深入探討。理想的實驗動物模型有助于揭示AML發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制，對于潛在靶點的發(fā)現(xiàn)、治療方法的開發(fā)及中藥抗AML機制的研究至關(guān)重要。近年來，眾多學(xué)者為闡明AML的發(fā)病機制及中藥抗AML作用機制做了大量研究，并取得相關(guān)成果。在此基礎(chǔ)上，本文系統(tǒng)總結(jié)了AML實驗動物的選擇、動物模型的制備方法以及各自的特點和評價方法，并總結(jié)了AML動物模型的中藥干預(yù)研究進展，為今后AML動物模型研究及中醫(yī)藥治療AML提供理論參考。

〔關(guān)鍵詞〕 急性髓系白血病;動物模型;評價方法;中藥;作用機制

〔中圖分類號〕R285 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.029

Research progress of acute myeloid leukemia animal models and

intervention with traditional Chinese medicine

LI Weizhizi1， YU Xiangxue1， GAO Yao1， YU Wenchao1， WU Zhenhui1，2*， ZENG Yingjian1，2*

（1. Jiangxi University of Chinese Medicine， Nanchang， Jiangxi 330000， China; 2. The Affiliated Hospital of Jiangxi

University of Chinese Medicine， Nanchang， Jiangxi 330006， China）

〔Abstract〕 Acute myeloid leukemia （AML） is a malignant proliferative disease， and its pathogenesis is not clear， which led to the limited and tardy progress of treatment measures. Traditional Chinese medicine （TCM） has certain advantages in the treatment of AML， but its mechanism of action needs further exploration. The ideal experimental animal model is helpful to reveal the key mechanism of the occurrence and development of AML and play an important role in the discovery of potential targets， the development of therapeutic approaches and the study of anti-AML mechanism of TCM. In recent years， many scholars have done a lot of research to elucidate the pathogenesis of AML and the mechanism of anti-AML action of TCM， which have achieved relevant results. On this basis， this review summarizes the selection of experimental animals for AML， animal model preparation methods for AML， as well as their respective advantages and disadvantages and evaluation methods， and summarizes the research progress of TCM intervention in animal models of AML， providing theoretical reference for future research on animal models of AML and TCM treatment of AML.

〔Keywords〕 acute myeloid leukemia; animal model; evaluation method; traditional Chinese medicine; mechanism of action

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia， AML）以髓系祖細胞的異常增殖導(dǎo)致正常成熟血細胞生成不足并引起骨髓浸潤為主要特征，以出血、發(fā)熱、骨痛為主要表現(xiàn)，部分患者還伴有中樞神經(jīng)受損，大多病情危急，預(yù)后較差，嚴重者威脅生命[1]。我國1991—2015年白血病死亡率總體呈上升趨勢，且年齡成為影響病情預(yù)后的重要因素[2]。

中醫(yī)學(xué)將AML歸屬于“血癌”“虛勞”等范疇。多數(shù)醫(yī)家認為其病位在骨髓，病因病機可歸納為精氣內(nèi)虛、復(fù)感外邪，內(nèi)外相合，導(dǎo)致骨髓受損、臟腑功能失調(diào)，以祛邪解毒、攻補兼施、健脾益腎為主要治法[3-4]。AML的發(fā)病機制涉及髓系干細胞克隆群的異常增殖和分化、染色體易位和重排、基因突變等方面，但其根本的發(fā)病機制尚未完全明確[5]。當前的治療手段仍然基于阿糖胞苷聯(lián)合蒽環(huán)類藥物療法以及同種異體干細胞移植，但是AML患者仍存在生存率低、緩解率低、復(fù)發(fā)率高等問題，尋求新的有效治療方法是臨床治療AML迫切需要解決的問題，而建立合適的動物模型是實現(xiàn)這一目標的重要基礎(chǔ)。因此，本文系統(tǒng)總結(jié)了近些年AML動物模型的研究進展，旨在為AML的病理機制及防治策略提供理論支撐和實驗依據(jù)。

1 實驗動物

1.1 ?嚙齒類動物

目前，應(yīng)用于AML造模的實驗動物以嚙齒類為主，嚙齒類動物具有易于獲取、價格較低、模型穩(wěn)定且繁殖速度快等優(yōu)勢[6]，受到廣大實驗者的青睞?，F(xiàn)將常見白血病模型所用的嚙齒類動物品系簡要總結(jié)。詳見表1。

1.2 ?非嚙齒類動物

斑馬魚的造血系統(tǒng)和分子遺傳機制與人類高度相合，并且易于觀察腫瘤細胞的擴散及轉(zhuǎn)移[7]，除了應(yīng)用于研究血液相關(guān)疾病，還可以研究與腫瘤相關(guān)的分子途徑、細胞環(huán)境在腫瘤進展中的作用以及鑒定抗腫瘤分子等[8]。果蠅具有遺傳簡單、操作方便的優(yōu)勢，是研究白血病染色體復(fù)雜易位的良好模型[9]。另外，靈長類動物由于獲取困難，在建模中較少選用。

2 白血病模型的分類

常用的白血病模型有4種：自發(fā)模型、誘發(fā)模型、移植模型、基因修飾模型。詳見圖1。

2.1 ?自發(fā)模型

建立自發(fā)模型最為簡單，某些小鼠可不經(jīng)人工處理而自發(fā)產(chǎn)生白血病，只需在飼養(yǎng)過程中定期觀察即可。自發(fā)模型可以較好地模擬人類白血病的產(chǎn)生以及發(fā)生發(fā)展過程。但它也存在某些缺陷，例如：實驗周期長，所耗費用較高;個體之間白血病發(fā)病情況難以統(tǒng)一，不易大批量獲得病程相似的實驗動物等。因此，很少應(yīng)用于抗白血病藥物臨床前藥物篩選研究。常用的實驗小鼠有C58小鼠、AK小鼠、AKR小鼠，其中C58小鼠12月齡時白血病發(fā)病率高達90%[10]。

2.2 ?誘發(fā)模型

2.2.1 ?化學(xué)誘發(fā)模型 ?小鼠長期接觸具有致癌作用的化學(xué)制劑可誘發(fā)產(chǎn)生白血病，如苯、亞硝胺類化合物、3-甲基膽蒽等。HE等[11]利用苯誘發(fā)CBA/Ca小鼠產(chǎn)生與AML相似的異常癥狀，包括肝脾腫大、骨髓中CD34+髓系細胞升高等，成功建立了單一骨髓免疫表型特征苯誘導(dǎo)的CBA/Ca小鼠AML模型，并發(fā)現(xiàn)NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）基因的過表達與其密切相關(guān)，為進一步研究苯誘導(dǎo)白血病的具體機制及對應(yīng)治療提供了良好基礎(chǔ)。

2.2.2 ?病毒誘發(fā)模型 ?逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小鼠模型因具有周期短、耗時少、易于檢測癌基因功能的優(yōu)勢[12]，受到廣大研究者的青睞?；菪幕鄣萚13]通過利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MLL-AF9構(gòu)建小鼠AML模型，受體小鼠移植MLL-AF9感染的骨髓Lin-細胞后，出現(xiàn)白血病細胞浸潤及白血病靶基因表達明顯上調(diào)。這為研究白血病的生理病理機制及靶向白血病藥物的篩選提供了基礎(chǔ)平臺。

2.2.3 ?輻射誘發(fā)模型 ?常用的電離輻射有X射線、γ射線，對輻射敏感的小鼠品系有BF小鼠、SJL/J小鼠、CH3小鼠、CBA小鼠[14]。有研究表明，它們的共同特征為小鼠del2缺失[15]，其中，SJL/J雌性小鼠全身經(jīng)3 Gy劑量X線照射后，部分小鼠出現(xiàn)與人AML相似的癥狀，并且患病比例隨著輻射時間的延長而增加[16]。王存邦等[17]將BALB/c小鼠暴露于2-3 Gy劑量X線照射下，并通過尾靜脈接種K562細胞，結(jié)果顯示小鼠外周血和骨髓中的原始及早幼粒樣白血病細胞明顯升高，發(fā)病率為100%且無自發(fā)緩解，提示小鼠白血病建模成功。據(jù)相關(guān)文獻報道，長期低劑量輻射也可增加患病風險[18]。STOUTEN等[19]將CBA/H小鼠暴露于低劑量輻射下誘導(dǎo)AML產(chǎn)生，以此研究低劑量電離輻射暴露與白血病發(fā)生率之間的關(guān)系，結(jié)果顯示發(fā)病率與輻射暴露后小鼠所攜帶Sfpi1基因缺失細胞的數(shù)量成正比。

2.3 ?移植模型

2.3.1 ?同種移植模型 ?構(gòu)建同種移植模型需要先通過輻射誘發(fā)、病毒誘發(fā)、基因剔除等方法使小鼠體內(nèi)產(chǎn)生白血病細胞，然后在同基因型小鼠中連續(xù)傳代，使后代小鼠發(fā)生白血病。與異種移植模型相比，同種移植模型可以避免移植后免疫排斥反應(yīng)的產(chǎn)生[20]。在白血病移植模型構(gòu)建當中，一般選擇同種移植來構(gòu)建急性淋巴細胞白血病模型，而構(gòu)建AML模型時較少選用。

2.3.2 ?異種移植模型 ?異種移植模型將人源白血病細胞或原代細胞系移植于免疫缺陷小鼠體內(nèi)[21]，是目前最常用的動物模型。隨著研究人員的不斷探索和實驗需要，人源腫瘤組織異種移植（patient-derived xenografts， PDX）模型應(yīng)運而生，它將患者新鮮腫瘤組織直接移植于小鼠體內(nèi)[22]，不經(jīng)過體外培養(yǎng)，高度保留了原始腫瘤的異質(zhì)性和干細胞特性[23]，使得腫瘤生長微環(huán)境更接近于患者體內(nèi)微環(huán)境，與臨床最為接近。葉永斌等[24]通過顯微注射法將KG-1a細胞經(jīng)MitoRed熒光標記后植入受精后48 h的AB系斑馬魚的卵黃囊中，觀察到經(jīng)標記的KG-1a細胞可在斑馬魚體內(nèi)存活并侵襲組織器官，并檢測到卵黃囊中增殖的細胞與植入前的KG-1a細胞在形態(tài)上具有相似性，成功建立異種異體AML斑馬魚模型。ZHOU等[25]將THP-1-GFP細胞尾靜脈注射于NSG小鼠建立異種移植模型，以此來評估去泛素酶抑制劑WP1130抗白血病能力。通過分析實驗條件，發(fā)現(xiàn)在建模過程中應(yīng)用相同的小鼠品系、接種方法、接種細胞及細胞濃度，其模型成功率也會有差異。譚霖等[26]將HL-60細胞腹腔接種于經(jīng)環(huán)磷酰胺預(yù)處理的雌性SCID小鼠，第34天時骨髓切片觀察到HL-60細胞浸潤且外周血CD33的陽性率明顯升高，模型成功率高達100%。然而，楊紅等[27]腹腔注射HL-60于雄性SCID小鼠和NOD/SCID小鼠，比較不同品系免疫缺陷鼠的成瘤率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建NOD/SCID小鼠AML模型的成瘤率為100%，但SCID小鼠的成瘤率只有30%。兩位研究者的實驗結(jié)果存在差異，可能是因為未對SCID小鼠進行預(yù)處理，小鼠體內(nèi)仍存有部分免疫功能且非特異性免疫功能正常，導(dǎo)致成瘤率低;選用性別不同的SCID小鼠，成瘤率可能也不同，具體原因及機制有待進一步深入研究。

2.4 ?基因修飾模型

2.4.1 ?轉(zhuǎn)基因模型 ?轉(zhuǎn)基因模型是指將所需的目的基因?qū)胧荏w動物基因組，改變受體動物的遺傳信息而建立的動物模型。目前，應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法有顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法、畸胎瘤細胞植入法、胚胎干細胞法。YANG等[28]建立了Vav1啟動子驅(qū)動的Flag-ASXL1Y588X轉(zhuǎn)基因小鼠模型，使其在造血系統(tǒng)中表達FLAG-ASXL1aa1-587蛋白，并證實在本次模型中靶向ASXL1截斷突變?yōu)樗柘祼盒匝耗[瘤的治療提供研究思路。叉頭盒蛋白M1（forkhead box protein M1， FOXM1）作為轉(zhuǎn)錄致癌基因參與白血病的發(fā)生發(fā)展以及耐藥等過程[29]。陳謹?shù)萚30]初步證實FOXM1通過靶向調(diào)控B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）的表達來促進AML的發(fā)生發(fā)展。此外，KHAN等[31]利用FOXM1過表達轉(zhuǎn)基因小鼠模型，證實了FOXM1過表達可誘導(dǎo)AML對阿糖胞苷的耐藥性。因此，在抗AML基礎(chǔ)研究中，這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型可作為強大的實驗工具，為研究AML的發(fā)生機制提供了新思路與新方法。

2.4.2 ?基因敲除模型 ?基因敲除模型主要用于研究特定基因在體內(nèi)的生物學(xué)功能[32]。彭璐蕓等[33]通過建立敲除RNA特異性腺苷脫氨酶（adenosine deaminase

acting on RNA 1， ADAR1）的小鼠MLL-AF9融合基因AML模型，發(fā)現(xiàn)敲除ADARl能夠改善AML的發(fā)病情況，并增加白血病細胞的凋亡。在基因敲除基礎(chǔ)上發(fā)展而來的條件基因敲除技術(shù)，能夠?qū)游锏幕蛐揎椷M行時間和空間上的調(diào)控[34]。GREENBLATT等[35]利用條件基因敲除小鼠研究組蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1（calcium release-activated calcium channel protein 1， CARM1）基因在正常造血和惡性造血中的不同作用，結(jié)果顯示敲除CARM1基因在正常造血系統(tǒng)中幾乎不產(chǎn)生影響，但在惡性造血中能夠?qū)毎芷谶M程產(chǎn)生損害作用，并最終誘導(dǎo)細胞凋亡。

3 白血病動物模型評價

AML發(fā)病機制的探索及藥物療效的評價離不開動物模型的建立，模型評價指標主要有：（1）體貌體征觀察包括精神、行為活動、體質(zhì)量、食欲等;（2）外周血檢查包括白細胞、血紅蛋白、血小板;（3）形態(tài)學(xué)檢查包括外周血及骨髓涂片;（4）病理組織學(xué)檢查包括制作小鼠肝、脾、腎病理切片，觀察白血病細胞浸潤情況;（5）免疫學(xué)檢查包括流式細胞儀檢測小鼠CD33、CD13陽性表達率。雖然動物在造血、遺傳、免疫等方面與人類高度相似，但依舊無法完全體現(xiàn)白血病癥狀的復(fù)雜性和病情變化的多樣性。目前，對于動物模型的評價指標沒有統(tǒng)一的標準?，F(xiàn)將AML動物模型進行分類和總結(jié)，旨在為模型標準化提供理論參考。詳見表2。

4 動物模型在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

盡管在臨床上采用化療等傳統(tǒng)西醫(yī)治療來緩解AML已被證實有效，但依然存在很多不足，例如化療毒副作用強、老年患者耐受性差、易發(fā)生耐藥和感染[44]等。近年來，中醫(yī)藥通過辨證分析和應(yīng)用中藥活性成分來治療AML取得顯著療效[45-46]。單味中藥、中藥單體、中藥復(fù)方也具有抑制細胞增殖、促進細胞凋亡、誘導(dǎo)細胞分化、逆轉(zhuǎn)細胞耐藥等作用[47-48]，這使得中藥聯(lián)合化療逐步成為當前治療AML的熱點方案。在中藥研究中，多采用異種移植動物模型來探索具體的作用機制。

4.1 ?單味中藥及提取物

目前，基于AML動物模型的中藥功效研究逐步增多。研究已證實雄黃對AML-M3細胞具有誘導(dǎo)凋亡和促進分化雙重效應(yīng)[49]，但雄黃的溶解性差，需要長期高劑量給藥才能產(chǎn)生藥效。MA等[50]將HL-60細胞靜脈接種于NOD/SCID小鼠，發(fā)現(xiàn)制備水溶性聚合物包封的雄黃能夠在一定程度上解決溶解性差的問題，有效地提高了雄黃的生物利用度。此外，針對中藥提取物的抗AML活性研究也已得到相關(guān)證實?？馒櫟萚51]研究淫羊藿提取物對AML模型小鼠的細胞生物學(xué)影響，發(fā)現(xiàn)其藥理作用類似于阿糖胞苷，通過下調(diào)CD13和CD71以誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡，增強PTEN蛋白表達以抑制HL-60細胞增殖。同時，基于NOD/SCID-AML小鼠模型觀察防風提取物減毒增效功能的實驗研究，發(fā)現(xiàn)防風提取物具有增強三氧化二砷對NOD/SCID-AML小鼠模型的治療作用，并能改善小鼠臟器受損情況[52]。上述研究表明，基于AML小鼠模型的相關(guān)中藥單藥研究仍以中藥提取物為主。

4.2 ?中藥單體

CHEN等[53]通過構(gòu)建異種移植模型發(fā)現(xiàn)大黃素可能是通過阻滯AML細胞介導(dǎo)的（protein kinase B， Akt）和蛋白激酶B 細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinases， ERK）信號通路來發(fā)揮抗增殖和促凋亡作用。MA等[54]通過體內(nèi)實驗證實蘇木乙酸乙酯提取物具有抑制AML細胞增殖、誘導(dǎo)AML細胞線粒體凋亡和分化的作用。王穎等[55]發(fā)現(xiàn)苦參堿抑制HL-60細胞增殖的機制可能與增強PTEN蛋白表達及調(diào)整Th1/Th2細胞平衡相關(guān)。此外，中西醫(yī)聯(lián)合治療AML也取得顯著療效，研究表明雷公藤甲素聯(lián)合維奈托克通過相互調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白并激活內(nèi)源性凋亡通路來產(chǎn)生抗AML作用[56]。而當歸多糖聯(lián)合阿糖胞苷通過調(diào)節(jié)衰老相關(guān)蛋白P16、Rb、CDK4及Cyclin D1表達，進而促進白血病細胞衰老[57]。

4.3 ?中藥復(fù)方

祝龍等[58]研究發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰方（黃芪、生地黃、旱蓮草、天冬、白術(shù)、甘草、太子參、黃精、麥冬、云苓、白花蛇舌草、蒲公英、女貞子）灌胃用于白血病大鼠中，能降低炎癥因子水平，減輕白細胞組織浸潤。張瑾等[59]研究發(fā)現(xiàn)四鮮湯鮮藥汁（鮮生地、鮮小薊、鮮蒲公英、鮮白茅根）能夠改善AML模型小鼠的活動情況以及相應(yīng)免疫功能，刺激細胞發(fā)揮腫瘤作用。

上述總結(jié)詳見表3。因此，基于各種AML動物模型的優(yōu)缺點以及實驗?zāi)康?，研究中藥及?fù)方治療AML的作用特點，揭示其分子機制，有利于挖掘中藥潛在的功效價值，為加快中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供了實驗基礎(chǔ)。

5 總結(jié)與展望

立足于中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論，將動物模型應(yīng)用于中醫(yī)藥抗AML的研究受到眾多研究者的青睞，但大多數(shù)都局限于中藥藥理研究。近年來，病證結(jié)合模型作為連接中醫(yī)臨床與基礎(chǔ)研究的橋梁，逐步成為中醫(yī)藥動物模型的發(fā)展趨勢，但由于其模型建立尚存在疾病與證型關(guān)聯(lián)性弱、實驗動物與患病人群存在體質(zhì)差異、證型維持易受環(huán)境因素影響、模型成功與否缺乏系統(tǒng)的評價等問題，目前，AML病證結(jié)合動物模型研究較少。因此，如何根據(jù)中醫(yī)證候的不同特點、密切聯(lián)系“病”與“證”，優(yōu)化建模方法，規(guī)范模型應(yīng)用，使病證結(jié)合模型既符合中醫(yī)學(xué)理論和臨床實際，又能充分體現(xiàn)證候?qū)嵸|(zhì)是中西醫(yī)學(xué)者探求和努力的方向之一。

綜上所述，在揭示AML的發(fā)病機制、藥物的活性評價、中醫(yī)藥的潛在作用靶點等方面，這些動物模型發(fā)揮了不可替代的重要作用。但需要注意的是，每種動物模型都有各自的特點及適用范圍，目前還沒有一種動物模型可以完全概括AML的所有特征，而是對AML某個特定方向進行模擬。因此，基于各種模型的局限性，確保所用模型符合實驗?zāi)康?，根?jù)研究方向應(yīng)用模型才是至關(guān)重要的。

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