超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式測定奶粉中56種違禁藥物殘留

周春紅，許曉輝

1(甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，甘肅 蘭州，730000)2(蘭州市食品藥品檢驗檢測研究院，甘肅 蘭州，730000)

喹諾酮類、磺胺類、氯霉素類、硝基咪唑類為常見的抗生素藥物，具有消毒殺菌的功效，廣泛用于禽畜養(yǎng)殖過程中細菌性感染、病蟲害等多種疾病的預防和治療[1-3]。地西泮等精神類藥物可降低機體新陳代謝，通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)減弱機體生理機能從而使機體消除躁動、恢復安靜的情緒[4-6]。藥物的不正確使用及頻繁濫用，導致其在動物體內(nèi)具有相對較長的半衰期，過量殘留的獸藥可通過食物鏈進入人體，輕則引起胃腸道刺激不適、頭痛、頭暈、嗜睡疲乏、人體動作失調(diào)、精神混亂等癥狀，重則容易損害人體肝、腎、骨髓造血機能等，引起心律失常、溶血性貧血、機體代謝功能性減退甚至死亡等問題[7-10]。此外，該藥物的殘留，會使食用者產(chǎn)生耐藥性，降低此類藥物的臨床治療效果，對人體具有潛在危害，不容忽視。隨著人們對禽畜產(chǎn)品的需求量逐年遞增，禽畜養(yǎng)殖企業(yè)不斷興起和擴大。部分養(yǎng)殖者和商販對食品安全認識不充分，為獲取更高經(jīng)濟利益，并未嚴格遵守休藥期規(guī)定，甚至短時間內(nèi)使用高劑量的違禁藥物，造成肉及肉制品的藥物殘留，是日常食品風險監(jiān)測的重點。

目前，違禁藥物殘留的檢測技術(shù)主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[5,8,11]、液相色譜法[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-17]等。液相色譜法定量準確，但是存在檢測藥物種類單一、耗時較長、靈敏度低等問題。氣相色譜-質(zhì)譜法廣泛用于農(nóng)藥殘留的檢測，但是對于獸藥殘留、精神類藥物殘留等檢測范圍較窄。鑒于超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法有高準確性、高效性、測量范圍廣、穩(wěn)定性好等特點，以及多反應(yīng)監(jiān)測(multiple-reaction monitoring，MRM)模式檢測的高靈敏度、高選擇性等優(yōu)點，超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜成為高通量篩查藥物多殘留的首選方法。

本文選擇了56種較為常見濫用的違禁藥物(包括喹諾酮類、磺胺類、糖皮質(zhì)激素類、抗病毒類、精神類等)作為研究對象，以成人奶粉作為研究基質(zhì)，運用QuEChERS法從提取、凈化等前處理條件結(jié)合超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀所具備的檢測功能，優(yōu)化出可快速測定成人奶粉中違禁藥物多殘留的檢測方法，為市場監(jiān)管成人奶粉產(chǎn)品質(zhì)量的風險評估提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

QTRAP 4500超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國SCIEX公司；VXR渦旋振蕩器，德國IKA公司；5810R高速低溫離心機，德國Eppendorf公司；N-EVAP112氮吹儀，美國Organomation公司；KQ-600DE超聲波清洗器，東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司；十萬分之一天平(精密度為0.1 mg)，德國Sartorius公司；Milli-Q Gradient純水儀，美國Millipore公司。

1.2 材料與試劑

甲醇、乙腈(均為色譜純)，美國Merck公司；甲酸(色譜純)，天津科密歐公司；標準品：56種待測藥物標準品(表1)純度均大于95%，德國Dr.Ehrenstofer公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件

Waters Acquity UPLCBEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速：0.2 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸,體積分數(shù)，下同)，B為乙腈(含0.1%甲酸，體積分數(shù)，下同)；流動相梯度洗脫程序：0～3.0 min，5%～30%B；3.0～4.0 min，30%～40%B；4.0～6.0 min，40%～95%B；6.0～8.0 min，95%B；8.0～8.2 min，95%～5%B；8.2～10 min，5%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源；檢測方式：MRM模式；氣簾氣：35 psi；碰撞氣：medium；離子化電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；噴霧氣：55 psi；輔助加熱器：60 psi。56種目標化合物在MRM模式下的質(zhì)譜條件具體見表1。

1.3.3 溶液制備

1.3.3.1 對照品溶液制備

混合標準儲備液的配制(10 μg/mL)：分別準確稱取各對照品約10 mg，用乙腈稀釋成1 000 μg/mL儲備液。再分別移取上述儲備液各100 μL，用乙腈稀釋至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標準工作溶液，于-20 ℃下密封保存。準確移取一定量的混合標準工作液，配制成系列空白樣品基質(zhì)匹配標準溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3.2 供試品溶液配制

準確稱取1.0 g(精確到0.1 mg)制備好的樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水振蕩混勻溶解，加入約2 g氯化鈉，再加入10 mL乙腈渦旋振蕩后超聲10 min，以4 000 r/min離心5 min，移取上清液，待凈化。

準確移取7.0 mL上清液，移至內(nèi)含丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)40 mg，C1840 mg的凈化管中，渦旋混勻1 min，以4 000 r/min離心5 min，收集上清液，在40 ℃下氮吹至近干，準確加入1.0 mL初始流動相溶解，過0.22 μm濾膜后，待超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-MS/MS，UPLC-MS/MS)分析。

1.3.4 方法學考察

1.3.4.1 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限

根據(jù)1.3.3.2的試驗條件處理空白樣品，得到空白基質(zhì)溶液配制成系列基質(zhì)混合標準溶液，按照1.3.1和1.3.2色譜及質(zhì)譜條件進樣測定，以對照品濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)做標準曲線，得到56種藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)。采用空白樣品加標方式考察56種藥物的檢出限(limit of detection,LOD)(S/N=3)和定量限(limit of quantitation,LOQ)(S/N=10)。

1.3.4.2 精密度和加標回收試驗

以空白樣品為基質(zhì)，添加2、5、10 μg/kg 3個水平的混合標準溶液，每個加標水平做6次平行實驗，采用優(yōu)化后的實驗條件進行測定，計算低、中、高3個添加水平的加標回收率和相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRM模式下藥物殘留檢測方法的建立

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

運用質(zhì)譜進行分析時，影響化合物電離的主要因素為去簇電壓(declustering potential，DP)和碰撞能量(collision energy，CE)，由于不同生產(chǎn)廠家或者同一廠家不同型號的質(zhì)譜儀結(jié)構(gòu)不同，優(yōu)化得到的碎片離子響應(yīng)強度及電壓亦不同。本研究在參考國家標準及文獻報道[16-22]的基礎(chǔ)上，采用一級質(zhì)譜掃描模式確定母離子，采用在MRM模式下找出56種目標化合物的特征子離子碎片，并優(yōu)化DP和CE使各離子碎片的響應(yīng)值達到最優(yōu)，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如表1所示。

表1 56種待測物質(zhì)的保留時間與質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and MS parameters for the 56 analytes in MRM mode

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

由于不同類型藥物的極性差異較大，化合物中的羧基等官能團易與金屬離子形成絡(luò)合物，造成峰拖尾等現(xiàn)象。本研究考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)4種流動相體系的分離效果。結(jié)果顯示，乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)作為流動相時各化合物的峰型較好，56種藥物的MRM總離子流圖如圖1所示，因此選擇乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)為流動相進行后續(xù)試驗。

a-除氯霉素類外的其他藥物；b-氯霉素類圖1 奶粉基質(zhì)中56種藥物的MRM總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of the 56 drugs in the milk powder by MRM

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 樣品加水量的考察

由于奶粉樣品是粉末狀的，直接用有機溶劑對其進行提取時會呈現(xiàn)包塊狀態(tài)，需要先加入一定量的水將其溶解，再加入提取溶劑進行提取。實驗考察了1、3、5、10、15、20 mL加水量對目標藥物回收率的影響(圖2)。結(jié)果表明，當加水量為1 mL時，奶粉與水溶解效果較差，有細小的包塊顆粒；當加水量為3 mL時，回收率小于60%的藥物數(shù)量較多；當加水量為5 mL時，回收率在60%～120%的藥物的數(shù)量最多；當加水量分別為10、15、20 mL時，大部分藥物的回收率逐漸降低。因此，1 g奶粉樣品中加入5 mL水時，各個藥物的提取效果最佳。

圖2 不同加水量對奶粉中56種藥物回收率的影響Fig.2 Effects of different water additions on the recoveries of the 56 drugs

2.2.2 提取溶劑的考察

由于藥物種類多、極性差異不同，選擇適合多數(shù)藥物的提取溶劑尤為重要。本實驗考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷對56種藥物提取效率的影響。結(jié)果顯示，奶粉樣品基質(zhì)主要成分為蛋白質(zhì)、糖類和脂肪，樣品中的脂肪等易溶于甲醇及乙酸乙酯，干擾較重，不利于后續(xù)凈化過程；使用二氯甲烷作為提取溶劑時，樣品的乳化現(xiàn)象較嚴重；乙腈具有較好的沉淀蛋白質(zhì)作用，當乙腈作為提取溶劑時對目標藥物的提取效果較好。因此在后續(xù)實驗中，選擇乙腈作為提取溶劑。

由于部分目標藥物帶有含氮基團，具有一定的弱堿性，在提取溶劑中加入適量甲酸可提高它們的提取效率。本實驗考察了0.1%、0.5%、1%、2%、5%甲酸乙腈對56種化合物的提取效率。結(jié)果顯示，喹諾酮類藥物的回收率隨著甲酸濃度的增加逐漸增加，甲酸體積分數(shù)為1%時提取效率最好；磺胺類藥物的回收率隨著甲酸濃度的增加逐漸降低，不加甲酸時提取效率最好。由于奶粉樣品基質(zhì)中蛋白質(zhì)含量較高，酸化乙腈可更好地沉淀蛋白質(zhì)。綜上，選擇0.1%的甲酸乙腈為進一步研究的提取溶劑。

2.2.3 凈化劑的選擇

奶粉中蛋白質(zhì)和脂肪含量較多，會隨著目標藥物一起被提取出來，凈化處理會降低這些物質(zhì)對目標物的干擾。目前常用的凈化材料有N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)粉、C18粉。PSA結(jié)構(gòu)中含有2個氨基，屬于氨基吸附劑，通過氫鍵能去除樣品中的有機酸、脂肪酸、糖類等；C18是一種非極性、廣譜性的凈化劑，可有效去除樣品提取液中的非極性雜質(zhì)[23]。根據(jù)基質(zhì)中的易干擾組分，本實驗選擇PSA粉、C18粉考察其凈化效果。

2.2.3.1 PSA添加量的優(yōu)化

在C1840 mg的固定條件下，對比20、30、40、50、60 mg PSA對目標藥物的影響。由圖3可知，PSA為50 mg時，回收率在60%～120%的藥物數(shù)量最多；PSA<50 mg時，回收率<60%的藥物數(shù)量較多；PSA為60 mg時，回收率>60%的藥物數(shù)量增加，但是超過120%的藥物數(shù)量較多。因此采用PSA為50 mg進行后續(xù)實驗。

圖3 PSA用量用量對奶粉中56種藥物凈化效果的影響Fig.3 Effects of amount of PSA on the purification efficiencies of the the 56 drugs

2.2.3.2 C18添加量的優(yōu)化

在PSA 50 mg的固定條件下，對比20、30、40、50、60 mg C18對目標藥物的影響。由圖4可知，C18為20 mg時，回收率<60%的藥物數(shù)量較多；C18為30 mg時，回收率在60%～120%的藥物數(shù)量最多；C18>30 mg時，回收率超過120%的藥物數(shù)量較多。因此采用C18為30 mg進行后續(xù)實驗。

圖4 C18用量對奶粉中56種藥物凈化效果的影響Fig.4 Effects of C18 on the purification efficiencies of the 56 drugs

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(matrix effects，ME)是指檢測系統(tǒng)檢測樣品時，處于分析物周圍的所有非分析物質(zhì)對分析物參與反應(yīng)的影響[1]。評估基質(zhì)效應(yīng)可以用空白基質(zhì)匹配標準曲線與溶劑標準曲線的斜率之比來衡量。ME<1時，表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME=1時，表示不存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；ME>1時，表示存在基質(zhì)增強效應(yīng)。結(jié)果表明，43%藥物的ME<0.9%，呈現(xiàn)為基質(zhì)抑制作用；36%藥物的ME為0.9%～1.1%，基質(zhì)效應(yīng)相對不明顯；21%藥物的ME>1.1%，呈現(xiàn)為基質(zhì)增強作用。因此，本實驗采用基質(zhì)匹配標準曲線，可降低對目標藥物基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)及檢出限

56種藥物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)≥0.999 07。采用空白樣品加標方式考察56種藥物的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，檢出限為0.06～5.47 μg/kg，定量限為0.21～16.53 μg/kg，符合篩查要求(表2)。

2.3.2 回收率和精密度

加標回收率及精密度結(jié)果如表2所示。56種藥物的加標回收率范圍為61.3%～129.8%，RSD為0.090%～7.171%。本方法具有較高的準確度和精密度，可用于測定奶粉樣品中的多種農(nóng)藥殘留。

表2 56種待測物質(zhì)的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、加標回收率和RSD(n=6)Table 2 Linear equation, correlation coefficients, LODs, LOQs, spiked recoveries and RSDs of the 56 analytes (n=6)

續(xù)表2

2.4 實際樣品的測定

采用建立的方法測定了11批次市售成人奶粉樣品中56種違禁藥物殘留，單批樣本中檢出藥物種類3～7種，共檢出藥物10種(表3)，分別為恩諾沙星、磺胺多辛、甲氧芐啶、磺胺嘧啶、氟苯尼考、地西泮、異戊巴比妥、三唑侖、咪達唑侖、洛硝噠唑，其中恩諾沙星、磺胺多辛、甲氧芐啶、磺胺嘧啶未超過我國獸藥殘留的最高限量標準(磺胺類總量、恩諾沙星限量均為100 μg/kg，甲氧芐啶為50 μg/kg)。氟苯尼考在動物泌乳期禁用，有2批次樣品有微量檢出；我國鎮(zhèn)靜類藥物僅有地西泮允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出，本次實驗樣品中有10批次樣品有微量殘留；此外，樣品中檢出的異戊巴比妥、三唑侖、咪達唑侖、洛硝噠唑等目前還沒有相關(guān)的檢測及限量標準要求。由此可知，成人奶粉中殘留的違禁藥物較多，可能會給消費者的健康帶來影響。今后需要相關(guān)部門加強監(jiān)管，嚴格控制奶粉生產(chǎn)過程中的原料及添加劑安全，提高產(chǎn)品質(zhì)量，保障消費者的“舌尖安全”。

表3 奶粉樣品中藥物的含量 單位：μg/kg

3 結(jié)論

本文利用液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式，建立了奶粉中56種違禁藥物殘留的高通量檢測方法。56種藥物線性良好，檢出限為0.06～5.47 μg/kg，定量限為0.21～16.53 μg/kg；加標回收率為61.3%～129.8%，RSD為0.090%～7.171%。該方法前處理操作簡便，基質(zhì)匹配標曲法定量準確，通過對實際樣品的測定，證實了該方法具有高效、準確、重復性好的優(yōu)點，可以廣泛應(yīng)用于奶粉樣品中多種違禁藥物快速篩查和定量檢測，為市場監(jiān)管產(chǎn)品質(zhì)量的風險評估提供技術(shù)支持，也可為今后制定相關(guān)檢測標準提供方法依據(jù)。