水乳化法制備羅丹明B接枝瓊脂糖熒光微球?

李誠(chéng)博， 程笑晨， 劉晨光

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

熒光微球在多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用，例如污染檢測(cè)[1-2]、生物標(biāo)記[3]、體內(nèi)或體外成像[4]、藥物運(yùn)送[5]、疾病診斷[6]、免疫分析等[7]。熒光微球可以通過(guò)多種材料進(jìn)行制備，包括多聚物[8]、硅[9]以及磁性粒子[10]。常用的熒光微球制備方法有2種：第一種是制備微球時(shí)將染料與原料混合[11]，另一種方法是在微球成功制備后再添加染料[12]。在熒光微球中的制備過(guò)程中，通常使用有機(jī)染料和量子點(diǎn)做為熒光基團(tuán)。然而，應(yīng)用這些材料有許多缺點(diǎn)，例如使用量子點(diǎn)作為熒光基團(tuán)會(huì)產(chǎn)生一定的毒性[13-14]，有機(jī)染料會(huì)導(dǎo)致光漂白現(xiàn)象的發(fā)生[15]，有些熒光染料甚至?xí)l(fā)生熒光泄漏[16]。為了克服量子點(diǎn)和有機(jī)染料的不足，亟需探索新的制備方法。通過(guò)化學(xué)修飾得到的具有良好物化性質(zhì)的多聚物是一種制備熒光微球材料的理想選擇，因?yàn)檫@些材料具有抗光漂白特性以及熒光發(fā)射的均一性[17-18]等優(yōu)點(diǎn)。

最近，由于熒光多糖材料的良好的相容性，其在微球的制備中受到了越來(lái)越多的關(guān)注。瓊脂糖，是一種可以被廣泛應(yīng)用到生物醫(yī)藥和生物工程中的一種紅藻多糖。由于其獨(dú)特的性質(zhì)，例如親水性、多孔性、長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定性以及無(wú)毒性[2,19]，瓊脂糖成為一種理想的制備微球的材料。瓊脂糖的基本二糖單元包括1,3連接的β-D-半乳糖和1,4連接的α-L-3,6-脫水半乳糖[20]。目前，對(duì)于熒光瓊脂糖的研究有將瓊脂糖與色氨酸接枝[21]，利用色氨酸的天然熒光特性使之具有熒光，另外還可將與萘乙酰[22]、腺嘌呤[23]等物質(zhì)與瓊脂糖接枝使之具有熒光，而沒(méi)有關(guān)于單純的瓊脂糖與羅丹明B的熒光接枝產(chǎn)物的相關(guān)文章。本文將羅丹明B這種常見的熒光染料進(jìn)行接枝熒光標(biāo)記，可以減輕成本，同時(shí)也可以拓寬熒光指示材料的應(yīng)用范圍。此外，本實(shí)驗(yàn)中使用水水乳化的方法制備瓊脂糖微球也具有很大優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@個(gè)方法避免了有機(jī)溶劑[24]和表面活性劑的應(yīng)用，從而減少聚集、降低污染[25]。

在本文中，我們選擇羅丹明B作為熒光素合成了瓊脂糖-羅丹明B(RB)接枝的多聚物(ARB)，檢測(cè)了其物理和化學(xué)特性。此外，本文還通過(guò)水水乳化方法制備瓊脂糖熒光微球并檢測(cè)其熒光特性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

主要材料和儀器：瓊脂糖(BIOWEST公司)，環(huán)氧氯丙烷(天津廣成化學(xué)有限公司)，羅丹明B(國(guó)藥集團(tuán))，攪拌機(jī)(RW20，IKA)，熒光分光光度計(jì)(F-4500 FL Spectrophotometer，HITACHI)，熒光顯微鏡(Eclipse 50i，Nikon)，掃描電子顯微鏡(JSM-6380,JEOL)，傅里葉紅外光譜儀(Impact 410，Nicolet)，X射線衍射儀(ARLTMEQUINOX 100 X，Thermo)，熒光酶標(biāo)儀(VarioskanFlash,Thermo)。其余都為從國(guó)藥集團(tuán)采購(gòu)的分析純?cè)噭?/p>

1.2 瓊脂糖的活化

瓊脂糖的活化是將活潑的環(huán)氧基團(tuán)引入瓊脂糖凝膠上，瓊脂糖凝膠與親和配基在常溫或低溫下反應(yīng)，可以制備親和吸附介質(zhì)。將0.3 g瓊脂糖溶于3 mL蒸餾水中，將6 mL環(huán)氧氯丙烷溶液與21 mL蒸餾水混合。瓊脂糖和環(huán)氧氯丙烷的終濃度分別為1%和5%，混合溶液體積為30 mL。使用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH為10，并用攪拌器80 ℃連續(xù)攪拌3 h即可。

1.3 羅丹明B的交聯(lián)

活化后的瓊脂糖與羅丹明B的羧基發(fā)生反應(yīng)，起到化學(xué)交聯(lián)的目的。取一定量的羅丹明B加入到活化后的瓊脂糖中，并在80℃下持續(xù)攪拌3 h，瓊脂糖與羅丹明發(fā)生接枝反應(yīng)。隨后，加入90 ml的無(wú)水乙醇使之沉淀，再將接枝產(chǎn)物進(jìn)行凍干處理后，收集備用。反應(yīng)示意圖見圖1。

(a.瓊脂糖的羥基與環(huán)氧氯丙烷的-Cl在堿性環(huán)境中發(fā)生置換反應(yīng)；b.中間產(chǎn)物隨后與羅丹明發(fā)生接枝反應(yīng)。a.One of hydroxyl groups of agarose replaced the -Cl of epichlorohydrin at the alkaline environment; b.The intermediate products grafted with RB subsequently.)

圖1 瓊脂糖與羅丹明接枝的反應(yīng)示意圖
Fig. 1 The reaction formula of agarose and RB

1.4 性質(zhì)檢測(cè)

顯微鏡定性觀察。利用光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡來(lái)觀察修飾后的瓊脂糖形態(tài)及其熒光特性。檢測(cè)微觀形態(tài)以及驗(yàn)證合成產(chǎn)物是否產(chǎn)生熒光。采用綠光激發(fā)羅丹明B產(chǎn)生紅光，激發(fā)波長(zhǎng)為580 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm。

紅外檢測(cè)。將2 mg樣品與100 mg KBr混合研磨成粉末，再用壓片機(jī)壓成薄片。紅外檢測(cè)設(shè)定分辨率為4 cm-1，掃描數(shù)量為64遍，信噪比為25 000。記錄光譜范圍在400～4 000 cm-1。

X-射線衍射檢測(cè)晶體性。對(duì)照實(shí)驗(yàn)選用空白樣品，用塑料封裝，得到平滑的背景，并且無(wú)擴(kuò)散的晶體峰。X衍射采用的是粉末衍射儀，電壓、電流分別為40 kV和150 mA。X射線衍射圖案在角方位為20°～90°，步長(zhǎng)為0.05°。晶格參數(shù)通過(guò)里特維德方法測(cè)定衍射模式[26]。

1.5 羅丹明接枝瓊脂糖的熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

將修飾后的瓊脂糖通過(guò)熒光分光光度計(jì)進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)掃描與發(fā)射波長(zhǎng)掃描檢測(cè)。首先固定激發(fā)波長(zhǎng)，在300～750 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，每隔10 nm計(jì)數(shù)一次，繪制相應(yīng)波長(zhǎng)下熒光強(qiáng)度的散點(diǎn)圖，為激發(fā)光的波長(zhǎng)掃描圖。同理，發(fā)射光的波長(zhǎng)掃描圖是固定發(fā)射波長(zhǎng)，進(jìn)行上述相同操作。由此分別確定最佳的發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)，并與羅丹明B進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)化學(xué)合成后熒光性質(zhì)是否變化。

1.6 修飾后瓊脂糖微球的乳化制備

羅丹明B修飾后的瓊脂糖可以通過(guò)水油乳化法[27-28]或水水乳化法制備微球[29]。水油乳化法具體步驟如下：首先，將上述步驟制得的瓊脂糖于80 ℃溶于水，配置成1.5%溶液，加入到含有1%司班80的液體石蠟中，按照水油兩相比例為1∶8，加入瓊脂糖3 mL，液體石蠟24 mL，80 ℃、1 600 r/min條件下乳化30 min，隨后取出冰浴冷卻固化，離心后凍干保存。

水水乳化法具體步驟如下：將上述步驟制得的瓊脂糖溶于水中，加熱至80 ℃使之溶解，配置成2%溶液作為分散相。PEG10000溶于水，按照質(zhì)量體積比配制成20%水溶液。隨后，將2.5 mL制得的瓊脂糖溶液逐滴加入到25 mL的PEG溶液中，70 ℃、1 800 r/min條件下攪拌30 min。微球形成后，停止攪拌，將體系放入冰水浴中固化30 min。將固化后的體系進(jìn)行離心沖洗3次，再進(jìn)行凍干處理，隨后室溫保存。

1.7 微球的形態(tài)學(xué)觀察

將微球分散到蒸餾水中后，使用光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)，在放大200×?xí)r，使用數(shù)字圖像處理軟件捕獲顯微照片。通過(guò)掃描電子顯微鏡(1 600×)觀察瓊脂糖微球細(xì)微形態(tài)。樣品首先經(jīng)過(guò)凍干處理，處理后的樣品放在載玻片上，在充滿氬氣的空間中，濺射噴涂上金-鈀層。涂層后的樣品在20 kV的加速電壓下觀察，凍干后的微球大小、形態(tài)、粒徑等。同時(shí)，微球的熒光特性可以通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。在200×的放大條件下，采用綠色熒光激發(fā)，觀察微球是否有熒光特性。

1.8 粒徑分布

基于動(dòng)態(tài)光散射的粒度分析儀可以用來(lái)檢測(cè)和分析微球的各種參數(shù)?？梢砸罁?jù)直方圖及累積曲線進(jìn)行隨后的數(shù)據(jù)分析。平均粒徑在該儀器中定義為D50，表示為所有微球按照粒徑從小到大累積到50%時(shí)微球的粒徑。檢測(cè)時(shí)溫度維持在25 ℃。

1.9 微球的熒光接枝穩(wěn)定性

通過(guò)熒光接枝穩(wěn)定性，來(lái)考察制備熒光修飾瓊脂糖微球的必要性。本文制備了兩種微球，一種為非接枝的熒光瓊脂糖微球，即直接制備瓊脂糖微球，在制備過(guò)程中包埋液體羅丹明B。另一種為采用修飾后的羅丹明B接枝瓊脂糖熒光材料制備熒光微球。具體如下，用蒸餾水做對(duì)照，將0.1、0.5、1 mL的1%羅丹明B與1.5%的瓊脂糖混合，采用水水乳化法制備微球。同時(shí)，將修飾后的瓊脂糖設(shè)置兩個(gè)梯度，初始羅丹明加樣量分別為1.25%和5%(v/v)。將所有微球放入透析袋中，外部液體為蒸餾水，體系溫度為37 ℃，于100 r/s轉(zhuǎn)速輕微攪拌。按照時(shí)間間隔0、1、2、3、4、5、6、8、12、24、36、48、60 h，取出1 mL液體，隨后用蒸餾水補(bǔ)齊體積。通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定濃度，激發(fā)波長(zhǎng)580 nm，發(fā)射波長(zhǎng)610 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 羅丹明B接枝瓊脂糖的合成與表征

羅丹明B與瓊脂糖的修飾中間物為環(huán)氧氯丙烷。環(huán)氧氯丙烷是一種雙功能試劑，帶有環(huán)氧基團(tuán)和-Cl基團(tuán)。在活化的同時(shí)，瓊脂糖能夠達(dá)到一定程度的交聯(lián)。不但能夠增加瓊脂糖的機(jī)械性能，還可以增強(qiáng)其對(duì)強(qiáng)堿和高溫的耐受性。具體來(lái)說(shuō)(見圖1)，在堿性條件下，瓊脂糖的一個(gè)羥基替代了環(huán)氧氯丙烷的-Cl，如反應(yīng)式1。在相同的條件下，環(huán)氧氯丙烷的環(huán)氧基斷裂，與羅丹明B的羥基相連，于是中間產(chǎn)物與羅丹明B也會(huì)發(fā)生連接反應(yīng)，如反應(yīng)式2。羅丹明B接枝的瓊脂糖置于光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)修飾后瓊脂糖與單純瓊脂糖外觀基本一致，之后我們又在同一視野中觀察熒光特性，結(jié)果表明修飾成功表現(xiàn)為具有羅丹明B的熒光特性，即在綠光激發(fā)的條件下，顯微鏡視野中會(huì)出現(xiàn)發(fā)射紅光的物質(zhì)。

2.2 紅外檢測(cè)

為了更進(jìn)一步確定羅丹明B和瓊脂糖的接枝，我們將單純瓊脂糖，合成后瓊脂糖分別進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)(見圖2)。把單純瓊脂糖與修飾后瓊脂糖作為一個(gè)單元對(duì)比，同時(shí)也將不同取代度的瓊脂糖作為一個(gè)單元進(jìn)行對(duì)比。

如圖2a，羅丹明已經(jīng)與瓊脂糖進(jìn)行了化學(xué)交聯(lián)。瓊脂糖在3 423.31 cm-1表現(xiàn)出羥基振動(dòng)，在2 896.34 cm-1表現(xiàn)出碳?xì)滏I的伸縮振動(dòng)，在1 640.95 cm-1表現(xiàn)出碳碳雙鍵的伸縮振動(dòng)，在1 371.77 cm-1表現(xiàn)出碳?xì)滏I的彎曲振動(dòng)。對(duì)于修飾后的瓊脂糖，在2 896.34和1 371.77 cm-1峰處有減弱現(xiàn)象，原因?yàn)榻又α_丹明B后碳?xì)滏I所占比例減少，導(dǎo)致所吸收的量在總體比例下減少。同時(shí)在2 357.47 cm-1處多出了一個(gè)峰，此峰代表了累積雙鍵的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，代表了羅丹明B中的累積雙鍵，由此可以證明羅丹明B已經(jīng)經(jīng)過(guò)化學(xué)交聯(lián)與瓊脂糖在一起。

(a．瓊脂糖和羅丹明B接枝瓊脂糖的紅外光譜，綠線代表瓊脂糖紅外光譜，紅線代表經(jīng)過(guò)羅丹明B修飾的瓊脂糖；b. 不同濃度的接枝瓊脂糖的紅外光譜。a. The IR spectroscopy of agarose and ARB; b. The IR spectroscopy of two different kind of ARB.)

圖2 瓊脂糖和羅丹明B接枝瓊脂糖的紅外光譜
Fig. 2 The IR spectroscopy of agarose and ARB

如圖2b，從不同濃度的接枝瓊脂糖的紅外光譜可以看出，隨著羅丹明B量的增加，2 357.47cm-1峰越強(qiáng)。由此可以從側(cè)面說(shuō)明羅丹明的取代程度與羅丹明B的添加量有關(guān)。

2.3 X-射線衍射檢測(cè)

瓊脂糖和修飾后瓊脂糖的X衍射圖譜如圖3所示，所有的衍射圖譜中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的高峰，意味著瓊脂糖和修飾后瓊脂糖都是無(wú)定形狀態(tài)，即非晶體性。觀察圖像發(fā)現(xiàn)，修飾后瓊脂糖的X衍射強(qiáng)度比單純瓊脂糖的強(qiáng)度低，這是因?yàn)樵诃傊堑幕A(chǔ)上接枝羅丹明，會(huì)使結(jié)構(gòu)更加緊密[30-31]，在相同的體積下，修飾后瓊脂糖的密度大于單純瓊脂糖。

2.4 熒光激發(fā)光譜與發(fā)射光譜

羅丹明B修飾瓊脂糖粉末在熒光顯微鏡下觀察顯示，當(dāng)被綠光激發(fā)時(shí)，會(huì)發(fā)出紅色熒光，與羅丹明B相同。這可以部分證實(shí)羅丹明B與瓊脂糖接枝。同時(shí)，分別測(cè)量羅丹明B和羅丹明B接枝瓊脂糖的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，并對(duì)比研究羅丹明B和羅丹明B接枝瓊脂糖的熒光性質(zhì)(見圖4)。

(a．瓊脂糖；b. 羅丹明B接枝瓊脂糖。a. RB; b. ARB.)圖3 瓊脂糖和羅丹明B修飾瓊脂糖的X衍射圖像Fig. 3 The X-ray diffraction of agarose and ARB

(a．羅丹明B；b.羅丹明B接枝瓊脂糖。a. RB; b. ARB.)圖4 羅丹明B和羅丹明B接枝瓊脂糖的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜Fig. 4 Thefluorecent spectra of rhodamin B and ARB.

如圖4，修飾后瓊脂糖的熒光特性與羅丹明B基本相同，激發(fā)波長(zhǎng)都在560 nm左右，發(fā)射波長(zhǎng)都為580 nm。所以修飾后瓊脂糖中的羅丹明B性質(zhì)并未發(fā)生改變[32-33]。因此，在以后的檢測(cè)中可以按照羅丹明B的標(biāo)準(zhǔn)，增加了使用的方便性。

2.5 熒光微球的形態(tài)學(xué)觀察

修飾后瓊脂糖熒光微球的形態(tài)學(xué)觀察可以利用多種技術(shù)(見圖5)。采用光學(xué)顯微鏡(200×)(見圖5a)，可以清晰觀察到微球，由于其為冷凝固化，瓊脂糖的表面不是規(guī)則的平滑；羅丹明B修飾的瓊脂糖微球的內(nèi)部較單純瓊脂糖微球更加致密。圖5b為在同一視野中采用熒光顯微鏡觀察，采用綠光激發(fā)，發(fā)現(xiàn)熒光微球與羅丹明和修飾后瓊脂糖一樣，都產(chǎn)生紅色熒光。通過(guò)掃描電子顯微鏡進(jìn)一步觀察微球的形態(tài)(見圖5c)，發(fā)現(xiàn)微球具有較好的球形度，且未觀察到明顯及大量的損傷，這是因?yàn)槲⑶蛴休^好的機(jī)械性能，進(jìn)行凍干處理的機(jī)械行為不會(huì)導(dǎo)致明顯和巨大的損害。上述結(jié)果一致說(shuō)明通過(guò)水水乳化制備的瓊脂糖熒光微球具有良好球形的外部特征。在先前的研究中，水水乳化法被用于其他多種材料的微球制備[27-28,34]，同樣是溫和的條件，也可以制備出良好球形的微球。

(a.光學(xué)顯微鏡觀察；b.同一視野中熒光顯微鏡觀察；c.掃描電子顯微鏡觀察。a.Under optical microscope;b.Under fluorescence micro scope;c.Under SEM.)

圖5 微球的外部形態(tài)
Fig. 5 The morphology of the microparticles

相較于水油乳化，水水乳化法是一種較新的微球制備方法。所選用的材料無(wú)毒，無(wú)有機(jī)溶劑，制備條件溫和，從而不會(huì)對(duì)包埋的生物活性大分子或細(xì)胞造成危害；所得凝膠微球圓整度較好，表面光滑，微球粒徑較為均一。

2.6 微球粒徑分析

通過(guò)修飾后瓊脂糖微球的掃描電鏡照片以及粒度分析，可以進(jìn)行微球的粒度分散分析。如圖6所示，按照條件制備的微球平均粒徑為44 μm，在直方圖中微球粒徑分布有2個(gè)高峰，分別在5和70 μm左右，具有兩個(gè)峰的現(xiàn)象是傳統(tǒng)的乳化結(jié)果[35-36]。上述結(jié)果說(shuō)明水水乳化和水油乳化方法制備的瓊脂糖微球在物理性質(zhì)方面具有很高的相似性。

圖6 微球的粒徑分布Fig. 6 The range of particle sizes of microparticles

2.7 熒光接枝穩(wěn)定性

將修飾后熒光微球與單純包埋羅丹明B的瓊脂糖微球進(jìn)行了比較(見圖7)，發(fā)現(xiàn)單純包埋的瓊脂糖微球體系中微球的熒光強(qiáng)度在12 h內(nèi)減少迅速，一直到60 h后基本平緩。加入越多的羅丹明B，整個(gè)體系的熒光強(qiáng)度越高，即初始熒光強(qiáng)度也越高。對(duì)于經(jīng)過(guò)修飾后的瓊脂糖熒光微球，只有熒光強(qiáng)度的微小變化，可以歸結(jié)為隨機(jī)波動(dòng)，整體熒光強(qiáng)度沒(méi)有變化。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明羅丹明B與瓊脂糖接枝后連接緊密，表現(xiàn)為十分穩(wěn)定的分子。并且在60 h內(nèi)沒(méi)有觀察到溶液的變化，即沒(méi)有羅丹明B的出現(xiàn)。于是制備熒光接枝穩(wěn)定性的微球具有很大必要性，熒光穩(wěn)定的微球在今后的研究中將具有更廣泛的應(yīng)用。

圖7 熒光微球與單純包埋羅丹明B的瓊脂糖微球的熒光接枝穩(wěn)定性Fig. 7 The time stability of fluorescent microparticles and simple RB embedded microparticles

3 結(jié)語(yǔ)

羅丹明修飾的瓊脂糖可以通過(guò)環(huán)氧氯丙烷活化的方法實(shí)現(xiàn)。這個(gè)獨(dú)特并且高效的方法可以將羅丹明B接枝到瓊脂糖上，形成一種新的化合物。由于羅丹明B基團(tuán)的存在，修飾后的瓊脂糖具有了熒光特性，其熒光特性與羅丹明B基本相同。采用修飾后瓊脂糖制備熒光微球，通過(guò)水水乳化法，可以使熒光特性得到長(zhǎng)時(shí)間的保存。熒光微球在細(xì)胞標(biāo)記，生物大分子標(biāo)記中應(yīng)用廣泛。這種熒光微球可以應(yīng)用于生物分子的標(biāo)記與分析，或者作為示蹤物，具有熒光強(qiáng)度高、光譜性質(zhì)穩(wěn)定等特性。