牛肉PCR-核酸試紙條快速鑒定方法的建立及試劑盒的研制

姜海瀛，張志杰，王艷雙，張莉，高麗君，李明成,4，孫麗媛，張麗華

1(北華大學 醫(yī)學技術學院，吉林 吉林，132013)2(北華大學 臨床學院，吉林 吉林，132013)3(北華大學 醫(yī)學院，吉林 吉林，132013)4(北華大學 吉林省中藥DNA指紋檢測技術科技創(chuàng)新中心，吉林 吉林，132013)5(吉林市第三十二中學，吉林 吉林，132013)6(吉林雷寧食品藥品檢測技術服務有限公司，吉林 吉林，132013)

肉類食品安全已經(jīng)成為全球關注的公共安全問題，比如“歐洲的馬肉風波”[1]、“沃爾瑪狐貍肉事件”[2]等。肉類食品質量的好壞尤其是肉食品的真實性直接關系到人民群眾健康和生命安全。普通消費者難以通過感官分辨摻假肉食品，執(zhí)法部門目前也缺乏簡便有效快速的實地檢測技術手段，對摻假管控乏力。

基于蛋白的檢測手段，由于不同組織細胞和不同生長階段的表達水平不同，易受熱加工變性的影響，用于肉類食品的鑒定存在局限性[3-4]。相反，核酸作為生物體的基本遺傳物質, 廣泛存在于各種組織細胞中即無組織特異性，但在同種生物體內(nèi)核酸序列具有高度的保守性即具有種屬特異性。并且，耐熱性更好，結構更穩(wěn)定，更有利于物種鑒別[5]。

是一種靈敏度高、特異性強、反應快速的檢測方法。能夠準確、快速、客觀地鑒別肉類食品成分的動物來源，已經(jīng)廣泛地用于食品摻假成分的檢測[6-7]。本團隊利用多重PCR技術可快速高通量鑒定牛肉中常見摻假動物源性成分[8]。核酸試紙條是一種快速的免疫學測定方法[9]，具有簡單、快速、可視化、低成本等特點。PCR-核酸試紙條法融合二者的特點，目前此技術已經(jīng)在轉基因黑曲霉[10]、艾滋病毒[11]、丙型肝炎病毒[12]、線蟲[13]、乙型肝炎病毒[14]、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、獸醫(yī)疫病的檢測[15]中得到應用，適合基層單位就地檢測，被認為是食品安全檢測最有前途的新技術之一，已成為食品安全檢測的主要發(fā)展趨勢[16-17]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗樣品：牛肉、豬肉、馬肉、羊肉、驢肉、雞肉、鴨肉、狗肉、兔肉等均購于本地超市。實測樣本購于本地農(nóng)貿(mào)市場。樣品為鮮品，生理鹽水洗滌3次，去結締組織和脂肪，保存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設備

Q6000超微量紫外-可見分光光度計，美國Quawell；T100 PCR儀、UV White-2020D紫外凝膠成像分析儀，美國Bio Rad公司；H-2050R高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；LX-100手掌型離心機，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DYY-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠；HH.S精密恒溫水浴鍋，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 實驗試劑

DL100 bp DNA Marker、λDNA/HindⅢ、2×TaqPCR Master Mix、氨芐青霉素(ampicillin，Amp)、5-溴4-氯-3-吲哚-β-D硫代半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside，X-Gal)、異丙基β-D硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、DH5α感受態(tài)細胞、DNA凝膠回收試劑盒、pGM-T載體連接試劑盒、質粒DNA小量提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成；一次性核酸試紙條，杭州優(yōu)思達生物技術有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 基因組DNA的提取及質量鑒定

1.4.1.1 基因組DNA的提取

取肉類樣品各100 mg置于1.5 mL離心管中，剪碎；加入P1細胞裂解液500 μL [ 10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)10 mL，1 mol/L Tris-HCl(pH值7.5) 1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 2 mL，NaCl 0.58 g，20 mg/mL 蛋白酶K 1 mL，RNA酶5 μL，加滅菌ddH2O定容至100 mL]，振蕩混勻，55 ℃ 水浴1 h；加到DNA純化柱中，12 000 r/min離心3 min，棄去過濾液，加入P2漂洗液600 μL [5 mol/L 乙酸鉀26 μL，l mol/L Tris-HCl(pH 7.5) 18 μL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) 3 μL，無水乙醇480 μL，無菌ddH2O 73 μL ]，12 000 r/min離心1 min；棄去過濾液，重復洗滌1次，棄去過濾液，12 000 r/min離心2 min；將DNA純化柱轉移入另一離心管中，加入P3無菌ddH2O 100 μL，室溫放置10～20 min后，12 000 r/min離心2 min；離心液即供試品DNA溶液，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.2 基因組DNA的質量鑒定

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，并且取基因組DNA原溶液1 μL，利用微量核酸蛋白分析儀，分析樣品的濃度(A260×50 ng/μL)及純度(A260/A280)。

1.4.2 基因組DNA進行PCR擴增及結果檢測

1.4.2.1 引物的設計與標記

牛肉引物序列來自GB/T 20190—2006[18]，分別在引物的5′端進行標記，引物序列如下：上游引物5′(FAM)-ATGCTTAGAAGGGATGA-3′，下游引物5′(Biotin)-TAGGGAGGCTATTACG-3′，擴增片段長度為271 bp，由上海生物工程有限公司合成。

1.4.2.2 PCR反應條件的優(yōu)化

取牛肉及其他肉類樣品基因組DNA溶液、空白對照液各2 μL，加入試劑盒中PCR反應管23 μL反應體系中(其中10 μmol/μL上游引物、下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL)，總體積25 μL。進行PCR擴增，PCR反應參數(shù)為94 ℃預變性5 min，20～30個循環(huán)(94 ℃ 30 s，56～59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min。

1.4.2.3 PCR產(chǎn)物檢測

取PCR產(chǎn)物5 μL 加到2%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠孔中，在1×TBE電泳緩沖液中，100 V電泳40 min后，取凝膠在紫外分析儀上檢視并拍照。取PCR產(chǎn)物5 μL滴加到試紙條的樣品區(qū)，然后插入到含有95 μL展開緩沖液的試管中，2～3 min后即可見檢測結果并拍照。

1.4.2.4 結果判定

供試品凝膠電泳圖譜中，在與陽性對照品凝膠電泳圖譜相應的位置上，在200～300 bp有1條DNA條帶，空白對照無條帶。供試品核酸試紙條圖譜中，在與陽性對照品核酸試紙條圖譜相應的位置上，出現(xiàn)2條紅色條帶，空白對照出現(xiàn)1條紅色條帶。

1.4.3 牛肉陽性對照品的克隆及序列驗證

回收牛肉陽性對照品 PCR產(chǎn)物與pGM-T載體16 ℃過夜連接，轉入DH5α感受態(tài)細胞，增殖4 h后取菌液30 μL涂布于含Amp、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃過夜，挑取白色菌落，在含Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質粒DNA進行PCR擴增驗證為陽性重組DNA分子，送至上海生工采用正反2個引物雙向測序，測序結果與靶基因進行比對分析。擴增區(qū)域DNA序列與牛靶基因特異性指紋區(qū)段DNA序列完全一致，同源性100%，確定為牛肉DNA陽性對照液。

1.4.4 牛肉DNA檢測試劑盒的設計

試劑盒為20次用量，由8部分組成，包括DNA提取、PCR擴增和結果檢測(表1)。

表1 自主研發(fā)牛肉DNA提取、PCR擴增和結果檢測試劑盒的組成及特征Table 1 Composition and characteristics of self-developed beef DNA extraction, PCR amplification and results detection kit

1.4.5 試劑盒的評價

1.4.5.1 特異性

對牛肉正品及其他肉類樣品在59 ℃,20個循環(huán)條件下進行PCR特異性擴增，核酸試紙條檢測試劑的特異性，并用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

1.4.5.2 重現(xiàn)性

對牛肉正品及其他肉類樣品分別在3個實驗室，由3位技術人員檢測相同樣品，核酸試紙條檢測觀察試劑的重現(xiàn)性，并用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

1.4.5.3 穩(wěn)定性

試劑盒配制后第3、6、9、12個月進行檢測，核酸試紙條檢測試劑的穩(wěn)定性，并用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

1.4.5.4 靈敏性

將牛肉正品DNA對照液進行101、102、103、104、105倍稀釋，并進行PCR擴增，核酸試紙條檢測試劑的靈敏性，并用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

1.4.5.5 樣品最低檢出限

將牛肉正品及其他肉類樣品(牛肉100 mg、其他肉類各0 mg，牛肉30 mg、其他肉類各8.75 mg，牛肉20 mg、其他肉類各10 mg，牛肉10 mg、其他肉類各11.25 mg，牛肉5 mg、其他肉類各11.875 mg)進行混合，提取基因組DNA，進行PCR擴增，利用核酸試紙條檢測試劑的最低檢出率，并用瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

1.4.6 實際樣品檢測

使用自主研發(fā)的試劑盒對市售9個樣品進行檢測，核酸試紙條鑒定樣品的真?zhèn)危⒂铆傊悄z電泳進行驗證。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的提取及質量鑒定結果

采用自主研發(fā)的試劑能夠成功的提取出牛肉及其易混品的基因組DNA，經(jīng)測定純度為1.7～1.9，質量濃度為200～300 ng/μL。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，基因組DNA無降解(圖1)。

2.2 PCR擴增反應條件的優(yōu)化及擴增產(chǎn)物檢測

如圖2所示，利用GB/T 20190—2006中的反應條件，在56 ℃，30個循環(huán)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，牛肉出現(xiàn)1條陽性條帶，但是馬和羊肉出現(xiàn)非特異性擴增條帶，其余陰性對照及空白對照均無條帶出現(xiàn)。

M-λDNA/HindⅢ；1-豬肉；2-牛肉；3-馬肉；4-羊肉；5-驢肉；6-雞肉；7-鴨肉；8-狗肉圖1 基因組DNA電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic map of genomic DNA

M-DL100 bp Marker；1-牛肉陽性對照；2-牛肉正品1；3-牛肉正品2；4-豬肉；5-馬肉；6-羊肉；7-驢肉；8-雞肉；9-鴨肉；10-狗肉；11-兔肉；N-空白對照a-退火溫度56 ℃,30個循環(huán)；b-退火溫度57 ℃,25個循環(huán)；c-退火溫度59 ℃,25個循環(huán)；d-退火溫度59 ℃,20個循環(huán)圖2 PCR反應條件篩選圖譜Fig.2 Screening map of PCR reaction conditions

在57 ℃，25個循環(huán)下進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)1條陽性條帶，其余陰性對照及空白對照均無條帶出現(xiàn)。但是核酸試紙條檢測結果顯示，牛肉樣品出現(xiàn)質控線(C線)、檢測線(T線)2條紅色條帶，而馬、羊、驢肉樣品均出現(xiàn)2條紅色條帶(C線明顯、T線均隱約可見)，其余陰性對照及空白對照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。

在59 ℃，25個循環(huán)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)1條陽性條帶，其余陰性對照及空白對照均無條帶出現(xiàn)。但是核酸試紙條檢測結果顯示，牛肉樣品出現(xiàn)C線、T線2條紅色條帶，而此時只有馬肉樣品出現(xiàn)2條紅色條帶(C線明顯、T線均隱隱約約可見)，其余陰性對照及空白對照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。

在59 ℃，20個循環(huán)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)1條陽性條帶，其余陰性對照及空白對照均無條帶出現(xiàn)。核酸試紙條檢測結果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)C線、T線2條紅色條帶，陰性對照及空白對照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。

因此，PCR反應條件定為59 ℃，20個循環(huán)。

2.3 牛肉標準對照液的克隆及序列驗證結果

經(jīng)過分子克隆篩選，可見氨芐陽性平皿出現(xiàn)藍-白菌落(圖3)。挑區(qū)白色菌落培養(yǎng)，提取質粒DNA，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，退火溫度59 ℃時，在271 bp有1條特異性DNA條帶(圖4)。將牛肉質粒DNA送至上海生工進行測序，結果顯示擴增區(qū)域DNA序列與牛線粒體DNA特異性指紋區(qū)段DNA序列完全一致，同源性為100%(圖5)，將牛肉質粒DNA作為牛肉陽性對照液，裝入牛肉PCR-核酸試紙條快速檢測試劑盒中。

a-Amp；b-Amp+牛圖3 牛肉DNA分子克隆藍-白斑篩選圖譜Fig.3 DNA molecular clone blue-white selection of beef

M-DL100 bp Marker；1-牛肉陽性對照；N-空白對照圖4 牛肉質粒DNA PCR電泳圖譜Fig.4 PCR electrophoresis map of beef plasmid DNA

圖5 牛肉質粒DNA測序與牛靶基因比對結果圖譜Fig.5 Comparis on results of beef plasmid DNA sequencing and bos target gene

2.4 試劑盒評價結果

2.4.1 特異性

對牛肉正品及其他肉類樣品在59 ℃,20個循環(huán)條件下進行PCR特異性擴增，核酸試紙條檢測結果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)C線、T線2條紅色條帶，陰性對照及空白對照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。瓊脂糖凝膠電泳驗證正確(圖6)。表明自主研發(fā)的試劑盒特異性強。

M-DL100 bp Marker;1-牛肉陽性對照DNA克隆液；2-牛肉陽性對照；3-牛肉正品；4-豬肉；5-馬肉；6-羊肉；7-驢肉；8-雞肉；9-鴨肉；10-狗肉；11-兔肉；N-空白對照圖6 PCR-核酸試紙條快速檢測試劑盒特異性圖譜Fig.6 Specificity map of PCR-nucleic acid strip fast detection kit

2.4.2 重現(xiàn)性

對牛肉正品及其他肉類樣品分別在3個實驗室，由3位技術分析人員檢測相同樣品，核酸試紙條檢測結果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)C線、T線2條紅色條帶，陰性對照及空白對照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。瓊脂糖凝膠電泳驗證正確(圖7)。表明自主研發(fā)的試劑盒重現(xiàn)性好。

2.4.3 穩(wěn)定性

分別在試劑盒配制后第3、6、9、12個月進行檢測。核酸試紙條檢測結果顯示，只有牛肉樣品出現(xiàn)C線、T線2條紅色條帶，陰性對照及空白對照均出現(xiàn)C線1條紅色帶。瓊脂糖凝膠電泳驗證正確(圖8)。表明自主研發(fā)的試劑盒穩(wěn)定性良好，試劑盒的保質期可以暫定1年。

M-DL100 bp Marker；1-牛肉陽性對照DNA克隆液；2-牛肉陽性對照；3-牛肉正品；N-空白對照a-3個月；b-6個月；c-9個月；d-12個月圖8 PCR-核酸試紙條快速檢測試劑盒穩(wěn)定性圖譜Fig.8 Stability map of PCR-nucleic acid strip fast detection kit

2.4.4 靈敏性

核酸試紙條檢測結果顯示，DNA原液、稀釋101、102倍模板出現(xiàn)的T線、C線2條紅色條帶明顯，稀釋103、104倍的模板出現(xiàn)T線、C線2條紅色條帶(C線明顯、T線條帶隱約可見)，稀釋105倍模板與空白對照只出現(xiàn)C線1條紅色條帶。而瓊脂糖凝膠電泳稀釋102倍模板無電泳條帶出現(xiàn)。表明核酸試紙條法的靈敏度至少高于瓊脂糖凝膠電泳法10倍(圖9)。

2.4.5 樣品最低檢出限

核酸試紙條檢測結果顯示只要取樣的混合肉樣中含有5 mg的牛肉，就可檢定出陽性結果。瓊脂糖凝膠電泳驗證一致(圖10)。

M-DL100 bp Marker；1-DNA原液；2-稀釋101倍；3-稀釋102倍；4-稀釋103倍；5-稀釋104倍；6-稀釋105倍；N-空白對照圖9 PCR-核酸試紙條快速檢測試劑盒靈敏性圖譜Fig.9 Sensitivity map of PCR-nucleic acid strip fast detection kit

M-DL100 bp Marker；1-牛肉100 mg，其他肉類各0 mg；2-牛肉30 mg，其余肉類各8.75 mg；3-牛肉20 mg，其他肉類各10 mg；4-牛肉10 mg，其他肉類各11.25 mg；5-牛肉5 mg，其他肉類各11.875 mg；N-空白對照圖10 PCR-核酸試紙條快速檢測盒最低檢出限圖譜Fig.10 Minimum detection limit map of PCR-nucleic acid strip fast detection kit

2.5 實際樣品檢測結果

使用自主研發(fā)的試劑盒對市售9個樣品進行檢測真?zhèn)舞b定，核酸試紙條檢測結果顯示，牛肉陽性對照液、陽性對照和9個樣品均出現(xiàn)2條紅色條帶，空白對照出現(xiàn)1條紅色帶。瓊脂糖凝膠電泳驗證正確(圖11)。表明本地市場牛肉安全性良好。

M-DL100 bp Marker;1-牛肉陽性對照DNA克隆液；2-牛肉陽性對照；N-空白對照；3,4,5-生牛肉；6,7,8-熟牛肉；9,10,11-牛肉片圖11 PCR-核酸試紙條快速檢測盒檢測實際樣品圖譜Fig.11 Map of real samples detected by PCR-nucleic acid strip fast detection kit

3 討論

PCR-核酸試紙條檢測原理，引物的5′端分別標記羧基熒光素(fluorescein,F)和生物素(biotin,B)，則PCR產(chǎn)物都帶有2種標記物，取產(chǎn)物5 μL滴加到試紙條的樣品區(qū)，然后插入到含有95 μL展開緩沖液的試管中，展開緩沖液通過毛細作用向前流動進行層析，生物素端首先與固定在金標墊上的鏈霉親和素的膠體金顆粒結合，形成復合物(Au-SA-B)，液相到達檢測線(T線)，固定在T線上的抗熒光素抗體捕獲熒光素端，形成形成復合物(Anti-F-F-Au-SA-B)，停留在T線處，產(chǎn)生紅色條帶，多余的膠體金顆粒被質控線(C線)上的B捕獲，使C線也產(chǎn)生紅色條帶，當擴增產(chǎn)物不存在時，膠體金顆粒無法停留在T線處，而被C線上的B捕獲，所以只有C線出現(xiàn)1條紅色條帶[14]。2～3 min后即可見檢測結果(圖12)。

S-樣品區(qū)；T-檢測線；C-質控線；Au-納米金粒子；SA-鏈霉親和素；B-生物素；F-熒光素；Anti-F-抗熒光素；BSA-牛血清白蛋白圖12 核酸試紙條法檢測原理Fig.12 Detection principle of nucleic acid test strip method

在食品安全的實地監(jiān)督和管控工作中，需要開發(fā)不依賴貴重儀器設備、簡單快速、低成本的鑒定方法和檢測試劑。本研究建立的肉類食品中牛肉PCR-核酸試紙條快速鑒定方法及研發(fā)的配套檢測試劑盒，為了實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，對核酸提取、擴增與產(chǎn)物檢測3個基本模塊進行優(yōu)化和篩選，以期在保證結果準確可靠的前提下，盡量操作簡便、快速、規(guī)范。

本實驗核酸提取模塊，直接將裂解后的細胞溶液倒入純化柱中進行純化，溶解得到DNA溶液。只需裂解、純化、溶解3步完成核酸的提取，操作步驟簡單，縮短了提取時間，得到DNA的濃度、純度、完整性均完全滿足PCR的要求。核酸PCR擴增模塊，優(yōu)化退火溫度及循環(huán)次數(shù)，使得在最短的時間內(nèi)59 ℃,20個循環(huán)所得PCR產(chǎn)物檢測結果最佳，擴增時間與國家標準相比縮短了30 min。PCR產(chǎn)物檢測模塊，采用核酸試紙條檢測2～3 min即出現(xiàn)可視化的結果，操作簡便快捷，與凝膠電泳檢測相比節(jié)省1 h，并且不需要電泳裝備和紫外裝置參與，更適于現(xiàn)場檢測。

本研究將3個模塊整合到一起，包括DNA提取試劑(P1、P2、P3)、PCR檢測試劑(23 μL PCR反應體系中，其中10 μmol/μL上、下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，滅菌ddH2O 8.5 μL)、核酸試紙條以及陽性對照液、空白對照液。只需將提取的DNA溶液2 μL直接加入到23 μL PCR反應體系中，就可進行PCR擴增，利用核酸試紙條進行可視化檢測，同時提供陽性對照液、空白對照液。1個試劑盒解決了從DNA提取、PCR擴增及結果檢測的全部操作，直接解決特異性引物設計與篩選的技術難題；又可以避免試劑配制的繁瑣，購買太多試劑造成浪費，以及防止不同來源試劑對實驗結果造成影響；并且陽性對照品以DNA克隆液的形式提供，直接反映了牛肉獨一無二的DNA序列，避免每次提取對照品時誤差的產(chǎn)生，檢測結果特異性強、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好、靈敏度更高。

本研究成果同時具有PCR技術的特異性強、靈敏度高的特點,核酸試紙條可視化、簡便快速、低成本的優(yōu)勢，試劑盒的標準化、規(guī)范化的特征，更適合執(zhí)法部門和檢測人員現(xiàn)場快速檢測。對于規(guī)范食品生產(chǎn)與流通、保障食品安全具有十分重要的意義。