利用擴(kuò)增子測序技術(shù)分析不同紅茶菌中微生物多樣性

黎琪，王晴，檀馨悅，李曉敏，張曉琳*

1(中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京，102209)2(營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，102209)3(老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京，102209)

紅茶菌是一種由多種細(xì)菌和酵母菌組成的共生菌群發(fā)酵糖茶水而成的傳統(tǒng)發(fā)酵飲品[1]。紅茶菌酸甜可口，被報(bào)道具有保護(hù)肝臟、抗氧化、抗菌和抗癌等諸多健康功效[2-3]，最新研究發(fā)現(xiàn)紅茶菌還能通過激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th2細(xì)胞改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎[4]。據(jù)報(bào)道，紅茶菌最早出現(xiàn)在我國秦朝，后逐漸傳入日本、德國等地，近年來，全球多家飲料巨頭已涉足紅茶菌飲品市場，發(fā)展前景十分廣闊。紅茶菌的生產(chǎn)起初僅以紅茶或綠茶為底料，后來陸續(xù)有烏龍茶、黑茶和茉莉花茶等茶葉作為底料的研究，其所用糖類一般以蔗糖為主，眾多學(xué)者在紅茶菌發(fā)酵生產(chǎn)中加入蔬果汁或中草藥以豐富紅茶菌飲品的風(fēng)味和健康功效[5]。目前我國市場上出現(xiàn)的紅茶菌飲品，風(fēng)味與傳統(tǒng)紅茶菌相比仍有一定差距，這主要因?yàn)閭鹘y(tǒng)紅茶菌復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu)[6]，促進(jìn)了其豐富獨(dú)特風(fēng)味的形成[7-8]，而工業(yè)化生產(chǎn)為了保證產(chǎn)品品質(zhì)穩(wěn)定，通常選擇一種或者幾種常見食品用于菌種復(fù)配發(fā)酵，難以產(chǎn)生傳統(tǒng)紅茶菌的特殊風(fēng)味。因此，研究紅茶菌中微生物多樣性，探究菌群與風(fēng)味之間的關(guān)聯(lián)性，對于紅茶菌產(chǎn)品的開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)至關(guān)重要。

目前對于紅茶菌中微生物的研究主要分為培養(yǎng)依賴分析法和非培養(yǎng)依賴分析法[9]。擴(kuò)增子測序技術(shù)作為非培養(yǎng)依賴分析法的一種，利用保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對高變區(qū)進(jìn)行測序[10-11]，通過相關(guān)分析獲得樣品中微生物的物種組成、物種豐度、系統(tǒng)進(jìn)化和群落比較等諸多信息[12]。本研究采用擴(kuò)增子測序技術(shù)對11個(gè)紅茶菌樣品中微生物多樣性進(jìn)行分析，結(jié)合感官評價(jià)結(jié)果，以期挖掘紅茶菌中風(fēng)味相關(guān)的優(yōu)勢菌群，為開發(fā)適用于標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化生產(chǎn)紅茶菌飲品的發(fā)酵菌劑提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶菌樣品包括10個(gè)國內(nèi)樣品和1個(gè)國外樣品，具體信息見表1。

表1 紅茶菌樣品基本信息Table 1 Basic information of kombucha samples

茶葉和白砂糖均購自電商；DNA抽提試劑盒，美國MP Biomedicals公司；2%瓊脂糖凝膠，西班牙Biowest公司；FastPfu DNA Polymerase，北京全式金生物技術(shù)有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，美國AXYGEN公司；TruSeqTMDNA樣本制備試劑盒，美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME3002E型分析天平、S210-K型pH計(jì)，美國梅特勒-托利多公司；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；NanoDrop2000型分光光度計(jì)，美國Thermo公司；ABI GeneAmp?9700型PCR儀，美國ABI公司；MISEQ測序儀，美國Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅茶菌飲品的制備和感官評價(jià)方法

將11個(gè)紅茶菌樣品分別以10%接種量接種至糖茶水(0.5%茶葉、8%白砂糖)中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至發(fā)酵液pH<3.2后，發(fā)酵液經(jīng)過濾和巴氏滅菌處理制得紅茶菌飲品。飲品經(jīng)冷藏后分裝至一次性透明塑料小品評杯中，隱去樣品代表性信息，由15位具有食品專業(yè)背景的人員(年齡23～46歲、男∶女=8∶7),在食品實(shí)驗(yàn)室中按表2對紅茶菌飲品進(jìn)行感官評分，不同樣品之間使用純凈水漱口以減少誤差。

表2 紅茶菌飲品感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria for kombucha beverages

1.3.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

按照DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行總DNA提取，檢測DNA濃度和純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。細(xì)菌用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC-TAAT-3′)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，真菌用SSU0817F(5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′)和SSU1196R(5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；引物擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min，35個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸10 min；擴(kuò)增體系為20 μL，其中4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs， 0.8 μL 引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫，利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

首先對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾處理得到有效數(shù)據(jù)，然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類，選取OTU的代表性序列，與核糖體RNA數(shù)據(jù)庫(Greengenes Database 13.8版本)進(jìn)行比對獲得物種注釋信息?；跀?shù)據(jù)均一化后的OTU物種豐度譜，利用qiime2 diversity軟件評估樣品的Alpha多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅茶菌飲品感官評價(jià)結(jié)果

統(tǒng)計(jì)色澤、氣味、滋味和整體喜好度評分平均分，除氣味評分最高樣品為GD9外，其他項(xiàng)目評分最高均為樣品AH7，評分最低均為樣品SY6(表3)。按對應(yīng)權(quán)重計(jì)算最終得分，并根據(jù)得分將樣品分為好(100～85分)、中(84～70分)和差(69分及以下)3組，用于后文基于感官評價(jià)的微生物聚類分析。

表3 紅茶菌飲品感官評價(jià)結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results of kombucha beverages

2.2 紅茶菌中DNA提取與定量

提取新鮮紅茶菌菌膜及菌液混合物的DNA，測定其質(zhì)量與純度，樣品中DNA的OD260nm/OD280nm值為1.72～2.41，OD260nm/OD230nm值為0.01～0.05，其質(zhì)量濃度為0.10～7.50 ng/μL(表4)。OD260nm/OD280nm值>1.8表示DNA純度高，OD260nm/OD230nm值<2.0表明樣品可能受到鹽類和有機(jī)物等污染。經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物目的條帶均大小正確，濃度合適，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表4 紅茶菌樣品DNA質(zhì)量濃度分析Table 4 DNA concentration analysis of kombucha samples

2.3 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)用于研究環(huán)境樣品中微生物的多樣性，包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和覆蓋度。Shannon指數(shù)值越高，Simpson指數(shù)值越低，表示微生物多樣性越豐富。Chao1指數(shù)主要用于衡量樣本中的微生物種類豐富度，其數(shù)值越大，表示微生物種類越多。覆蓋度是指各樣本中低豐度OTU的覆蓋情況，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測出的概率越高[13-14]。

如表5所示,就細(xì)菌而言，樣品GD9和SD10的Shannon指數(shù)值較高、Simpson指數(shù)值較低，表明這2個(gè)樣品細(xì)菌OTU多樣性水平較高。Chao1指數(shù)值較高的樣品為BJ4、SY6、AH8、GD9和SD10，表明這些樣品細(xì)菌OTU種類較多，樣品AJ2的Chao1指數(shù)值最低，表明其細(xì)菌OTU種類較少。就真菌而言，樣品BJ3、BJ4 和AH7的Shannon指數(shù)值較高、Simpson指數(shù)值較低，表明這3個(gè)樣品真菌OTU多樣性水平較高。Chao1指數(shù)值較高的樣品為XJ5、BJ4、SY6、AH7和SX11，表明這些樣品真菌OTU種類較多，樣品SD1的Chao1指數(shù)值最低，表明其真菌OTU種類較少。表5中覆蓋度數(shù)值均為1.00，說明測序已經(jīng)較大程度覆蓋低豐度OTU，表明本次測序結(jié)果可以代表樣本中細(xì)菌和真菌的真實(shí)情況。

表5 樣品細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)Table 5 Microbial α-diversity index of kombucha samples

2.4 紅茶菌中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 物種組成

在門水平上，樣品中共出現(xiàn)9個(gè)門，包括8個(gè)已知門：變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、梭桿菌門(Fusobacteria)、綠菌門(Chlorobi)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria)，1個(gè)未鑒定。所有樣品中變形菌門均占優(yōu)勢，相對豐度占98.92%以上，其中樣品AJ2和SX11達(dá)100%。厚壁菌門存在于9個(gè)樣品中，擬桿菌門存在于5個(gè)樣品中，兩者相對豐度占比最高的均為樣品BJ4，分別為0.25%和0.76%。表明樣品BJ4較其他樣品在門水平上的細(xì)菌種類更為豐富。

在屬水平上，樣品共出現(xiàn)74個(gè)屬，其中相對豐度排名前20的屬如圖1所示。所有樣品的優(yōu)勢菌屬一致，均為葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)，在樣品SY6中相對豐度最高為99.56%。雖然各樣品優(yōu)勢菌屬一致，但相對豐度第2的菌屬表現(xiàn)不同，除樣品SY6外，僅樣品SD10相對豐度第2的菌屬(10.5%)為葡糖桿菌屬(Gluconobacter)，其余樣品均為假單胞菌屬(Pseudomonas)，并且占比差異較大，在樣品GD9中占比最高(13.91%)，在樣品AJ2中占比最低(2.62%)。在樣品SD10中相對豐度第3(1.24%)的菌屬為假單胞菌屬，在樣品AH7、AH8和SX11中相對豐度第3的菌屬均為葡糖桿菌屬，在樣品SD1、XJ5和GD9中相對豐度第3的菌屬都是羅爾斯通菌屬(Ralstonia)。另外，紅球菌屬(Rhodococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、Sulfurimonas、Odoribacter和Herminiimonas在部分樣品中少量出現(xiàn)。

a-門水平；b-屬水平圖1 不同紅茶菌樣品中細(xì)菌在門水平和屬水平上的相對豐度Fig.1 Relative frequency of bacteria in different kombucha samples at phylum and genus levels

2.4.2 基于感官評價(jià)的物種分析

對3組不同感官評價(jià)樣品中細(xì)菌組成進(jìn)行分析(圖2)，細(xì)菌種類139種，共有物種12個(gè)，包括葡糖醋桿菌屬的3個(gè)種(總序列數(shù)和為377 693)、假單胞菌屬的3個(gè)種(總序列數(shù)和為22 740)、葡糖桿菌屬的1個(gè)種(序列數(shù)為6 338)、羅爾斯通菌屬的1個(gè)種(序列數(shù)為618)、unspecifiedSulfurimonas(序列數(shù)223)、unspecifiedHerminiimonas(序列數(shù)為140)、unspecifiedOdoribacter(序列數(shù)為19)和普雷沃菌屬(Prevotella)的1個(gè)種(序列數(shù)為16)。感官評價(jià)為好的組特有細(xì)菌種類有41個(gè)，其中葡糖醋桿菌屬相對豐度最高(89.75%)，假單胞菌屬次之(5.85%)；評價(jià)為中的組特有細(xì)菌種類有9個(gè)，其中葡糖桿菌屬相對豐度最高(71.76%)；評價(jià)為差的組特有細(xì)菌種類有62個(gè)，其中普雷沃菌屬相對豐度最高(22.78%)。

圖2 不同感官評價(jià)分組中共有和特有細(xì)菌物種韋恩圖Fig.2 Venn diagram of common and endemic bacterial species based on sensory evaluation

3組不同感官評價(jià)分組(圖3)中unspecifiedGluconacetobacter豐度均最高，且差別不大，其次為居間葡糖醋桿菌(Gluconacetobacterintermedius)、假單胞菌屬的2個(gè)種、unspecifiedRalstonia和unspecifiedGluconobacter，表明unspecifiedGluconacetobacter是構(gòu)成各分組紅茶菌細(xì)菌的絕對優(yōu)勢菌種。MARSH等[15]研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)紅茶菌樣品中葡糖醋桿菌屬占比達(dá)85%以上，與本文研究結(jié)果一致。葡糖醋桿菌屬是產(chǎn)生有機(jī)酸的重要菌種，能促進(jìn)醇類和酯類等芳香物質(zhì)的形成[16-17]。結(jié)合紅茶菌樣品中細(xì)菌特有物種分析，表明葡糖醋桿菌屬的某些種可促進(jìn)紅茶菌獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)的形成。王潔琛等[18]從紅茶菌樣品中分離的優(yōu)勢細(xì)菌為居間駒形桿菌(Komagataeibacterintermedius)，MUZAFFER等[19]利用宏基因組結(jié)合擴(kuò)增子測序方法測得紅茶菌發(fā)酵過程中不同時(shí)間點(diǎn)的優(yōu)勢細(xì)菌也為駒形桿菌屬。根據(jù)圖3結(jié)果表明居間葡糖醋桿菌(該菌中文名因分類原因更為居間駒形桿菌，本文便于統(tǒng)計(jì)分析暫用此名稱)相對含量與紅茶菌風(fēng)味不呈相關(guān)性，但是紅茶菌中較為重要的菌種。此外，假單胞菌屬在一定范圍內(nèi)相對含量越高越好，unspecifiedRalstonia相當(dāng)含量對紅茶菌風(fēng)味影響不大，unspecifiedGluconobacter相對含量適度增高可能利于好的風(fēng)味物質(zhì)形成，硫桿菌、紅球菌、瘤胃球菌、擬桿菌、普氏菌和Enterobacteriaceae的出現(xiàn)會(huì)使紅茶菌感官品質(zhì)變差。

圖3 不同感官評價(jià)分組細(xì)菌種類熱圖Fig.3 Heatmaps of bacteria based on sensory evaluation at species levels

2.5 紅茶菌中真菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 物種組成

在門水平上，樣品中共出現(xiàn)4個(gè)門，包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、Mucoromycota和線蟲門(Nematoda)(圖4)。所有樣品中優(yōu)勢菌門為子囊菌門，均占99.45%以上，其中樣品AH8、AJ2、GD9、SD1和SD10達(dá)100%，較優(yōu)勢的菌門為擔(dān)子菌門，存在于5個(gè)樣品中，其中樣品SY6相對豐度最高為0.50%。表明樣品SY6較其他樣品在門水平上的真菌物種更為豐富。僅存在樣品SX11中的線蟲門相對豐度極低，不足0.01%。單齒類線蟲(Nematoda Mononchida)為捕食性線蟲，常用于植物生物防治[20]，因紅茶菌樣品中含有茶葉成分，推測可能由茶葉原料帶入。

在屬水平上，樣品共出現(xiàn)38個(gè)屬，其中相對豐度排名前20的屬如圖4所示。各樣品優(yōu)勢菌屬均不一致，其中樣品AH7、AH8、AJ2、BJ3和XJ5的優(yōu)勢菌屬為酒香酵母屬(Brettanomyces)，相對豐度為40%～75%；樣品SD1、SD10、SX11和SY6的優(yōu)勢菌屬為接合酵母屬(Zygosaccharomyces)，相對豐度均達(dá)95%以上；樣品BJ4和GD9的優(yōu)勢菌屬為假絲酵母屬(Candidas)，相對豐度分別為40.54%和97.40%。各樣品相對豐度第2的菌屬也表現(xiàn)不同，包括上述3種菌屬以及酵母目(Saccharomycetales)，其中酵母目作為相對豐度第2出現(xiàn)的樣品數(shù)量最多。所有樣品中，除樣品BJ4(96.88%)外，其他樣品中存在的接合酵母屬、假絲酵母屬、酒香酵母屬和酵母目相對豐度之和均在99%以上，其中樣品SD1僅含有接合酵母屬，樣品SY6含菌屬種類最多。表明接合酵母屬、假絲酵母屬、酒香酵母屬和酵母目共為紅茶菌樣品的優(yōu)勢酵母。另外，畢赤酵母屬(Pichia)、粗糙孔菌屬(Trechispora)、馬拉色菌屬(Malassezia)、鐮刀菌屬(Fusarium)、鎖霉屬(Itersonilia)和枝孢菌屬(Cladosporium)等也在部分樣品中少量出現(xiàn)。

2.5.2 基于感官評價(jià)的物種分析

對3組不同感官評價(jià)樣品中真菌組成進(jìn)行分析(圖5)，真菌種類38種，共有物種6個(gè)，包括接合酵母屬的1個(gè)種(序列數(shù)為149 574)、酒香酵母屬的2個(gè)種(總序列數(shù)和為132 427)、假絲酵母屬的1個(gè)種(序列數(shù)為74 445)、酵母目的1個(gè)種(序列數(shù)為40 128)和肉座菌目(Hypocreales)的1個(gè)種(序列數(shù)為584)。感官評價(jià)為好的組特有真菌種類有6個(gè)，其中假絲酵母屬相對豐度最高(46.20%)，接合酵母屬次之(19.88%)；評價(jià)為中的組特有真菌種類有7個(gè)，其中接合酵母屬相對豐度最高(68.48%)，酒香酵母屬次之(29.17%)；評價(jià)為差的組特有真菌種類有12個(gè)，其中畢赤酵母屬相對豐度最高(48.24%)，酒香酵母屬次之(35.13%)。

圖5 不同感官評價(jià)分組中共有和特有真菌物種韋恩圖Fig.5 Venn diagram of common and endemic fungus species based on sensory evaluation

3組不同感官評價(jià)分組(圖6)中unspecifiedZygosaccharomyces豐度最高，其次為unspecifiedBrettanomyces、unspecifiedCandida、酵母目的1個(gè)種、肉座菌目的1個(gè)種。表明接合酵母屬和酒香酵母屬是構(gòu)成紅茶菌中酵母的優(yōu)勢菌屬，其次是假絲酵母屬和酵母目。MARSH等[15]研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)紅茶菌樣品中接合酵母屬占比達(dá)95%以上，王潔琛等[18]也從紅茶菌樣品中分離出二孢接合酵母(Zygosaccharomycesbisporus)，ARIKAN等[19]同樣發(fā)現(xiàn)紅茶菌中優(yōu)勢真菌為接合酵母屬，與本文研究樣品SD1、SD10、SX11和SY6優(yōu)勢真菌表現(xiàn)一致。TRAN等[21]從紅茶菌樣品中分離出酒香酵母和有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)，蘇家躍等[22]從紅茶菌樣品中分離出異酒香酵母(Brettanomycesanomalus)，蔣立文[23]與林娟等[24]皆在紅茶菌樣品中分離出假絲酵母，表明不同來源紅茶菌樣品優(yōu)勢酵母種類差異較大。根據(jù)圖6可以初步推測假絲酵母屬與接合酵母屬適當(dāng)比例混用能促進(jìn)紅茶菌好的風(fēng)味物質(zhì)形成，高水平的酒香酵母屬和畢赤酵母都會(huì)使紅茶菌風(fēng)味變差。檀馨悅等[16]總結(jié)發(fā)現(xiàn)復(fù)配多種非釀酒酵母可提高紅茶菌風(fēng)味的豐富程度，WANG等[25]混菌發(fā)酵制備的紅茶菌與傳統(tǒng)菌膜的風(fēng)味相近，因此，利用適當(dāng)比例混合優(yōu)勢酵母發(fā)酵有助于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)味道更接近傳統(tǒng)風(fēng)味的紅茶菌飲品。此外，肉座菌目在一定范圍內(nèi)相對含量越低越好，畢赤酵母、球囊菌、粗糙孔菌、牛肝菌、曲霉鐮刀菌和枝孢菌的出現(xiàn)會(huì)使紅茶菌感官變差。

a-門水平；b-屬水平圖4 不同紅茶菌樣品中真菌在門水平和屬水平上的相對豐度Fig.4 Relative frequency of fungus in different kombucha samples at phylum and genus levels

圖6 不同感官評價(jià)分組真菌物種熱圖Fig.6 Heatmaps of fungus based on sensory evaluation at species levels

3 結(jié)論

通過擴(kuò)增子測序技術(shù)對11個(gè)紅茶菌樣品中的微生物多樣性進(jìn)行分析，確定不同紅茶菌樣品中優(yōu)勢細(xì)菌為葡糖醋桿菌屬(相對豐度為85.40%～99.56%)，其次為假單胞菌屬(相對豐度為<14%)；優(yōu)勢真菌種類差異較大，樣品SD1、SD10、SX11和SY6中優(yōu)勢菌屬為接合酵母屬(相對豐度為95.43%～99.99%)，樣品BJ4和GD9中優(yōu)勢菌屬為假絲酵母屬(相對豐度為40.54%和97.40%)，樣品AH7、AH8、AJ2、BJ3和XJ5中優(yōu)勢菌屬為酒香酵母屬(相對豐度為54.81%～74.09%)。

基于感官評價(jià)對微生物種類進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)，非優(yōu)勢細(xì)菌和優(yōu)勢真菌會(huì)不同程度地影響紅茶菌的風(fēng)味。細(xì)菌中假單胞菌屬與紅茶菌的風(fēng)味呈相關(guān)性，假單胞菌屬在一定范圍內(nèi)相對含量越高風(fēng)味越佳。真菌中接合酵母屬與假絲酵母屬水平相對偏高，酒香酵母屬與酵母目水平相對偏低有利于紅茶菌良好風(fēng)味的形成。硫桿菌、紅球菌、瘤胃球菌、擬桿菌、普氏菌和Enterobacteriaceae等細(xì)菌，畢赤酵母、球囊菌、粗糙孔菌、牛肝菌、曲霉鐮刀菌和枝孢菌等真菌的少量出現(xiàn)都會(huì)使紅茶菌風(fēng)味變差。

綜上所述，利用葡糖醋桿菌和接合酵母、酒香酵母等多種非釀酒酵母混菌發(fā)酵，并嚴(yán)格控制過程微生物污染，可能有助于穩(wěn)定生產(chǎn)接近于傳統(tǒng)紅茶菌風(fēng)味的飲品，為工業(yè)化生產(chǎn)紅茶菌飲品提供理論依據(jù)。