基于梯度馴化法篩選適宜辣木發(fā)酵的酵母菌

楊昆，潘新杰,2，陶亮，黃艾祥*

1(云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，云南 昆明，650201)2(濰坊工程職業(yè)學院，山東 濰坊，262500)

辣木(MoringaoleiferaLam.)又名鼓槌樹、山葵樹，屬多年生熱帶落葉喬木，起源于印度和巴基斯坦，現(xiàn)廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國廣東、云南、廣西、海南等地均有引種[1]。辣木營養(yǎng)豐富，每100 g辣木葉中富含的維生素C為鮮橘的7倍、維生素A為胡蘿卜的4倍、蛋白質(zhì)為奶粉的2倍、鈣為奶粉的4倍、鐵為波菜的3倍、鉀為香蕉的3倍[2]。然而，在辣木中存在過敏原、生物堿[3]、草酸、皂角苷、辣木素等不利于人體消化吸收的物質(zhì)[4]及一些不利于微生物生長的抑菌物質(zhì)。蘇科巧[5]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵的辣木中存在抑制乳酸菌生長的物質(zhì)，并通過乳酸菌馴化達到了預期目的。另外，IJAROTIMI等[6]和郭志鵬等[7]也發(fā)現(xiàn)，通過發(fā)酵辣木種子可提高辣木粉中的必需氨基酸、脂肪酸、酸溶蛋白等含量。因此，采用生物發(fā)酵法降解粗蛋白、草酸是提高辣木營養(yǎng)物質(zhì)利用率及生物學價值的有效途徑。

酵母菌是一群以芽殖為主的單細胞真核微生物，其結(jié)構(gòu)簡單，屬于真菌類。酵母菌生長的最適溫度為25～37 ℃，最適pH值為4.5～5.0[8]。酵母菌的研究及其產(chǎn)品的開發(fā)在國外已有很多報道[9-10]，吳超等[11]在不同發(fā)酵條件下用酵母菌發(fā)酵魚粉，發(fā)現(xiàn)粗蛋白和酸溶蛋白的含量顯著提高。馮昕煒等[12]以葡萄渣為主要底物接種釀酒酵母和飼料酵母進行發(fā)酵，配比為2∶1，發(fā)酵時間30 h，結(jié)果表明葡萄渣經(jīng)酵母菌發(fā)酵后，營養(yǎng)成分大幅度增加，纖維含量下降。

因此，本實驗利用4株酵母菌對辣木液進行發(fā)酵，研究酵母菌在辣木液中的生長情況及對辣木中的蛋白質(zhì)、草酸的降解作用，篩選降解辣木能力強的菌種，從而提高其利用率，為促進辣木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

辣木干粉：300目辣木粉，購于昆明七彩云花生物科技有限公司。

根據(jù)酵母菌的不同種屬及發(fā)酵特性，初選了4株酵母菌：釀酒酵母CICC 1203(釀酒酵母1)、釀酒酵母CICC 1202(釀酒酵母2)、產(chǎn)朊假絲酵母CICC 31188、熱帶假絲酵母CICC 1253，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

MRS培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、亞甲基藍均為分析純，購于北京陸橋；三氯乙酸、草酸、濃硫酸、考馬斯亮藍R250、水合茚三酮、鄰苯二甲酸氫鉀、丙烯酰胺、甘氨酸、標準蛋白質(zhì)Marker均為分析純，購于Sigma公司。

1.2 儀器與設備

KDY-9810凱氏定氮儀，北京市通潤源機電技術(shù)有限責任公司；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；Agilent1100高效液相色譜儀、Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，安捷倫科技有限公司；HI99161 pH計，意大利哈納；121型氨基酸自動分析儀，Beckman。

1.3 實驗方法

1.3.1 辣木葉發(fā)酵液對酵母菌的影響分析

將準確稱量的300目辣木粉與蒸餾水按1∶15的質(zhì)量比混合均勻，經(jīng)膠體磨、均質(zhì)機均質(zhì)制成辣木液，分裝5組各200 mL，經(jīng)巴氏殺菌后分別按照4%接種量接種2株釀酒酵母、1株產(chǎn)朊假絲酵母、1株熱帶假絲酵母進行發(fā)酵。

將活化好的4株酵母菌分別接種到辣木液與麥芽汁體積比為0∶10、5∶5、10∶0的生長環(huán)境中，初步探究未馴化酵母菌在辣木液中的生長情況，為下一步進行酵母菌馴化提供參考。

1.3.2 菌種的馴化

為了提高酵母菌對辣木環(huán)境的適應，本實驗采用了酵母菌的梯度馴化法[13]。將活化好的4株酵母菌分別接種到5°Bé麥芽汁與辣木粉液體積比為10∶0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后以此發(fā)酵液作為菌種接種到5°Bé麥芽汁與辣木液體積比為8∶2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以此方法逐漸增大辣木液的比例，依次完成5 °Bé麥芽汁與辣木液體積比為10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、0∶10的移種馴化。每個梯度馴化時均以下面3個指標進行測定：(1)酵母菌活菌的測定：參照GB 47892—2010；(2)產(chǎn)酸能力的測定：pH值的測定[14]；(3)糖度檢測：將發(fā)酵完成的辣木發(fā)酵液用孔徑為80～120 μm的濾紙過濾，然后用手持糖度儀進行檢測，對照組為未發(fā)酵的辣木液。

1.3.3 酵母菌對辣木的降解情況分析

為了從4株酵母菌中篩選出對辣木液降解能力強的菌株，選擇可溶性蛋白、蛋白降解率、總游離氨基酸、蛋白質(zhì)電泳條帶、草酸的變化為指標進行檢測。

(1)可溶性蛋白含量的測定

樣品可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍比色法。以標準蛋白質(zhì)質(zhì)量(μg)為橫坐標(X)，吸光值為縱坐標(Y)，獲得標準曲線方程為Y=0.003 7X+0.012 3(R2=0.997 2)。取辣木發(fā)酵液6.5 mL至20 mL具塞試管中，70 ℃水浴20 min，再用中速定性濾紙過濾濾液合并至50 mL容量瓶中，并定容至50 mL。取濾液1 mL至15 mL試管中，加入4 mL考馬斯亮藍染液，搖勻，室溫放置3 min，在分光光度計上595 nm處比色。

(2)蛋白質(zhì)降解率的測定[15]

取混勻的辣木發(fā)酵液10 mL于20 mL離心管中，加入等量的10%三氯乙酸溶液終止其反應，室溫下沉降蛋白5 min，然后經(jīng)6 000 r/min離心15 min，采用中速定性濾紙過濾上清液，取濾液在280 nm處測定吸光值。

(3)游離氨基酸總量的測定

游離氨基酸總量的測定采用茚三酮顯色法[16]。以谷氨酸含量為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，獲得標準曲線方程為Y=0.004 1X-0.019 4(R2=0.994 2)。取樣品6.5 mL 70 ℃水浴加熱提取15 min，冷卻后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中定容。用試管取樣液1 mL，各加1 mL水合茚三銅溶液，保鮮膜封口，在80 ℃水浴中加熱15 min，取出用檸檬酸緩沖液稀釋至10 mL，分光光度計比色(620 nm、l cm光徑的比色皿)。讀出吸光度(A)查標準曲線，求出氨基酸總量。

(4)SDS-PAGE蛋白電泳條帶的變化分析

本實驗采用巴氏殺菌法(65 ℃，30 min)對辣木液進行滅菌并采用SDS-PAGE技術(shù)分析酵母菌發(fā)酵對辣木蛋白的影響，蛋白提取及電泳操作步驟具體如下：

4株酵母菌發(fā)酵液→4 000 r/min，15 min離心→濃縮(55 ℃ 200 mL濃縮至40 mL)→蛋白沉降V(樣品)∶V(冰丙酮)=1∶2.5→10 000 r/min, 20 min→去液留沉→蒸干丙酮→蛋白溶解(2 mL tris-HCl 6.8溶解)→混勻→取1.5 mL樣液到2 mL離心管中→放入4 ℃冰箱中備用。

SDS-PAGE:參照陶亮[15]的研究方法，配制5×電泳緩沖液、制備電泳樣和分離膠。

電泳：濃縮膠電泳條件：50 V恒壓約30 min；分離膠電泳條件：120 V恒壓約1 h，溴酚藍跑至凝膠底部，關(guān)閉電源。依次對電泳膠片進行30%甲醇固定、考馬斯亮藍染色、自來水脫色、拍照分析。根據(jù)SDS-PAGE檢測條帶數(shù)量和強弱，分析蛋白的降解情況。

(5)草酸降解情況分析

本實驗采用HPLC法測定辣木發(fā)酵液中的草酸含量。

色譜條件：Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)流動相為0.2%磷酸水溶液甲醇[V(甲醇)∶V(磷酸水溶液)=2∶98]，流速為0.4 mL/min，檢測波長為197 nm，柱溫25 ℃。

樣品的制備與處理：準確稱取辣木粉5份(編號0、1、2、3、4，m=6.670 0 mg)，分別加100 mL純凈水溶解，并制備發(fā)酵液。從5組樣品中分別用移液管準確量取30 mL的混合液，然后分別量取0.5 mL 的濃HCl，加入30 mL的樣品中，在50 ℃水浴鍋中加熱30 min，中間搖動幾次，冷卻后放入高速勻漿機離心2次，將提取液過濾，吸取過濾液過微孔濾膜(0.45 μm)，收集1 mL濾液至HPLC檢測瓶中。根據(jù)色譜峰與標準品的峰面積比較，最終計算出草酸含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每個處理重復3次，所有試驗均進行3次平行實驗，并運用繪圖軟件Origin 2018作圖，對測定的數(shù)據(jù)進行顯著性比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌對辣木的適應情況

由表1可知，在未添加辣木液的麥芽汁環(huán)境中，4株酵母菌的長勢較好，均達到了≥1×108CFU/mL，其中，釀酒酵母1和熱帶假絲酵母的活菌數(shù)相對較高。當?shù)攘刻砑永蹦疽号c麥芽汁作為培養(yǎng)基時，4株酵母菌的活菌數(shù)均在一定程度上降低。當100%辣木液作為培養(yǎng)基時，4株酵母菌的活菌數(shù)進一步降低，但產(chǎn)朊假絲酵母和熱帶假絲酵母的活菌數(shù)較高，2株釀酒酵母相對較差?？赡苁且驗榻湍妇贿m應辣木液的生長環(huán)境造成的。為保證酵母菌的生長增殖，還需對酵母菌進一步馴化。

表1 適應辣木生長環(huán)境的酵母菌活菌數(shù) 單位：CFU/mL

2.2 酵母菌的馴化

2.2.1 馴化對酵母菌活菌數(shù)的影響

由表2可知，隨著辣木液占比增加，4株酵母菌的總體生長呈先降低后逐漸增長的趨勢。辣木液與麥芽汁的體積比在0∶10時，4株酵母菌的生長均處于頂峰。隨著辣木液配比增加，直到體積比為4∶6和6∶4時，酵母菌的生長達到最低，其中產(chǎn)朊假絲酵母和熱帶假絲酵母的生長略好，達到106CFU/mL。繼續(xù)增大辣木液比例至10∶0時，4株酵母菌的長勢均≥4×106CFU/mL，與未馴化的酵母菌相比均有較大的提高。推測可能是因為隨著梯度馴化的進行，酵母菌對辣木液環(huán)境逐步適應，所以酵母菌的活菌數(shù)均>4×106CFU/mL。

表2 酵母菌梯度馴化活菌數(shù)Table 2 The living yeast number of gradient domestication

2.2.2 產(chǎn)酸能力的變化

由圖1可知，酵母菌的發(fā)酵對不同梯度比的培養(yǎng)基均有一定的降解作用。隨著辣木液占比增加，酵母菌的產(chǎn)酸能力呈現(xiàn)一個上升的趨勢。4株酵母菌在體積比0∶10時的產(chǎn)酸能力為產(chǎn)朊假絲酵母>釀酒酵母1>熱帶假絲酵母>釀酒酵母2，但隨著辣木液含量的增加，在體積比10∶0時產(chǎn)酸能力為熱帶假絲酵母>釀酒酵母1>釀酒酵母2>產(chǎn)朊假絲酵母，產(chǎn)朊假絲酵母由4株酵母菌中產(chǎn)酸能力最強轉(zhuǎn)變到產(chǎn)酸能力最弱，說明產(chǎn)朊假絲酵母不適宜進行辣木發(fā)酵，而熱帶假絲酵母從體積比4∶6開始逐漸適應辣木的環(huán)境，表現(xiàn)出產(chǎn)酸能力相對較強的現(xiàn)狀。

圖1 馴化過程中pH值的變化Fig.1 Changes of pH value in domesticated group

2.2.3 糖度的影響

由圖2可知，4株酵母菌降低糖度的效果大體一致。在體積比0∶10時降低糖度的能力為產(chǎn)朊假絲酵母>釀酒酵母1>熱帶假絲酵母>釀酒酵母2。在體積比10∶0時降低糖度的能力為熱帶假絲酵母>產(chǎn)朊假絲酵母>釀酒酵母1>釀酒酵母2。隨著辣木液含量的增多，4株酵母菌糖度不同程度的降低，且熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母更有利于辣木中糖度的降解?？赡苁且驗槔蹦局械奶遣蛔阋詽M足辣木的生長，所以導致不同梯度比的培養(yǎng)基中的糖度都降低。

圖2 馴化過程中糖度值的變化Fig.2 Changes of sugar degree value in domesticated group

綜上，用增大麥芽汁中辣木液含量比例的方法馴化菌種對酵母菌的生長、產(chǎn)酸及糖度的降解產(chǎn)生了影響，使得原本不適應辣木液環(huán)境的菌種逐漸適應，產(chǎn)酸效果較好。

2.3 酵母菌對辣木液的降解情況

2.3.1 可溶性蛋白的含量

由圖3可知，未發(fā)酵的辣木液中的可溶性蛋白含量在34.51 mg/mL左右，經(jīng)4株酵母菌發(fā)酵的辣木液，其可溶性蛋白的含量均有增加，大體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。1～3 d 4株酵母菌均呈上升趨勢，其中熱帶假絲酵母在第3天時產(chǎn)生的可溶性蛋白最多，為64.41 mg/mL，說明此階段熱帶假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白的能力最強。3 d以后，4株可溶性蛋白的含量均有下降的趨勢，說明酵母菌溶出蛋白的能力降低或者自身代謝所需的氮源含量增多。SOHAIB等[17]為了改善辣木食品的營養(yǎng)特性，用短小芽孢桿菌CICC 10440發(fā)酵辣木葉粉，24 h后發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白含量達到最大值。這與本研究結(jié)論相似，表明微生物發(fā)酵可以提高辣木中可溶性蛋白的含量。

圖3 酵母菌對可溶性蛋白的降解情況Fig.3 The degradation of soluble protein for yeast

2.3.2 蛋白質(zhì)的降解率

由圖4可知，4株酵母菌的降解率均大于未處理的辣木液，說明酵母菌對辣木液有不同程度的降解。隨著發(fā)酵時間的延長，各株酵母菌發(fā)酵的辣木液降解率大致呈現(xiàn)逐步升高再降低的趨勢。發(fā)酵3 d時，酵母菌對辣木液的降解作用達到了頂端，降解作用大小順序為熱帶假絲酵母>產(chǎn)朊假絲酵母>釀酒酵母1>釀酒酵母2>空白對照，而釀酒酵母2有降低的趨勢。當發(fā)酵3 d后，吸光值呈現(xiàn)下降趨勢，可能是因為大部分辣木的營養(yǎng)成分及降解的小分子如單糖、氨基酸等作為酵母菌的生長因子而被利用。

圖4 酵母菌對蛋白的降解率Fig.4 The protein degradation for yeast

2.3.3 總游離氨基酸含量

由圖5可知，隨著酵母菌的生長，4種酵母菌一般在第3天時氨基酸的含量達到最大，熱帶假絲酵母的氨基酸含量達到398.732 mg/100g；在第7天時氨基酸含量最小，釀酒酵母1的氨基酸含量最低，為105.171 mg/100g。張云娟等[18]的研究表明，不同發(fā)酵時間對辣木葉中游離氨基酸總量的影響是顯著的，發(fā)酵前辣木葉中游離氨基酸總量僅為22.28%，之后一直顯著増加(P<0.05)，發(fā)酵12 d時，其含量增加到34.27%，之后増加趨于平緩。由此可知，不同發(fā)酵時間，酵母菌對游離氨基酸的降解情況是不一樣的，其中最適酵母菌發(fā)酵辣木液的時間為3 d左右。

圖5 酵母菌對游離氨基酸的降解情況Fig.5 The degradation of yeast on free amino acid

2.3.4 蛋白質(zhì)的降解情況

由圖6可知，對比未發(fā)酵的辣木液，采用4株酵母菌發(fā)酵的辣木液蛋白電泳條帶均有不同程度的減弱甚至消失，說明酵母菌發(fā)酵對辣木蛋白產(chǎn)生了較好的降解作用。辣木葉中的蛋白種類多，而主要蛋白分子質(zhì)量集中在70、20、10 kDa及以下。釀酒酵母1和釀酒酵母2的光密度在4株酵母菌中最大，但較未發(fā)酵的有所降低，38 kDa附近的蛋白條帶完全消失，20 kDa附近的蛋白條帶均變淺。產(chǎn)朊假絲酵母的光密度次之，70 kDa附近的2條蛋白條帶變淺，38 kDa附近的蛋白條帶完全消失，<15 kDa的蛋白條帶顏色變深，說明產(chǎn)朊假絲酵母將大分子蛋白降解成了小分子的蛋白。熱帶假絲酵母的光密度最小，所有蛋白條帶顏色均變淺，且20～70 kDa的蛋白條帶幾乎全部消失，<10 kDa的蛋白條帶最少，說明熱帶假絲酵母的降解能力較強，可以將大分子蛋白降解成小肽和氨基酸。有研究表明，辣木籽經(jīng)益生菌發(fā)酵后，能夠顯著增加維生素、氨基酸、小肽等營養(yǎng)物質(zhì)的含量，降解抗營養(yǎng)因子[19-20]，提高發(fā)酵物的營養(yǎng)價值和口感風味[21-23]，這與本研究結(jié)論相似。

2.3.5 草酸含量的降解情況

由圖7可知，空白組的峰面積為1 037.60 mAU·s，4株酵母菌的峰面積依次為431.78、24.53、313.32、310.37 mAU·s，得出空白組草酸含量5.34 mg/g，發(fā)酵組2.25、1.97、1.64、1.62 mg/g。根據(jù)數(shù)據(jù)可知，酵母菌發(fā)酵可以明顯降低草酸的含量且熱帶假絲酵母降解草酸的能力最強，降解率達70%左右，降解能力依次為熱帶假絲酵母>產(chǎn)朊假絲酵母>釀酒酵母菌2>釀酒酵母菌1>空白組。李凌飛等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌對辣木粉中的草酸有很好的降解效果，可運用于降低辣木粉中的草酸含量，進而降低食用辣木而引發(fā)的結(jié)石風險。因此，可以利用熱帶假絲酵母發(fā)酵辣木，從而最大程度的提高人們對辣木營養(yǎng)成分的消化吸收。

1-蛋白標樣(10～170 kDa)；2～6-未發(fā)酵辣木液、釀酒酵母菌1發(fā)酵辣木液、釀酒酵母菌2發(fā)酵辣木液、產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵辣木液、熱帶假絲酵母辣木發(fā)酵液圖6 酵母菌發(fā)酵辣木的蛋白電泳圖Fig.6 Protein electrophoresis of Moringa fermented liquid for yeast

A～E-空白組、釀酒酵母菌1、釀酒酵母菌2、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母4株不同菌種的發(fā)酵液在7.421 min時檢測的峰值圖7 四株酵母菌對草酸的降解情況Fig.7 The degradation of oxalic acid for the four strains of yeast

3 討論與結(jié)論

本實驗利用酵母菌對辣木進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)若將不同的酵母菌直接接種到辣木液中進行發(fā)酵，則酵母菌活菌數(shù)會大幅度下降，究其原因是辣木中含有4-(a-2-鼠李糖基氧)-苯異硫氛酸鹽等抑菌成分，不利于酵母菌的生長。蘇科巧[5]的研究證明對菌株進行馴化會提高菌株的適應能力。于是對4株酵母菌進行馴化，發(fā)現(xiàn)熱帶假絲酵母菌在辣木液環(huán)境中適應能力優(yōu)于其他3株酵母菌，且發(fā)酵液中的可溶性蛋白、氨基酸含量都有顯著增加，另外，發(fā)酵第3天時，熱帶假絲酵母菌對草酸或草酸鹽的降解能力最強，可以降解70%以上的草酸。王欣宇[25]的研究表明，利用微生物發(fā)酵技術(shù)可以將原料中所含的多種難以吸收的營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過降解或合成，產(chǎn)生利于消化、吸收的高營養(yǎng)物質(zhì)成分。徐丹等[26]對桑葉進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵桑葉的營養(yǎng)價值、蛋白含量都得到了提高。王憲波[27]利用酵母對辣木進行發(fā)酵，得到辣木基料。當然，發(fā)酵不僅僅局限于酵母菌，目前還有利用細菌和霉菌對底物進行發(fā)酵的，如王田田等[28]、石鴻輝等[29]、JOUNG等[30]的研究。然而，能夠降解辣木中草酸含量的菌種，目前報道的只有酵母菌。

通過對4株酵母菌進行馴化，使其適應辣木液環(huán)境，發(fā)現(xiàn)熱帶假絲酵母菌對辣木中蛋白質(zhì)、草酸的降解效果均優(yōu)于其他酵母菌，可以降解70%以上的草酸，減輕辣木的苦辣味、改善口感，顯著提高辣木營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，有利于促進辣木產(chǎn)業(yè)發(fā)展。