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    玉屏風(fēng)散對(duì)肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎豚鼠血清中TSLP及相關(guān)因子的影響

    2022-07-02 17:04:00黃鈞偉馬壯壯齊同飛鄧晗薇楊偉麗朱鎮(zhèn)華
    關(guān)鍵詞:變應(yīng)性鼻炎中醫(yī)

    黃鈞偉 馬壯壯 齊同飛 鄧晗薇 楊偉麗 朱鎮(zhèn)華

    〔摘要〕 目的 觀察玉屏風(fēng)散對(duì)肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎豚鼠炎癥反應(yīng)的治療效果及其機(jī)制。方法 將40只雄性豚鼠分為空白組、模型組、氯雷他定組及玉屏風(fēng)散組,每組10只。通過煙熏+卵清蛋白注射致敏加滴鼻激發(fā)的方法,誘導(dǎo)建立肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎模型。玉屏風(fēng)散組每日給予4.52 g/kg玉屏風(fēng)散,氯雷他定組每日給予0.903 mg/kg氯雷他定片,空白組與模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液。用藥治療15 d后,采用疊加量化法測(cè)定豚鼠用藥前后鼻部癥狀評(píng)分;取鼻黏膜組織進(jìn)行HE染色;采用ELISA法檢測(cè)血清IgE、IL-4、IL-13、TSLP水平。結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示,模型組豚鼠鼻腔黏膜固有層出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),腺體增生和肥大,血管擴(kuò)張和充血;玉屏風(fēng)散組和氯雷他定組豚鼠鼻黏膜組織相較模型組病理狀況有所改善,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕,腺體增生少,結(jié)構(gòu)基本完整。治療前,與空白組相比,模型組鼻部癥狀評(píng)分明顯升高(P<0.01),血清IgE、IL-4、IL-13、TSLP表達(dá)水平均顯著上升(P<0.01);治療后,玉屏風(fēng)散組和氯雷他定組豚鼠相較于模型組的鼻部癥狀評(píng)分顯著降低(P<0.01),血清IgE、IL-4、IL-13、TSLP表達(dá)水平降低(P<0.05)。結(jié)論 玉屏風(fēng)散可明顯緩解肺氣虛型變應(yīng)性鼻炎豚鼠癥狀,其途徑可能是通過降低血清中TSLP的含量,抑制相關(guān)炎癥因子表達(dá),進(jìn)而減輕鼻部癥狀。

    〔關(guān)鍵詞〕 變應(yīng)性鼻炎;玉屏風(fēng)散;中醫(yī);氯雷他定;Th1/Th2平衡

    〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2022.06.006

    Effect of Yupingfeng Powder on TSLP and related factors in the serum of guinea pigs model with allergic rhinitis with lung Qi deficiency syndrome

    HUANG Junwei1, MA Zhuangzhuang1, QI Tongfei1, DENG Hanwei2, YANG Weili2, ZHU Zhenhua2*

    (1. Hunan Umiversity of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410208, China;

    2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410007, China)

    〔Abstract〕 Objective To explore the therapeutic effect and mechanism of Yupingfeng Powder on inflammatory response of allergic rhinitis guinea pigs with lung Qi deficiency syndrome. Methods Forty male guinea pigs were randomly divided into the blank group, the model group, the Yupingfeng Powder group and the loratadine group (n=10). The allergic rhinitis model of lung Qi deficiency syndrome was established by smoking+ovalbumin injection sensitization and nasal instillation stimulation, Yupingfeng Powder group was given 4.52 g/kg Yupingfeng Powder per day, loratadine group was given 0.903 mg/kg loratadine tablets per day, blank group and model group were given an equal volume of 0.9% sodium chloride solution. After 15 d of treatment, the nasal symptom score of guinea pigs before and after treatment was measured by superposition quantitative method; the nasal mucosa was taken for HE staining; the levels of serum IgE, IL-4, IL-13 and TSLP were detected by ELISA. Results HE staining results showed that a large number of lymphocytes and eosinophils infiltrated, nasal gland hyperplasia and hypertrophy, vasodilation and hyperemia appeared in the model group. The nasal mucosal tissue of guinea pigs in the Yupingfeng Powder group and loratadine group improved compared with the pathological status of the model group, the inflammatory cell infiltration was significantly reduced, the glandular hyperplasia was small, and the structure was basically complete. Before treatment, compared with the blank group, the nasal symptom score of the model group was significantly increased (P<0.01), and the serum IgE, IL-4, IL-13, and TSLP levels were significantly increased (P<0.01). After treatment, nasal symptom scores of the Yupingfeng Powder group and loratadine group were significantly lower (P<0.01) and the levels of serum IgE, IL-4, IL-13, and TSLP were lower (P<0.05) compared with the model group. Conclusion Yupingfeng Powder can effectively improve the symptoms of lung Qi deficiency guinea pigs with allergic rhinitis, which may be achieved by reducing the content of TSLP in serum, inhibiting the expression of related inflammatory factors, and then alleviating nasal symptoms.2705A005-E220-4297-A60B-57E281FD5708

    〔Keywords〕 allergic rhinitis; Yupingfeng Powder; traditional Chinese medicine; loratadine; balance of Th1/Th2

    變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是機(jī)體接觸變應(yīng)原(過敏原)后由免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)介導(dǎo),多種免疫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞共同參與的鼻黏膜非感染性炎癥性疾病[1]。近年來,AR的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì),其發(fā)病率為10%~40%[2]。AR引起的鼻部癥狀(鼻塞、流鼻涕、鼻癢、打噴嚏等)及其并發(fā)癥,既降低了患者的生活質(zhì)量,也加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。目前,國(guó)際上對(duì)AR的主要臨床方案治療存在高復(fù)發(fā)性,需要進(jìn)一步提高和探討[4]。胸腺基質(zhì)淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)最早在胸腺基質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),并在多項(xiàng)研究中證實(shí)其能升高Th2表達(dá)水平,推測(cè)其與變態(tài)反應(yīng)性疾病重要發(fā)病機(jī)制Th1/Th2的免疫失衡有著緊密聯(lián)系[5-6],玉屏風(fēng)散作為益氣固表的經(jīng)典用方,廣泛應(yīng)用于治療肺氣虛型AR[7]。朱鎮(zhèn)華教授在臨床中使用玉屏風(fēng)散治療肺氣虛型AR患者多年,發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)散能夠明顯緩解AR患者癥狀、減少并發(fā)癥出現(xiàn)和病情復(fù)發(fā)概率,治療效果頗好[8]。本實(shí)驗(yàn)通過建立肺氣虛型AR豚鼠模型,觀察玉屏風(fēng)散的治療效果和其對(duì)TSLP及其相關(guān)因子水平的影響,為治療AR尋找新靶點(diǎn),也給玉屏風(fēng)散的臨床治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 ?動(dòng)物選擇

    英國(guó)種雜色豚鼠(雄性)40只,體質(zhì)量250~300 g,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào):SCXK(湘)2020-0005,并分籠飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室中,常規(guī)飼料飲食飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(備案編號(hào)LLBH-202007020001),符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理原則。

    1.2 ?實(shí)驗(yàn)藥材

    玉屏風(fēng)散組成:黃芪20 g,白術(shù)20 g,防風(fēng)10 g。中藥飲片由湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供,氯雷他定片(拜耳醫(yī)藥上海有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào):H10970410,批號(hào):JS08187)。

    1.3 ?主要試劑

    雞卵清蛋白(ovalbumin, OVA)(索萊寶生物公司,批號(hào):A8041);氫氧化鋁(美國(guó)Thermo公司,批號(hào):PF201964);IgE ELISA試劑盒(批號(hào):FY3700-A)、白介素-4(interleukin 4, IL-4)ELISA試劑盒(批號(hào):FY3692-A)、白介素-13(interleukin 13, IL-13)ELISA 試劑盒(批號(hào):FY3735-A)、TSLP ELISA試劑盒(批號(hào):FY6007-A)均購(gòu)自江蘇菲亞生物科技有限公司;烏拉坦(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):MF-CD00007966)。

    1.4 ?主要儀器

    Tianshi 988洗板機(jī)(北京拓普分析儀器有限責(zé)任公司);Rayto RT-6100酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司);TG16W微量高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司);TGL16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司);HT-111B恒溫?fù)u床(上海赫田科學(xué)儀器有限公司);AE1204電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司);XB220A瑞士PRECISA電子分析天平(深圳市朗普電子科技有限公司);81-2恒溫磁力攪拌器(北京世紀(jì)科信科學(xué)儀器有限公司)。

    1.5 ?動(dòng)物模型制備和評(píng)價(jià)方法

    依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將40只豚鼠分為空白組、模型組、氯雷他定組、玉屏風(fēng)散組,每組10只。先通過7 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)期,其中空白組不進(jìn)行AR模型制備操作(只在正常環(huán)境中喂養(yǎng),每日給予0.9%氯化鈉注射液2 mL灌胃1次)。

    模型組、氯雷他定組、玉屏風(fēng)散組為造模組,按煙熏+卵清蛋白注射致敏加滴鼻激發(fā)的方法誘導(dǎo)建立肺氣虛型AR模型。

    1.5.1 ?肺氣虛型AR豚鼠模型制備 ?根據(jù)陳小野的煙熏法改良方法[9],建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺氣虛型模型。肺氣虛模型成功標(biāo)準(zhǔn)參照《實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué)》[9]。肺氣虛型動(dòng)物模型制備完成后第2天,依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行AR豚鼠模型的制備[10-11]。在強(qiáng)化致敏操作結(jié)束,豚鼠休息1周后,給予豚鼠1% OVA生理鹽水溶液滴鼻達(dá)到鼻腔局部激發(fā)目的,每側(cè)鼻孔40 μL/次,每日1次,共7 d。

    1.5.2 ?肺氣虛型AR豚鼠模型制備評(píng)價(jià) ?肺氣虛模型成功標(biāo)準(zhǔn)參照《實(shí)用中醫(yī)證候動(dòng)物模型學(xué)》及其他相關(guān)研究[9-10]。觀察記錄動(dòng)物宏觀表征,包括活動(dòng)狀況、精神狀態(tài)、飲食情況、毛發(fā)等情況。肺氣虛型豚鼠常見癥狀:豚鼠出現(xiàn)精神萎靡(神疲乏力)、蜷足抱團(tuán)活動(dòng)力差(惡風(fēng)畏寒)、進(jìn)食量減少、聲音輕微、口鼻分泌物增多清稀、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)枯槁零亂等。

    在最后1次鼻腔局部激發(fā)用藥后30 min內(nèi),觀察豚鼠撓鼻、打噴嚏、流涕癥狀表現(xiàn)。根據(jù)趙秀杰等[12]的癥狀疊加量化計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。鼻癢:輕輕擦鼻計(jì)1分;頻繁抓鼻計(jì)2分;抓鼻、面不止,到處蹭計(jì)3分。打噴嚏數(shù):1~3個(gè)計(jì)1分,4~10個(gè)計(jì)2分,11個(gè)以上計(jì)3分。流鼻涕:流至鼻前孔計(jì)1分,超過鼻前孔計(jì)2分,流涕不止計(jì)3分。當(dāng)其行為學(xué)總評(píng)分>5分時(shí)則造模成功。

    1.6 ?給藥方式

    給藥方法采取灌胃給藥,給藥劑量依據(jù)人臨床用藥用量換算,以60 kg人為標(biāo)準(zhǔn),按照體表面積-劑量換算法計(jì)算豚鼠用藥劑量,玉屏風(fēng)散給藥劑量為4.52 g/(kg·d),氯雷他定片給藥劑量為0.903 mg/(kg·d)。其余兩組豚鼠(空白組與模型組)喂予等量的0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)治療15 d,每日分2次給藥。2705A005-E220-4297-A60B-57E281FD5708

    1.7 ?ELISA法測(cè)定豚鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TSLP含量

    豚鼠經(jīng)10%的烏拉坦麻醉后,通過心臟取血法收集豚鼠新鮮血液至無抗凝采血管中,室溫下靜置1 h后,離心(3500 r/min,10 min,離心半徑7 cm)取上清液,-20 ℃保存等待,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定IgE、IL-4、IL-13及TSLP的水平。

    1.8 ?HE染色觀察鼻黏膜組織形態(tài)

    豚鼠斷頭處死,迅速剝離鼻骨附近皮膚后,打開雙鼻腔,取下鼻中隔并分離兩側(cè)鼻中隔黏膜,平鋪于硬紙片上,放入4%多聚甲醛溶液固定,經(jīng)石蠟包埋切片,用HE染色,光鏡下觀察其病理組織形態(tài)。

    1.9 ?統(tǒng)計(jì)方法

    應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以“x±s”表示,當(dāng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊時(shí),兩組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ?豚鼠行為學(xué)評(píng)價(jià)

    經(jīng)肺氣虛型動(dòng)物模型造模后,與空白組相比,造模的豚鼠出現(xiàn)進(jìn)食量減少,精神萎靡,叫聲減弱,偶爾可聞咳嗽聲,鼻孔有清稀分泌物流出,毛發(fā)枯槁無光且易脫落等表現(xiàn),表示肺氣虛型豚鼠模型已經(jīng)造模成功。用藥治療后,玉屏風(fēng)散組和氯雷他定組豚鼠相較于模型組毛發(fā)相對(duì)光澤、活動(dòng)增加、咳嗽與搔抓口鼻部次數(shù)減少、鼻孔分泌物減少,兩組間未見明顯差異。

    治療前,與空白組比較,模型組豚鼠鼻部癥狀評(píng)分明顯升高(P<0.01)。經(jīng)過治療后,與模型組比較,氯雷他定組、玉屏風(fēng)散組評(píng)分顯著降低(P<0.01)。與治療前比較,氯雷他定組和玉屏風(fēng)散組治療后的評(píng)分降低(P<0.05);氯雷他定組和玉屏風(fēng)散組評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

    2.2 ?各組鼻黏膜組織病理變化

    空白組豚鼠鼻腔黏膜上皮結(jié)構(gòu)較整齊,有少量嗜酸性粒細(xì)胞。模型組豚鼠鼻腔黏膜固有層出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn),腺體增生和肥大,血管擴(kuò)張和充血。玉屏風(fēng)散組和氯雷他定組相較模型組病理狀況有所改善,氯雷他定組腺體增生少,僅有少量嗜酸性粒細(xì)胞;玉屏風(fēng)散組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕,腺體增生少,結(jié)構(gòu)基本完整。詳見圖1。

    2.3 ?各組豚鼠血清IgE、IL-4、IL-13及TSLP表達(dá)水平比較

    與空白組相比,模型組血清IgE、IL-4、IL-13、TSLP表達(dá)水平均顯著上升(P<0.01)。與模型組比較,氯雷他定組和玉屏風(fēng)散組血清IgE、IL-4、IL-13、TSLP表達(dá)水平均降低(P<0.05)。氯雷他定組和玉屏風(fēng)散組血清IgE、IL-4、IL-13、TSLP表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

    3 討論

    中醫(yī)認(rèn)為AR的病因病機(jī)多為肺、脾、腎三臟虛損,其中由于肺臟虧損導(dǎo)致的肺氣虛型最為常見。肺主宣發(fā),外合皮毛,肺氣虛則衛(wèi)氣不固表,腠理疏松,風(fēng)寒外邪乘虛而入,肺失清肅,導(dǎo)致疾病的發(fā)生。玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)組成。黃芪作為君藥,溫補(bǔ)肺脾之氣的同時(shí)益氣固表;白術(shù)健脾益氣為臣藥;再佐以防風(fēng)走表而散風(fēng)邪,合黃芪、白術(shù)以扶正祛邪。全方固表而不留邪,祛邪而不傷正,有補(bǔ)中寓疏、散中寓補(bǔ)之意。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[13-14],玉屏風(fēng)散能夠上調(diào)AR小鼠鼻腔灌洗液中IL-10、TGF-β1的細(xì)胞因子表達(dá)水平,抑制AR大鼠血漿中GATA-3表達(dá)水平,提高T-bet表達(dá)水平,從而達(dá)到治療效果。臨床上,玉屏風(fēng)散在肺氣虛型變應(yīng)性疾病的防治方面發(fā)揮可靠和穩(wěn)定的效果[15]。玉屏風(fēng)散既可以提高患者生活質(zhì)量,也可避免機(jī)體在持續(xù)激素治療過程中產(chǎn)生的不良反應(yīng)(如鼻出血、咽炎、咳嗽、頭疼等)[16-17]。

    現(xiàn)代病理學(xué)認(rèn)為,AR是特應(yīng)性個(gè)體接觸變應(yīng)原后,由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性炎癥性疾病[18-19]。其中Th2免疫反應(yīng)占優(yōu)勢(shì),而導(dǎo)致的Th1/Th2免疫失衡被認(rèn)為是誘發(fā)AR的主要發(fā)病機(jī)制[20]。將Th1/Th2免疫失衡和中醫(yī)病因病機(jī)進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究,尋找抑制Th2免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)體內(nèi)Th1/Th2免疫失衡的治療靶點(diǎn),將利于AR患者的治療。最近的研究表明,TSLP是一種類IL-17細(xì)胞因子,在變應(yīng)性疾病中高表達(dá),并能升高Th2表達(dá)水平,與Th1/Th2的失衡有著緊密聯(lián)系,是變應(yīng)性疾病的重要啟動(dòng)因子[21]。TSLP促進(jìn)髓樣樹突狀細(xì)胞(myeloid dendritic cells,mDCs)釋放的OX40L,OX40L調(diào)控Th1、Th2細(xì)胞的分化活動(dòng),在觸發(fā)Th2型免疫應(yīng)答的過程中起到關(guān)鍵作用[22]。TSLP-OX4OL信號(hào)通路可能是治療變應(yīng)性疾病的潛在分子機(jī)制。Th2細(xì)胞分泌的IL-4和IL-13是AR發(fā)病過程中的重要炎性因子[23]。IL-4是IgE同型轉(zhuǎn)換因子,可以誘導(dǎo)免疫球蛋白類轉(zhuǎn)換為IgG和IgE,提供B細(xì)胞的活化信號(hào),合成IgE抗體,IgE抗體與肥大細(xì)胞的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放和浸潤(rùn)鼻黏膜,從而引起鼻塞、打噴嚏、流清涕等AR的臨床癥狀。IL-13在加劇氣道高反應(yīng)、嗜酸性粒細(xì)胞的活化和募集以及黏液纖毛分化等活動(dòng)中擁有重要地位。同時(shí)IL-4和IL-13能作為反映Th2/IgE介導(dǎo)的免疫性疾病較為穩(wěn)定的分子標(biāo)志物[24-25]。所以,能把降低IL-4、IL-13含量,減少IgE合成視作是防治AR的重要途徑之一[26]。綜上所述,細(xì)胞因子TSLP、IL-4、IL-13在AR中起著重要作用。

    本研究證明,玉屏風(fēng)散能夠有效緩解肺氣虛型AR豚鼠的鼻部癥狀。HE染色結(jié)果充分證明,玉屏風(fēng)散能夠明顯降低肺氣虛型AR豚鼠鼻黏膜水腫程度,減輕鼻黏膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組相比,肺氣虛型AR模型組豚鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TSLP表達(dá)水平增高(P<0.01),說明肺氣虛型AR發(fā)病過程中TSLP及其相關(guān)炎性因子會(huì)被激活。與模型組相比,給予玉屏風(fēng)散、氯雷他定片干預(yù)后,IgE、IL-4、IL-13、TSLP表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)(P<0.05)。因此可以推測(cè),玉屏風(fēng)散能夠通過抑制豚鼠血液中TSLP及Th2型免疫失衡反應(yīng)相關(guān)因子IgE、IL-4、IL-13的表達(dá)水平,從而調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡,緩解鼻部變應(yīng)性炎癥反應(yīng),達(dá)到治療肺氣虛型AR的目的。2705A005-E220-4297-A60B-57E281FD5708

    本實(shí)驗(yàn)不足之處:本次實(shí)驗(yàn)中藥組缺少多劑量組比較,且在治療肺氣虛型AR的過程中,玉屏風(fēng)散相較于氯雷他定片等西藥能否進(jìn)一步維持疾病的穩(wěn)態(tài)并減少其復(fù)發(fā),需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

    參考文獻(xiàn)

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