超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定肉類特征肽

王忠合，李曉婷，胡文梅，王軍

(韓山師范學(xué)院 食品工程與生物科技學(xué)院，廣東 潮州，521041)

近年來(lái)，隨著肉類價(jià)格差異不斷擴(kuò)大，不法商家為了追求利益，借機(jī)用價(jià)格低廉的雞肉、馬肉、鴨肉、鼠肉等肉類品種偽制牛羊肉制品，該行為會(huì)影響飲食安全。這些與價(jià)格、原料和宗教等有關(guān)的食品摻假事件，不僅侵害了消費(fèi)者的權(quán)益和食品公平交易，還嚴(yán)重威脅到了人們的身體健康和宗教信仰[1-3]。未標(biāo)識(shí)的食品成分往往成為潛在的安全隱患，如過(guò)敏原及有毒成分會(huì)影響消費(fèi)者的健康，錯(cuò)誤的標(biāo)簽也可能會(huì)違背特定群體的飲食習(xí)慣。對(duì)食品的種類、優(yōu)劣、真?zhèn)蔚蔫b別，尤其是對(duì)肉類的鑒別，均依賴于可靠的檢測(cè)方法，基于高分辨質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)蛋白或多肽，具有靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)多物種的同時(shí)測(cè)定，并且能夠?qū)ξ锓N的特征蛋白或多肽進(jìn)行明確鑒定，在鑒別肉類摻假等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用范圍。

采用質(zhì)譜法鑒別肉種屬的關(guān)鍵技術(shù)就是特征肽段的篩選，但部分潛在的特征肽段在色譜洗脫中出峰時(shí)間太早或太晚甚至殘留在柱上，在質(zhì)譜檢測(cè)中部分特征肽常常以相對(duì)低的豐度存在，而且食品樣品的基質(zhì)復(fù)雜，高豐度的非目標(biāo)冗余肽段及鹽等干擾物質(zhì)的存在會(huì)嚴(yán)重影響質(zhì)譜信號(hào)，加之基質(zhì)的抑制作用，通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)復(fù)雜的食品樣品中特定的肽段仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。采用高分辨質(zhì)譜法篩選潛在的特征肽，三重四極桿質(zhì)譜法定量測(cè)定同位素標(biāo)記或未標(biāo)記的肽為肉類摻假檢測(cè)提供了強(qiáng)有力的支撐，但是高分辨質(zhì)譜法篩選出的潛在特征肽并不是都適合作為標(biāo)記肽，如采用高分辨質(zhì)譜法篩選到7種潛在的特征肽，在三重四極桿質(zhì)譜中的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)法(multiple reaction monitoring，MRM)采集檢測(cè)中只有4種特征肽可檢測(cè)到[4]，采用MRM法檢測(cè)時(shí)需要保證特征肽可檢測(cè)出,信號(hào)豐度較好且專屬性強(qiáng)。

高分辨率質(zhì)譜(highresolution mass spectrometry，HRMS)已在多個(gè)研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，在目標(biāo)物篩查以及雜質(zhì)鑒定中，HRMS的使用對(duì)定性篩查和結(jié)構(gòu)確認(rèn)產(chǎn)生了革命性影響。雖然三重四極桿質(zhì)譜儀仍是定量分析的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但是隨著HRMS技術(shù)的發(fā)展，其選擇性、動(dòng)態(tài)范圍、線性、靈敏度等有了很大的提升，從而提高了HRMS在定量分析中的應(yīng)用。在復(fù)雜基質(zhì)干擾物存在的情況下，三重四極桿質(zhì)譜儀法將面臨極大挑戰(zhàn)，而有著與之顯著不同特性的HRMS數(shù)據(jù)采集則具有出色的選擇性和靈敏度，從而成功實(shí)現(xiàn)定量分析。飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)功能強(qiáng)大的數(shù)據(jù)采集模式、靈活性和出色的采集速度為科學(xué)家們的研究提供極大幫助，特別是具有目標(biāo)增益功能的飛行時(shí)間質(zhì)譜的準(zhǔn)多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(time-of-flight mass spectrometry-pseudo-multiple reaction monitoring，TOF-MRM)。在這種新的數(shù)據(jù)采集模式下，四極桿選擇母離子，并選擇性地在碰撞室中進(jìn)行碎裂，TOF可選擇性的增加目標(biāo)碎片的占空比，提高響應(yīng)和選擇性。TOF-MRM模式可用于完整離子(母離子 > 母離子，未使用碰撞能)或碎片離子(母離子 > 碎片離子，使用碰撞能)的采集，HRMS平臺(tái)定量分析的選擇性和靈敏度可大幅提升，從而提高HRMS定量分析性能[5-8]。TOF-MRM的定量分析功能讓科學(xué)家們可以使用類似MRM的工作流程進(jìn)行定量分析，拓展了HRMS平臺(tái)在定量分析中的應(yīng)用，不僅可以進(jìn)行常規(guī)的定性分析，更可直接應(yīng)用于低檢出限(limit of detection，LOD)的定量分析。

本實(shí)驗(yàn)選取4種肉類中的8條特征肽為目標(biāo)物，研究超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(ultra-high pressure liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF MS)檢測(cè)參數(shù)、色譜分離條件、預(yù)處理等參數(shù)對(duì)特征肽檢測(cè)的影響，以期建立高效率、高靈敏的肉類制品中特征肽的檢測(cè)方法，為建立肉類摻假的檢測(cè)方法提供數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胰蛋白酶(牛胰腺來(lái)源，10 000活力單位/mg蛋白)、正己烷(色譜級(jí))等，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；尿素、碳酸氫銨、硫脲、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、碘代乙酰胺、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250等試劑(純度≥99%)、固相萃取空柱(3 mL)，生工生物工程(上海)有限公司；質(zhì)譜級(jí)乙腈、甲酸和甲醇，美國(guó)Fisher公司；氨水(質(zhì)譜級(jí))，美國(guó)Waters公司；合成肽，上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；超純水(≥18 MΩ·cm)，實(shí)驗(yàn)室自制；牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉，當(dāng)?shù)爻?；肉丸制品，?dāng)?shù)厥袌?chǎng)；亮氨酸腦啡肽(質(zhì)譜級(jí))、CAX陽(yáng)離子交換小柱(3 mL/200mg)、親水/親油平衡(hydrophile-lipophile balance，HLB)固相萃取柱(3 mL/200mg)，美國(guó)沃特世有限公司；N-丙基乙二胺鍵合固相萃取填料、ENVI-18固相萃取填料，美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters I-Class Plus超高效液相色譜儀(由二元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、脫氣機(jī)等組成)、Xevo G2-XS QTOF高分辨質(zhì)譜儀[配電噴霧電離源(electrospray ionization，ESI)]，美國(guó)沃特世有限公司；JY3002電子天平，美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ZX4漩渦振蕩器，意大利VELP公司；JSP-200型高速多功能粉碎機(jī)，浙江省永康市金穗機(jī)械制造廠；Milli Q超純水機(jī)，美國(guó)密理博有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白提取

先將原料肉攪碎，再稱取0.5 g肉樣于10 mL離心管中，加入4 mL提取緩沖液(0.3 mol/L KCl、0.3 mol/L KH2PO4、pH 6.5，或6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、50 mmol/L Tris-HCl)，用旋渦混合器混勻5 min，超聲處理30 min，在室溫下于10 730×g離心40 min，收集上清液，轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中并渦旋1 min。隨后，將提取物在室溫下1 315×g離心3 min，以消除先前步驟中可能產(chǎn)生的泡沫。該上清液即為牛肉蛋白原樣液，采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白含量，于4 ℃下保存。

1.3.2 蛋白酶解

取0.1 mL提取液用0.4 mL緩沖液混合稀釋加入到試管中，然后加入2.4 mL濃度為30 mmol/L 碳酸氫銨混合均勻，將提取物在90 ℃下加熱30 min，以使溶液中的蛋白質(zhì)變性，冷卻至室溫，隨后添加50 mmol/L 二硫蘇糖醇使其最終濃度為5 mmol/L。添加150 mmol/L碘代乙酰胺使蛋白質(zhì)烷基化，最終濃度為15 mmol/L，暗處反應(yīng)30 min。隨后，添加1.5 mL濃度為1 mg/mL的胰蛋白酶溶液(用30 mmol/L 碳酸氫銨配制)，立即將酶解液渦旋1 min，置于37 ℃酶解12 h。

1.3.3 肽段純化

將酶解液過(guò)固相萃取柱進(jìn)行脫鹽處理，先用3 mL甲醇洗滌和活化萃取柱，然后用3 mL體積分?jǐn)?shù)1%的甲酸平衡。將酶解液過(guò)柱，并用0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的甲酸沖洗柱子，將洗滌液裝入小柱，以定量轉(zhuǎn)移樣品。然后用1 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的甲酸洗滌小柱。最后，將肽用3 mL的乙腈-水混合物(體積比1∶1，含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸)洗脫到離心管中，分2次重復(fù)洗脫，第1次加2 mL混合洗脫液，第2次加1 mL混合洗脫液，在第1次洗脫液后，將小柱浸泡10 min以使肽完全洗脫[9]。隨后，將全部洗脫液在氮?dú)饬髦写蹈?，分析前將純化物?.5 mL的乙腈-水混合物(體積比3∶97，含0.1%甲酸)復(fù)溶，渦旋30 s，過(guò)0.22 μm濾膜，上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃，進(jìn)樣室溫度10 ℃，流速0.2 mL/min；流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-水溶液，流動(dòng)相B為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫時(shí)間分別探討15、20、30、35 min，具體洗脫程序如表1所示。

表1 液相洗脫程序Table 1 Gradient elution program employed for the separation of peptides

質(zhì)譜條件：正離子(ESI+)靈敏度模式，毛細(xì)管電壓3.0 kV，離子源溫度130 ℃，脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔氣流速60 L/h，脫溶劑氣流速800 L/h，掃描時(shí)間0.2 s，數(shù)據(jù)格式為棒狀圖，一級(jí)母離子掃描范圍m/z為400～1 500，二級(jí)碎片離子掃描范圍m/z為50～2 000，前1 min和后6 min的流動(dòng)相進(jìn)廢液不采集信號(hào)；MS/MS優(yōu)化采集方法：根據(jù)各肽段的理論值(表2)，母離子m/z分別固定設(shè)為576.32(pep1)、554.79(pep2)、603.34(pep3)、672.36(pep4)、573.31(pep5)、525.28(pep6)、534.30(pep7)、563.80(pep8)，不加碰撞能；二級(jí)碎片離子碰撞能CE值分別設(shè)10、15、20、25、30、35、40 eV。TOF-MRM定量采集方法：母離子質(zhì)量數(shù)分別設(shè)為384.55(pep1)、554.79(pep2)、603.34(pep3)、672.36(pep4)、573.31(pep5)、525.28(pep6)、534.30(pep7)、376.20(pep8)，并選擇目標(biāo)增益功能；各肽段碎片定量離子和碰撞能采用優(yōu)化后的值。采用質(zhì)量鎖定技術(shù)測(cè)定準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)，以200 pg/μL的亮氨酸腦啡肽溶液為鎖定質(zhì)量溶液，流速為5 μL/min，電壓為0.53 kV，每隔30 s采集1次，在正離子模式下產(chǎn)生m/z556.277 1的離子[10]。

表2 TOF-MRM測(cè)定肉種屬用的各特征肽段的信息Table 2 Details of marker peptides determined by TOF-MRM in meat species determination

續(xù)表2

1.3.5 基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)評(píng)價(jià)

分別準(zhǔn)確稱取牛肉丸樣品9份，加緩沖液(0.3 mol/L KCl、0.3 mol/L KH2PO4、pH 6.5)提取，離心后取上清液過(guò)HLB柱凈化，收集流出液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，作為樣品溶液。取凈化后的樣品溶液1.6 mL，加入0.4 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)肽工作溶液至終質(zhì)量濃度為2.88～1 250 μg/L，注入U(xiǎn)PLC-QTOF MS測(cè)定，分別作基質(zhì)匹配和溶劑外標(biāo)曲線。ME以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與溶劑曲線斜率的比值評(píng)定[11]，比值>1，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；比值<1則為基質(zhì)抑制效應(yīng)，用ME表示，ME計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Waters公司的MassLynx 4.1軟件，通過(guò)提取MS/MS采集方法中各通道母離子及碎片離子的質(zhì)譜圖，調(diào)節(jié)碰撞能量以獲得各衍生產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好的離子碎片，并篩選出定量離子對(duì)。TOF-MRM定量采集圖選用ApexTrack的積分方法，適當(dāng)調(diào)整積分參數(shù)的方式完成色譜積分，根據(jù)質(zhì)譜圖中碎片離子峰的強(qiáng)度進(jìn)行定量分析[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

分別取合成肽的母液1.0 mL，分別加入3%乙腈水(含0.1%甲酸)復(fù)溶液稀釋成濃度為0.1 mg/L的肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，將各肽標(biāo)準(zhǔn)溶液注入進(jìn)樣器中，色譜分離后在正離子模式下進(jìn)行MS/MS掃描，得到各肽的母離子及碎片離子峰的掃描圖，如圖1所示。毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和碰撞能量是影響質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果的重要因素，錐孔電壓直接影響各組分的靈敏度[10]，過(guò)高的錐孔電壓會(huì)導(dǎo)致分子離子在離子源內(nèi)發(fā)生碰撞解離，從而影響母離子的豐度，進(jìn)而影響檢出限和靈敏度。錐孔電壓40 V且不加碰撞能量下采集的質(zhì)譜圖中各肽母離子帶2個(gè)或3個(gè)電荷的信號(hào)強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好，施加碰撞能量后采集的二級(jí)質(zhì)譜圖中各肽段的碎片離子主要是y離子，且母離子帶3個(gè)電荷的肽段所得碎片離子中伴有帶2個(gè)電荷的碎片離子形成，如表3和圖1-a所示。各肽段施加不同碰撞能量對(duì)碎片離子質(zhì)譜圖的影響如圖1-b所示，隨著施加碰撞能量的增大，各肽段的母離子信號(hào)強(qiáng)度降低、碎片離子信號(hào)強(qiáng)度增加，如前所述主要以y離子形式存在，分別選擇576.322+(pep1)、554.792+(pep2)、603.342+(pep3)、672.362+(pep4)、573.312+(pep5)、525.282+(pep6)、534.302+(pep7)、563.802+(pep8)作為各肽段定量分析的母離子，使用TOF-MRM采集模式和目標(biāo)增益采集數(shù)據(jù)，該模式下四極桿中選擇母離子，儀器的目標(biāo)增益功能可增加目標(biāo)離子的靈敏度，從而大大增強(qiáng)了定量分析的靈敏度和選擇性。優(yōu)化后的定量分析的碎片離子和碰撞能如表3所示。

表3 八條特征肽段測(cè)定結(jié)果Table 3 Measured results of eight marker peptides

2.2 色譜條件的優(yōu)化

質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的肽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，分別采用1.3.4中的3種洗脫梯度進(jìn)行色譜分析，TOF-MRM質(zhì)譜模式采集，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，不同梯度洗脫分離的8種特征肽的分離效果差異較大，大部分肽的色譜圖的峰形較好，各特征肽的信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)，信號(hào)穩(wěn)定，30 min洗脫程序的分離效果更好，但特征肽1和特征肽6的分離效果較差，分離度僅為0.99，而特征肽7和特征肽3的出峰時(shí)間較晚，分離效果非常好，因而可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，壓縮前5 min和最后10 min程序洗脫的時(shí)間，拉長(zhǎng)中間程序洗脫的時(shí)間，優(yōu)化后的洗脫程序如表4所示。

表4 優(yōu)化后的8種特征肽液相色譜分離洗脫程序Table 4 Optimized elution procedure of 8 marker peptides by liquid chromatography separation

圖2 液相色譜梯度洗脫程序的優(yōu)化Fig.2 Optimization of gradient elution procedure in liquid chromatography

a-碎片離子形成；b-碰撞能優(yōu)化圖1 肽中碎片離子形成和碰撞能優(yōu)化Fig.1 Fragment ion formation in marker peptides and optimization of collision energy in MS/MS acquisition modes注：圖1-b中2至8通道分別施加10、15、20、25、30、35、40 eV碰撞能

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

由圖3可以看出，特征肽pep8和pep1的信號(hào)強(qiáng)度較弱，這主要是因?yàn)樵贛S/MS模式下設(shè)定帶2價(jià)電荷的母離子，而TOF-MRM模式下pep8和pep1的母離子有帶2價(jià)電荷的母離子和帶3價(jià)電荷的母離子，二者共存，且?guī)?價(jià)電荷的母離子的信號(hào)強(qiáng)度更大，因而特征肽pep8和pep1的母離子需要選帶3價(jià)電荷的離子作為目標(biāo)母離子，信號(hào)強(qiáng)度分別增強(qiáng)3.8和6.6倍，優(yōu)化后的各特征肽TOF-MS/MS圖譜如圖4所示，分離效果好、信號(hào)穩(wěn)定。

圖4 優(yōu)化后的肽測(cè)定圖譜Fig.4 The optimized peptide chromatogram

續(xù)表3

a-特征肽測(cè)定的色譜-質(zhì)譜圖；b-特征肽pep1的母離子質(zhì)譜圖；c-特征肽pep8的母離子質(zhì)譜圖圖3 母離子對(duì)TOF-MRM定量分析的影響Fig.3 Effect of parent ions on TOF-MRM quantitative analysis

2.4 方法學(xué)考察

移取適量的特征肽混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.3的方法處理，配制系列濃度的特征肽混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定，各特征肽的檢測(cè)結(jié)果如表5所示。由于所添加的2種特征肽為樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線是在扣除基質(zhì)本底后繪制而成，其余特征肽可直接繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。LOD和定量限(limit of quantitation，LOQ)是通過(guò)在空白樣品中添加目標(biāo)組分的方法分別依據(jù)其特征離子色譜峰的信噪比(S/N)大于3和10而測(cè)定的[12]。8種目標(biāo)特征肽的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.98，樣品中各測(cè)定的目標(biāo)特征肽均在線性范圍內(nèi)。一般情況下，ME在85%～115%時(shí)不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。據(jù)此判斷，本檢測(cè)方法對(duì)特征肽1、3、4有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)，而對(duì)其他特征肽的基質(zhì)效應(yīng)不顯著(表5)。

表5 特征肽測(cè)定的回歸方程、檢出限、定量限及METable 5 Regression equation, detection limit，quantitation linit and ME for determination of marker peptides

2.5 方法的回收率、精密度及其穩(wěn)定性

移取適量的特征肽混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，加入到肉樣品中，配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度水平(1、10、50倍定量限)的添加試驗(yàn)，按照1.3.1的方法處理，回收率和精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表6所示。各特征肽目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為61%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations，RSD)<10%，可用于肉及肉制品樣品中特征肽含量的測(cè)定。

表6 樣品中特征肽測(cè)定的添加回收率及RSDTable 6 Recoveries and RSD of marker peptides spiked in meat samples

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

為了驗(yàn)證所建立分析方法的適用性，對(duì)市場(chǎng)上隨機(jī)抽取的7種價(jià)位的35份牛肉丸樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表7所示。結(jié)果顯示，本次抽樣篩查的牛肉丸樣品中共檢測(cè)出5條特征肽，其種屬來(lái)源分別為牛肉2條、豬肉1條、雞肉2條，這表明牛肉丸樣品中不同程度地混有其他種類的肉，其混入量不等，與牛肉丸的價(jià)格高低無(wú)關(guān)。鴨肉中的2條特征肽沒(méi)檢出，可能是牛肉丸樣品中未混入鴨肉，而另1條豬肉特征肽未測(cè)到，可能是與該特征肽在豬不同部位的肉中的分布有關(guān)，有待深入探討，后續(xù)論文另有研究報(bào)道。并且采用四極桿串聯(lián)軌道阱中的信息依賴性、信息非依賴性、平行反應(yīng)模式等采集模式及PCR方法進(jìn)行對(duì)比，測(cè)定結(jié)果與本方法吻合，進(jìn)一步證明了所建方法的可靠性。

表7 牛肉丸樣品中特征肽測(cè)定的結(jié)果 單位：mg/g

3 結(jié)論

8條目標(biāo)特征肽的母離子帶2個(gè)或3個(gè)電荷的信號(hào)強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好，施加碰撞能量后采集的二級(jí)質(zhì)譜圖中各肽段的碎片離子主要是y離子，且母離子帶3個(gè)電荷的肽段所得碎片離子也有帶2個(gè)電荷的碎片離子，使用TOF-MRM采集模式和目標(biāo)增益采集數(shù)據(jù)可增加目標(biāo)離子的檢測(cè)靈敏度，從而大大增強(qiáng)了定量分析的靈敏度和選擇性。優(yōu)化后梯度對(duì)8條特征肽的洗脫分離效果非常好，特征肽8和特征肽1的母離子選帶3價(jià)電荷的離子，優(yōu)化后的質(zhì)譜信號(hào)穩(wěn)定、檢出限低，相關(guān)系數(shù)在0.99左右，各特征肽目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為61%～102%，RSD<10%，可用于肉及肉制品中特征肽含量的測(cè)定及肉類摻假鑒別。市場(chǎng)上7種價(jià)位的牛肉丸中共檢出5條特征肽，其中2條來(lái)源于雞肉、1條來(lái)源于豬肉，這表明牛肉丸樣品中不同程度地混有雞肉或豬肉，且其混入量不等、與價(jià)格高低無(wú)關(guān)，這進(jìn)一步證明了所建方法的可靠性與可應(yīng)用性。