埃及伊蚊來源半胱亞磺酸脫羧酶的性質(zhì)解析

鄭文慧，劉佳偉，劉子銘，周哲敏，劉中美

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

半胱亞磺酸脫羧酶(cysteine sulfinate decarboxylase，EC 4.1.1.36 6.3.2.5 AeCSAD)作為脫羧酶類中的一種，與谷氨酸脫羧酶、真核來源天冬氨酸脫羧酶同為磷酸吡哆醛(pyridoxal 5-phosphatemonohydrate，PLP)依賴型的蛋白酶。最早從動(dòng)物肝臟中分離得到，具有催化半胱亞磺酸生成?；撬岬纳锘钚訹1]，對(duì)于哺乳動(dòng)物早期性器官發(fā)育[2]和生命活動(dòng)的正常進(jìn)行具有重要作用。半胱亞磺酸脫羧酶除了具有催化半胱亞磺酸生成?；撬岬幕钚酝?，還可以催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸[3-5]。

β-丙氨酸雖然是一種非蛋白氨基酸，但在各個(gè)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，是一種具有高應(yīng)用價(jià)值的β-型氨基酸。在醫(yī)藥領(lǐng)域，β-丙氨酸是重要的醫(yī)藥前體，可用于合成維生素B5[6]、肌肽[7]、巴柳氮[8]、帕米磷酸鈉等；在食品領(lǐng)域，β-丙氨酸既可提高人工甜味劑的口感，達(dá)到改善食品風(fēng)味的效果[9]，又因?yàn)楦咝У目寡趸饔茫勺鳛樘烊坏氖称繁ｕr劑延長食品保質(zhì)期；在畜牧業(yè)，可作為飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖，可有效提高仔雞的生產(chǎn)性能和肉質(zhì)口感[10]；在環(huán)境領(lǐng)域，由β-丙氨酸合成的聚β-丙氨酸有凈化絮凝的作用[11]，可用于污水處理；在化工領(lǐng)域，可用作鉛中毒解毒劑和電鍍緩蝕劑[12]。

生物法合成α-丙氨酸主要可以分為微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法，都涉及到的一個(gè)關(guān)鍵酶——L-天冬氨酸-α-脫羧酶。目前的研究主要集中在原核來源L-天冬氨酸-α-脫羧酶[13]，但原核來源的L-天冬氨酸-α-脫羧酶需要經(jīng)過自剪切才能具有活性[14]，并且存在酶活性低和自失活的問題[15]。BORODINA等[16]將赤擬谷盜來源的半胱亞磺酸脫羧酶與大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌來源的L-天冬氨酸-α-脫羧酶進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)真核來源的半胱亞磺酸脫羧酶具有更高的催化活性，高宇[17]、王超等[18]對(duì)真核來源的半胱亞磺酸脫羧酶也進(jìn)行了異源表達(dá)，證明真核來源的半胱亞磺酸脫羧酶較原核來源的L-天冬氨酸-α-脫羧酶具有更高的催化活性。

鑒于真核來源的半胱亞磺酸脫羧酶催化L-天冬氨酸的活性比原核來源的L-天冬氨酸-α-脫羧酶活性要高，我們將目光投向真核來源的半胱亞磺酸脫羧酶。本研究在大腸桿菌中成功表達(dá)埃及伊蚊來源的AeCSAD，并通過添加標(biāo)簽的方式有效提高了可溶性表達(dá)。對(duì)野生酶和帶標(biāo)簽酶(sumo-AeCSAD)的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征，建立了從富馬酸到β-丙氨酸的全細(xì)胞催化工藝，為生物法合成β-丙氨酸提供了理論支持和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

以pET-28a質(zhì)粒作為表達(dá)載體，構(gòu)建質(zhì)粒宿主菌為Escherichia.coliJM109，表達(dá)宿主菌為大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，感受態(tài)細(xì)胞購于安徽通用生物技術(shù)有限公司。該基因(NC_035108.1)在密碼子使用圖譜分析(http://www.gcua.schoedl.de)網(wǎng)站上進(jìn)行密碼子優(yōu)化，由安徽通用生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.2 試劑與設(shè)備

種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2YT培養(yǎng)基。酵母提取物、蛋白胨，Oxford公司；Primer STAR MAX DNA 聚合酶、Gibson重組試劑盒，上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；L-天冬氨酸、β-丙氨酸、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)、卡那霉素及其他試劑，國產(chǎn)分析純；衍生試劑苯異硫氰酸酯(phenyl isothiocyanate，PITC)，Sigma公司；sumo蛋白酶，安徽通用生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

以半胱亞磺酸脫羧酶基因序列和pET-28a質(zhì)?；蛐蛄袨槟０逶O(shè)計(jì)引物構(gòu)建重組質(zhì)粒。將目的基因成功插入質(zhì)粒后，繼續(xù)設(shè)計(jì)引物將sumo標(biāo)簽(NC_015446.3)和strep標(biāo)簽插入目的蛋白N端。引物序列如表1所示。

表1 本研究所用引物序列Table 1 The primer sequences used in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因工程菌E.coliBL21/pET28a(+)-AeCSAD構(gòu)建

以合成的半胱亞磺酸脫羧酶基因序列為模板，利用上述引物通過正向PCR獲得目的基因片段，以pET-28a質(zhì)粒基因序列為模板，通過反向PCR獲得質(zhì)粒骨架片段，擴(kuò)增后的PCR片段通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的PCR片段膠回收并進(jìn)行柱純化。利用目的基因片段和質(zhì)粒骨架片段具有的互補(bǔ)序列進(jìn)行同源重組，以實(shí)現(xiàn)目的基因與載體的連接，獲得重組質(zhì)粒pET28a-AeCSAD，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coliJM109，涂于卡那抗性平板篩選陽性克隆子送去測序，將測序正確的菌株提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21用于后續(xù)表達(dá)，并保存于保菌管中。

獲得重組質(zhì)粒后，設(shè)計(jì)在目的蛋白N端添加sumo標(biāo)簽以提高目的蛋白在上清液中的可溶性表達(dá)，在sumo標(biāo)簽和目的基因之間添加strep標(biāo)簽，通過親和層析純化蛋白。構(gòu)建方法同上所述，通過同源重組的方法進(jìn)行片段連接。將成功添加sumo標(biāo)簽和strep標(biāo)簽的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21用于后續(xù)表達(dá)，并將菌株保存于甘油管中。

1.2.2 AeCSAD誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將甘油管中的E.coliBL21/pET28a(+)-sumo-AeCSAD劃線于卡那抗性的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h；在平板上挑單個(gè)菌落接種于質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那抗性的LB試管培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)，以2%接種量轉(zhuǎn)接入100 mL的2YT培養(yǎng)基中，37 ℃孵育2～3 h左右，待細(xì)胞生長至OD600值為0.6～0.8，溫度降為20 ℃，添加終濃度0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)12～20 h。之后可以通過SDS-PAGE(5%濃縮膠，12%分離膠)確定重組蛋白的表達(dá)是否正確。

誘導(dǎo)結(jié)束后12 000 r/min離心5 min收集菌液，將收集后的細(xì)胞用結(jié)合緩沖液A(20 mmol/L Na2HPO4·12H2O，280 mmol/L NaCl，6 mmol/L KCl，pH 7.4)懸浮，置于冰上超聲破碎，在300 W的功率下破4 s，停6 s，持續(xù)30 min，待細(xì)胞懸浮液澄清，12 000 r/min離心40 min使細(xì)胞碎片沉淀，取上清液用0.22 μm濾膜過濾。

使用AKTA純化儀(GE Healthcare UK Ltd.)進(jìn)行蛋白純化，按照操作手冊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。先用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液A平衡柱子，待各參數(shù)穩(wěn)定后，將10 mL細(xì)胞裂解上清液應(yīng)用于strep柱，繼續(xù)用結(jié)合緩沖液A平衡柱子，洗去雜蛋白。用10倍柱體積的洗脫緩沖液B(20 mmol/L Na2HPO4·12H2O，280 mmol/L NaCl，6 mmol/L KCl，2.5 mmol/L脫硫生物素，pH 6.5)將目的蛋白及其變體從柱上線性洗脫下來，獲得sumo-AeCSAD純酶。繼續(xù)用結(jié)合緩沖液A平衡柱子直至各項(xiàng)參數(shù)穩(wěn)定再上下一個(gè)樣品。

將收集到的純酶進(jìn)行一定濃度的稀釋，以牛乳血清為標(biāo)樣，通過Bradford法測定蛋白濃度。根據(jù)測得純酶的濃度，按照sumo蛋白酶的使用說明，1 mg融合蛋白添加10 μL sumo蛋白酶用于切除sumo標(biāo)簽，添加終濃度為150 mmol/L NaCl，混勻上述體系后4 ℃反應(yīng)16 h。按照上述純化方法，去除sumo標(biāo)簽和sumo蛋白酶，獲得AeCSAD純酶。重新通過Bradford法測定蛋白濃度。

1.2.3L-天冬氨酸和β-丙氨酸的檢測方法

底物L(fēng)-天冬氨酸和產(chǎn)物β-丙氨酸通過和PITC衍生獲得衍生產(chǎn)物，然后采用HPLC方法進(jìn)行檢測。

具體的衍生方法為：將反應(yīng)液上清液進(jìn)行一定比例的稀釋，取500 μL置于2 mL的EP管里，加入250 μL 0.1 mol/L 三乙胺乙腈溶液和250 μL 0.1 mol/L PITC乙腈溶液，充分混勻后置于暗處，避光衍生45～60 min，衍生結(jié)束后加入750 μL正己烷終止反應(yīng)，渦旋振蕩10 s，靜止2 min直至溶液分層，用一次性注射器吸取下層反應(yīng)液700 μL，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，最后打入液相小瓶中，蓋上蓋子，防止乙腈揮發(fā)，放入液相樣品盤中進(jìn)行檢測。

在液相的檢測過程中，色譜柱采用La Chrome C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相A為80%的乙腈水溶液，流動(dòng)相B為V(0.1 mol/L乙酸鈉)∶V(乙腈)=97∶3。采用梯度洗脫的方法：0～20 min，B溶液由95%下降至65%；20～30 min，B溶液由65%上升至95%；30～43 min，B溶液梯度保持不變；檢測波長254 nm，檢測時(shí)間45 min，柱溫40 ℃。

1.2.4 酶學(xué)性質(zhì)的檢測方法

酶活反應(yīng)體系：500 μL反應(yīng)體系，將適量的AeCSAD純酶和sumo-AeCSAD純酶液與終濃度為1 mmol/L的PLP混勻，用磷酸緩沖溶液(50 mmol/L，pH 6.0)補(bǔ)全體系，40 ℃下孵育10 min，添加終濃度為100 mmol/L的L-天冬氨酸鈉鹽激活反應(yīng)，在40 ℃反應(yīng)30 min后置于100 ℃滅活10 min，檢測酶活力。

酶活力定義：在40 ℃，pH 6.0的條件下，1 min轉(zhuǎn)化L-天冬氨酸鈉鹽生成1 μmol β-丙氨酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位。比酶活力定義：1 mg蛋白所含的酶活力單位數(shù)。

最適反應(yīng)溫度測定：同上述酶活反應(yīng)體系，分別在30、35、40、45、50 ℃條件下測定AeCSAD和sumo-AeCSAD的酶活力。最高酶活力定義為100%，AeCSAD、sumo-AeCSAD最適溫度以相對(duì)酶活力作圖呈現(xiàn)。

最適反應(yīng)pH測定：酶活反應(yīng)體系中的其他條件不變，分別用pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的磷酸緩沖溶液補(bǔ)全體系，pH 6.0～8.0用磷酸鹽緩沖溶液，pH 5.0～6.0用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。最高酶活力定義為100%，AeCSAD、sumo-AeCSAD最適溫度以相對(duì)酶活力作圖呈現(xiàn)。

溫度穩(wěn)定性測定：取適量AeCSAD純酶和sumo-AeCSAD純酶液于1.5 mL離心管中，分別在0、30、40、50、60 ℃金屬浴中處理30 min后置于冰上冷卻10 min。反應(yīng)體系同上。檢測結(jié)果以不同溫度下相對(duì)酶活力作圖呈現(xiàn)。

pH穩(wěn)定性測定：取適量AeCSAD純酶和sumo-AeCSAD純酶液置于1.5 mL離心管中，再與等量體積pH 5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸緩沖溶液混合，于4 ℃環(huán)境下處理12 h。反應(yīng)體系同上,檢測結(jié)果以不同pH下相對(duì)酶活力對(duì)處理時(shí)間作圖呈現(xiàn)。

1.2.5 以富馬酸為底物全細(xì)胞催化生產(chǎn)β-丙氨酸

為了進(jìn)一步提高重組菌的蛋白表達(dá)量，首先對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化。誘導(dǎo)溫度設(shè)定為20、25、30 ℃，IPTG濃度設(shè)定為0.1、0.2、0.4、0.6 mmol/L，之后通過SDS-PAGE確定重組蛋白的表達(dá)情況。

配制100 mmol/L富馬酸氨水溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)成pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。將收集得到的細(xì)胞用100 mmol/L富馬酸氨水溶液稀釋至OD600=10，37 ℃下振蕩反應(yīng)6 h，通過薄板層析確定全細(xì)胞催化的最適pH。在最適pH條件下，用1 mol/L富馬酸氨水溶液重懸誘導(dǎo)結(jié)束后的工程菌至OD600=100，10 mL反應(yīng)體系，添加終濃度為1 mmol/L的PLP，37 ℃振蕩反應(yīng)，每間隔2 h取樣1次，通過液相檢測底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量。

2 結(jié)果與分析

2.1 AeCSAD誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將埃及伊蚊來源半胱亞磺酸脫羧酶(XP_001658435.2)與谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌來源L-天冬氨酸-α-脫羧酶進(jìn)行序列對(duì)比，結(jié)果顯示相似度很低(圖1)。谷氨酸棒桿菌來源L-天冬氨酸-α-脫羧酶(WP_003857183.1)含有136個(gè)氨基酸，枯草芽孢桿菌來源L-天冬氨酸-α-脫羧酶(NP_390122)含有127個(gè)氨基酸，兩者同源性為48.91%。而埃及伊蚊來源半胱亞磺酸脫羧酶含有562個(gè)氨基酸，與原核來源L-天冬氨酸-α-脫羧酶不具有同源性。

圖1 BsADC、CgADC、AeCSAD序列比對(duì)Fig.1 Alignment of BsADC, CgADC, and AeCSAD

將構(gòu)建成功的重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，破碎細(xì)胞后得到的上清液和沉淀經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證(圖2)，電泳圖譜顯示在66.4 kDa附近有2條特異性條帶。AeCSAD的理論分子質(zhì)量是63 kDa，sumo-AeCSAD的理論分子質(zhì)量是75 kDa，與電泳結(jié)果相吻合。sumo-AeCSAD上清液中的可溶性表達(dá)較AeCSAD明顯增多，證明添加sumo標(biāo)簽有效的促進(jìn)了AeCSAD在上清液中的可溶性表達(dá)。sumo-AeCSAD的破碎上清液經(jīng)strep柱純化后，獲得sumo-AeCSAD純酶，如圖2泳道7所示，經(jīng)SUMO蛋白酶切割后可將sumo標(biāo)簽完整的切割下來，切割后大小與AeCSAD大小一致，如圖2泳道8所示。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1-AeCSAD未誘導(dǎo)全細(xì)胞；2-AeCSAD誘導(dǎo)后破碎上清液；3-AeCSAD誘導(dǎo)后破碎沉淀；4-sumo-AeCSAD未誘導(dǎo)全細(xì)胞；5-sumo-AeCSAD誘導(dǎo)后破碎上清液；6-sumo-AeCSAD誘導(dǎo)后破碎沉淀；7-純化后sumo-AeCSAD；8-切割標(biāo)簽后AeCSAD圖2 重組菌pET28a-AeCSAD和pET28a-sumo-AeCSAD表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2 The SDS-PAGE analysis of expression products in pET28a-AeCSAD and pET28a-sumo-AeCSAD注：異源表達(dá)的sumo-AeCSAD和AeCSAD均用紅色框標(biāo)記

2.2 AeCSAD及sumo-AeCSAD的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

半胱亞磺酸脫羧酶作為一種生物催化劑應(yīng)用到β-丙氨酸的生產(chǎn)中，溫度對(duì)酶活力的影響會(huì)直接限制酶在工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用。用AeCSAD及sumo-AeCSAD純酶測定其最適溫度及溫度穩(wěn)定性。測定結(jié)果如圖3所示，隨著反應(yīng)溫度的升高，2種酶的酶活力都呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，AeCSAD和sumo-AeCSAD最適反應(yīng)溫度都是40 ℃(圖3-a)。AeCSAD及sumo-AeCSAD在不同溫度下孵育30 min后檢測殘余酶活力，活性隨著溫度的升高而降低，當(dāng)溫度高于40 ℃時(shí)，AeCSAD酶活力損失嚴(yán)重，在50 ℃時(shí)AeCSAD酶活力僅剩20%；sumo-AeCSAD的熱穩(wěn)定性明顯優(yōu)于AeCSAD，40 ℃時(shí)酶活力依舊能維持在較高狀態(tài)，50 ℃時(shí)酶活力仍保留39.77%(圖3-b)，赤擬谷盜來源半胱亞磺酸脫羧酶在50 ℃處理30 min，酶活力僅剩余19.61%[18]。

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性圖3 溫度對(duì)AeCSAD、sumo-AeCSAD的酶活力及穩(wěn)定性影響Fig.3 The influence of temperature on the activity and stability of AeCSAD and sumo-AeCSAD

2.3 AeCSAD及sumo-AeCSAD的最適pH及pH穩(wěn)定性

AeCSAD和sumo-AeCSAD的最適pH及pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。酶活力隨著pH的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，兩者的最適pH值均為6.0(圖4-a)。sumo-AeCSAD在pH 5.5～7.5酶活力保持在80%以上；AeCSAD在堿性條件下穩(wěn)定性相對(duì)較好，酸性條件下酶活力迅速下降(圖4-b)。

a-最適pH；b-pH穩(wěn)定性圖4 pH對(duì)AeCSAD、sumo-AeCSAD的酶活力及穩(wěn)定性影響Fig.4 The effect of pH on the activity and stability of AeCSAD and sumo-AeCSAD

在最適條件下測得AeCSAD比酶活力為(5.00±0.074) U/mg，sumo-AeCSAD比酶活力為(5.40±0.129) U/mg。赤擬谷盜來源半胱亞磺酸脫羧酶比谷氨酸棒桿菌來源L-天冬氨酸-α-脫羧酶的酶活力高出2倍[17]。

2.4 全細(xì)胞催化

利用基因工程菌進(jìn)行全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸，首先對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期提高重組酶的表達(dá)量。誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑對(duì)sumo-AeCSAD表達(dá)的影響如圖5、圖6所示。誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)，重組蛋白在上清液中的可溶性表達(dá)最多(圖5-a)；改變誘導(dǎo)劑濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量影響不大，當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度為0.2 mmol/L時(shí)，目的蛋白表達(dá)量相對(duì)較多(圖5-b)。確定最佳表達(dá)條件為誘導(dǎo)溫度20 ℃，誘導(dǎo)劑濃度0.2 mmol/L。

因?yàn)樘於彼崃呀饷富钚赃h(yuǎn)高于半胱亞磺酸脫羧酶[19]，故利用大腸桿菌自身的天冬氨酸裂解酶與半胱亞磺酸脫羧酶相偶聯(lián)，催化富馬酸合成β-丙氨酸。大腸桿菌天冬氨酸裂解酶的最適pH值為8.0，半胱亞磺酸脫羧酶的最適pH值為6.0，首先對(duì)全細(xì)胞催化的最適pH進(jìn)行測定。分別在pH 5.5～8.5的條件下催化富馬酸合成β-丙氨酸，薄板層析檢測結(jié)果顯示pH值為7.5時(shí)，β-丙氨酸產(chǎn)量最高(圖6)，符合2個(gè)酶最適pH的折中原則[20]。

a-誘導(dǎo)溫度優(yōu)化;b-誘導(dǎo)劑濃度優(yōu)化圖5 表達(dá)條件優(yōu)化Fig.5 Optimization of expression conditions注：紅框表示目的蛋白表達(dá)量相對(duì)最多

圖6 富馬酸到β-丙氨酸全細(xì)胞催化最適pHFig.6 The optimal pH for whole-cell catalytic process from fumaric acid to β-alanine

在pH 7.5的條件下，以1 mol/L富馬酸作為底物，全細(xì)胞催化合成β-丙氨酸。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，富馬酸被轉(zhuǎn)化為中間天冬氨酸和最終產(chǎn)物β-丙氨酸。β-丙氨酸標(biāo)樣和樣品的HPLC檢測峰圖如圖7-b、圖7-c所示，催化反應(yīng)進(jìn)行24 h后，底物富馬酸無剩余，中間產(chǎn)物L(fēng)-天冬氨酸無積累，最終生成β-丙氨酸930.31 mmol/L(圖7-a)，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.03%，而赤擬谷盜來源半胱亞磺酸脫羧酶1次添加底物最終摩爾轉(zhuǎn)化率僅為79.42%[18]。圖7-c中22 min所出的峰為氨水。

a-全細(xì)胞催化歷程圖;b-β-丙氨酸標(biāo)樣HPLC檢測峰圖;c-樣品HPLC檢測峰圖圖7 富馬酸到β-丙氨酸的全細(xì)胞催化工藝Fig.7 Whole-cell catalytic process from fumaric acid to β-alanine

3 結(jié)論

本研究通過添加sumo標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)了埃及伊蚊來源半胱亞磺酸脫羧酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)。酶學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果顯示AeCSAD和sumo-AeCSAD在40 ℃、pH 6.0時(shí)催化活性最高。添加標(biāo)簽后酶的穩(wěn)定性明顯提高，50 ℃處理30 min，sumo-AeCSAD剩余酶活力為39.77%，在pH 5.0～8.0酶活力都維持在80%以上。利用大腸桿菌自身的天冬氨酸裂解酶與半胱亞磺酸脫羧酶相偶聯(lián)，催化富馬酸合成β-丙氨酸，pH 7.5條件下，24 h后底物富馬酸全部消耗，中間產(chǎn)物天冬氨酸沒有積累，最終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.03%。