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    基于梯度馴化法篩選適宜辣木發(fā)酵的酵母菌

    2021-10-09 01:34:16楊昆潘新杰陶亮黃艾祥
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年18期
    關(guān)鍵詞:辣木假絲草酸

    楊昆,潘新杰,2,陶亮,黃艾祥*

    1(云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院,云南 昆明,650201)2(濰坊工程職業(yè)學院,山東 濰坊,262500)

    辣木(MoringaoleiferaLam.)又名鼓槌樹、山葵樹,屬多年生熱帶落葉喬木,起源于印度和巴基斯坦,現(xiàn)廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū),在我國廣東、云南、廣西、海南等地均有引種[1]。辣木營養(yǎng)豐富,每100 g辣木葉中富含的維生素C為鮮橘的7倍、維生素A為胡蘿卜的4倍、蛋白質(zhì)為奶粉的2倍、鈣為奶粉的4倍、鐵為波菜的3倍、鉀為香蕉的3倍[2]。然而,在辣木中存在過敏原、生物堿[3]、草酸、皂角苷、辣木素等不利于人體消化吸收的物質(zhì)[4]及一些不利于微生物生長的抑菌物質(zhì)。蘇科巧[5]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌發(fā)酵的辣木中存在抑制乳酸菌生長的物質(zhì),并通過乳酸菌馴化達到了預期目的。另外,IJAROTIMI等[6]和郭志鵬等[7]也發(fā)現(xiàn),通過發(fā)酵辣木種子可提高辣木粉中的必需氨基酸、脂肪酸、酸溶蛋白等含量。因此,采用生物發(fā)酵法降解粗蛋白、草酸是提高辣木營養(yǎng)物質(zhì)利用率及生物學價值的有效途徑。

    酵母菌是一群以芽殖為主的單細胞真核微生物,其結(jié)構(gòu)簡單,屬于真菌類。酵母菌生長的最適溫度為25~37 ℃,最適pH值為4.5~5.0[8]。酵母菌的研究及其產(chǎn)品的開發(fā)在國外已有很多報道[9-10],吳超等[11]在不同發(fā)酵條件下用酵母菌發(fā)酵魚粉,發(fā)現(xiàn)粗蛋白和酸溶蛋白的含量顯著提高。馮昕煒等[12]以葡萄渣為主要底物接種釀酒酵母和飼料酵母進行發(fā)酵,配比為2∶1,發(fā)酵時間30 h,結(jié)果表明葡萄渣經(jīng)酵母菌發(fā)酵后,營養(yǎng)成分大幅度增加,纖維含量下降。

    因此,本實驗利用4株酵母菌對辣木液進行發(fā)酵,研究酵母菌在辣木液中的生長情況及對辣木中的蛋白質(zhì)、草酸的降解作用,篩選降解辣木能力強的菌種,從而提高其利用率,為促進辣木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 實驗材料

    辣木干粉:300目辣木粉,購于昆明七彩云花生物科技有限公司。

    根據(jù)酵母菌的不同種屬及發(fā)酵特性,初選了4株酵母菌:釀酒酵母CICC 1203(釀酒酵母1)、釀酒酵母CICC 1202(釀酒酵母2)、產(chǎn)朊假絲酵母CICC 31188、熱帶假絲酵母CICC 1253,購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

    1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

    MRS培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、亞甲基藍均為分析純,購于北京陸橋;三氯乙酸、草酸、濃硫酸、考馬斯亮藍R250、水合茚三酮、鄰苯二甲酸氫鉀、丙烯酰胺、甘氨酸、標準蛋白質(zhì)Marker均為分析純,購于Sigma公司。

    1.2 儀器與設備

    KDY-9810凱氏定氮儀,北京市通潤源機電技術(shù)有限責任公司;DYY-6C電泳儀,北京六一儀器廠;Agilent1100高效液相色譜儀、Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),安捷倫科技有限公司;HI99161 pH計,意大利哈納;121型氨基酸自動分析儀,Beckman。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 辣木葉發(fā)酵液對酵母菌的影響分析

    將準確稱量的300目辣木粉與蒸餾水按1∶15的質(zhì)量比混合均勻,經(jīng)膠體磨、均質(zhì)機均質(zhì)制成辣木液,分裝5組各200 mL,經(jīng)巴氏殺菌后分別按照4%接種量接種2株釀酒酵母、1株產(chǎn)朊假絲酵母、1株熱帶假絲酵母進行發(fā)酵。

    將活化好的4株酵母菌分別接種到辣木液與麥芽汁體積比為0∶10、5∶5、10∶0的生長環(huán)境中,初步探究未馴化酵母菌在辣木液中的生長情況,為下一步進行酵母菌馴化提供參考。

    1.3.2 菌種的馴化

    為了提高酵母菌對辣木環(huán)境的適應,本實驗采用了酵母菌的梯度馴化法[13]。將活化好的4株酵母菌分別接種到5°Bé麥芽汁與辣木粉液體積比為10∶0的培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后以此發(fā)酵液作為菌種接種到5°Bé麥芽汁與辣木液體積比為8∶2的培養(yǎng)基中培養(yǎng),以此方法逐漸增大辣木液的比例,依次完成5 °Bé麥芽汁與辣木液體積比為10∶0、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、0∶10的移種馴化。每個梯度馴化時均以下面3個指標進行測定:(1)酵母菌活菌的測定:參照GB 47892—2010;(2)產(chǎn)酸能力的測定:pH值的測定[14];(3)糖度檢測:將發(fā)酵完成的辣木發(fā)酵液用孔徑為80~120 μm的濾紙過濾,然后用手持糖度儀進行檢測,對照組為未發(fā)酵的辣木液。

    1.3.3 酵母菌對辣木的降解情況分析

    為了從4株酵母菌中篩選出對辣木液降解能力強的菌株,選擇可溶性蛋白、蛋白降解率、總游離氨基酸、蛋白質(zhì)電泳條帶、草酸的變化為指標進行檢測。

    (1)可溶性蛋白含量的測定

    樣品可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍比色法。以標準蛋白質(zhì)質(zhì)量(μg)為橫坐標(X),吸光值為縱坐標(Y),獲得標準曲線方程為Y=0.003 7X+0.012 3(R2=0.997 2)。取辣木發(fā)酵液6.5 mL至20 mL具塞試管中,70 ℃水浴20 min,再用中速定性濾紙過濾濾液合并至50 mL容量瓶中,并定容至50 mL。取濾液1 mL至15 mL試管中,加入4 mL考馬斯亮藍染液,搖勻,室溫放置3 min,在分光光度計上595 nm處比色。

    (2)蛋白質(zhì)降解率的測定[15]

    取混勻的辣木發(fā)酵液10 mL于20 mL離心管中,加入等量的10%三氯乙酸溶液終止其反應,室溫下沉降蛋白5 min,然后經(jīng)6 000 r/min離心15 min,采用中速定性濾紙過濾上清液,取濾液在280 nm處測定吸光值。

    (3)游離氨基酸總量的測定

    游離氨基酸總量的測定采用茚三酮顯色法[16]。以谷氨酸含量為橫坐標(X),吸光度為縱坐標(Y),獲得標準曲線方程為Y=0.004 1X-0.019 4(R2=0.994 2)。取樣品6.5 mL 70 ℃水浴加熱提取15 min,冷卻后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中定容。用試管取樣液1 mL,各加1 mL水合茚三銅溶液,保鮮膜封口,在80 ℃水浴中加熱15 min,取出用檸檬酸緩沖液稀釋至10 mL,分光光度計比色(620 nm、l cm光徑的比色皿)。讀出吸光度(A)查標準曲線,求出氨基酸總量。

    (4)SDS-PAGE蛋白電泳條帶的變化分析

    本實驗采用巴氏殺菌法(65 ℃,30 min)對辣木液進行滅菌并采用SDS-PAGE技術(shù)分析酵母菌發(fā)酵對辣木蛋白的影響,蛋白提取及電泳操作步驟具體如下:

    4株酵母菌發(fā)酵液→4 000 r/min,15 min離心→濃縮(55 ℃ 200 mL濃縮至40 mL)→蛋白沉降V(樣品)∶V(冰丙酮)=1∶2.5→10 000 r/min, 20 min→去液留沉→蒸干丙酮→蛋白溶解(2 mL tris-HCl 6.8溶解)→混勻→取1.5 mL樣液到2 mL離心管中→放入4 ℃冰箱中備用。

    SDS-PAGE:參照陶亮[15]的研究方法,配制5×電泳緩沖液、制備電泳樣和分離膠。

    電泳:濃縮膠電泳條件:50 V恒壓約30 min;分離膠電泳條件:120 V恒壓約1 h,溴酚藍跑至凝膠底部,關(guān)閉電源。依次對電泳膠片進行30%甲醇固定、考馬斯亮藍染色、自來水脫色、拍照分析。根據(jù)SDS-PAGE檢測條帶數(shù)量和強弱,分析蛋白的降解情況。

    (5)草酸降解情況分析

    本實驗采用HPLC法測定辣木發(fā)酵液中的草酸含量。

    色譜條件:Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)流動相為0.2%磷酸水溶液甲醇[V(甲醇)∶V(磷酸水溶液)=2∶98],流速為0.4 mL/min,檢測波長為197 nm,柱溫25 ℃。

    樣品的制備與處理:準確稱取辣木粉5份(編號0、1、2、3、4,m=6.670 0 mg),分別加100 mL純凈水溶解,并制備發(fā)酵液。從5組樣品中分別用移液管準確量取30 mL的混合液,然后分別量取0.5 mL 的濃HCl,加入30 mL的樣品中,在50 ℃水浴鍋中加熱30 min,中間搖動幾次,冷卻后放入高速勻漿機離心2次,將提取液過濾,吸取過濾液過微孔濾膜(0.45 μm),收集1 mL濾液至HPLC檢測瓶中。根據(jù)色譜峰與標準品的峰面積比較,最終計算出草酸含量。

    1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

    每個處理重復3次,所有試驗均進行3次平行實驗,并運用繪圖軟件Origin 2018作圖,對測定的數(shù)據(jù)進行顯著性比較分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酵母菌對辣木的適應情況

    由表1可知,在未添加辣木液的麥芽汁環(huán)境中,4株酵母菌的長勢較好,均達到了≥1×108CFU/mL,其中,釀酒酵母1和熱帶假絲酵母的活菌數(shù)相對較高。當?shù)攘刻砑永蹦疽号c麥芽汁作為培養(yǎng)基時,4株酵母菌的活菌數(shù)均在一定程度上降低。當100%辣木液作為培養(yǎng)基時,4株酵母菌的活菌數(shù)進一步降低,但產(chǎn)朊假絲酵母和熱帶假絲酵母的活菌數(shù)較高,2株釀酒酵母相對較差??赡苁且驗榻湍妇贿m應辣木液的生長環(huán)境造成的。為保證酵母菌的生長增殖,還需對酵母菌進一步馴化。

    表1 適應辣木生長環(huán)境的酵母菌活菌數(shù) 單位:CFU/mL

    2.2 酵母菌的馴化

    2.2.1 馴化對酵母菌活菌數(shù)的影響

    由表2可知,隨著辣木液占比增加,4株酵母菌的總體生長呈先降低后逐漸增長的趨勢。辣木液與麥芽汁的體積比在0∶10時,4株酵母菌的生長均處于頂峰。隨著辣木液配比增加,直到體積比為4∶6和6∶4時,酵母菌的生長達到最低,其中產(chǎn)朊假絲酵母和熱帶假絲酵母的生長略好,達到106CFU/mL。繼續(xù)增大辣木液比例至10∶0時,4株酵母菌的長勢均≥4×106CFU/mL,與未馴化的酵母菌相比均有較大的提高。推測可能是因為隨著梯度馴化的進行,酵母菌對辣木液環(huán)境逐步適應,所以酵母菌的活菌數(shù)均>4×106CFU/mL。

    表2 酵母菌梯度馴化活菌數(shù)Table 2 The living yeast number of gradient domestication

    2.2.2 產(chǎn)酸能力的變化

    由圖1可知,酵母菌的發(fā)酵對不同梯度比的培養(yǎng)基均有一定的降解作用。隨著辣木液占比增加,酵母菌的產(chǎn)酸能力呈現(xiàn)一個上升的趨勢。4株酵母菌在體積比0∶10時的產(chǎn)酸能力為產(chǎn)朊假絲酵母>釀酒酵母1>熱帶假絲酵母>釀酒酵母2,但隨著辣木液含量的增加,在體積比10∶0時產(chǎn)酸能力為熱帶假絲酵母>釀酒酵母1>釀酒酵母2>產(chǎn)朊假絲酵母,產(chǎn)朊假絲酵母由4株酵母菌中產(chǎn)酸能力最強轉(zhuǎn)變到產(chǎn)酸能力最弱,說明產(chǎn)朊假絲酵母不適宜進行辣木發(fā)酵,而熱帶假絲酵母從體積比4∶6開始逐漸適應辣木的環(huán)境,表現(xiàn)出產(chǎn)酸能力相對較強的現(xiàn)狀。

    圖1 馴化過程中pH值的變化Fig.1 Changes of pH value in domesticated group

    2.2.3 糖度的影響

    由圖2可知,4株酵母菌降低糖度的效果大體一致。在體積比0∶10時降低糖度的能力為產(chǎn)朊假絲酵母>釀酒酵母1>熱帶假絲酵母>釀酒酵母2。在體積比10∶0時降低糖度的能力為熱帶假絲酵母>產(chǎn)朊假絲酵母>釀酒酵母1>釀酒酵母2。隨著辣木液含量的增多,4株酵母菌糖度不同程度的降低,且熱帶假絲酵母和產(chǎn)朊假絲酵母更有利于辣木中糖度的降解??赡苁且驗槔蹦局械奶遣蛔阋詽M足辣木的生長,所以導致不同梯度比的培養(yǎng)基中的糖度都降低。

    圖2 馴化過程中糖度值的變化Fig.2 Changes of sugar degree value in domesticated group

    綜上,用增大麥芽汁中辣木液含量比例的方法馴化菌種對酵母菌的生長、產(chǎn)酸及糖度的降解產(chǎn)生了影響,使得原本不適應辣木液環(huán)境的菌種逐漸適應,產(chǎn)酸效果較好。

    2.3 酵母菌對辣木液的降解情況

    2.3.1 可溶性蛋白的含量

    由圖3可知,未發(fā)酵的辣木液中的可溶性蛋白含量在34.51 mg/mL左右,經(jīng)4株酵母菌發(fā)酵的辣木液,其可溶性蛋白的含量均有增加,大體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。1~3 d 4株酵母菌均呈上升趨勢,其中熱帶假絲酵母在第3天時產(chǎn)生的可溶性蛋白最多,為64.41 mg/mL,說明此階段熱帶假絲酵母發(fā)酵產(chǎn)可溶性蛋白的能力最強。3 d以后,4株可溶性蛋白的含量均有下降的趨勢,說明酵母菌溶出蛋白的能力降低或者自身代謝所需的氮源含量增多。SOHAIB等[17]為了改善辣木食品的營養(yǎng)特性,用短小芽孢桿菌CICC 10440發(fā)酵辣木葉粉,24 h后發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白含量達到最大值。這與本研究結(jié)論相似,表明微生物發(fā)酵可以提高辣木中可溶性蛋白的含量。

    圖3 酵母菌對可溶性蛋白的降解情況Fig.3 The degradation of soluble protein for yeast

    2.3.2 蛋白質(zhì)的降解率

    由圖4可知,4株酵母菌的降解率均大于未處理的辣木液,說明酵母菌對辣木液有不同程度的降解。隨著發(fā)酵時間的延長,各株酵母菌發(fā)酵的辣木液降解率大致呈現(xiàn)逐步升高再降低的趨勢。發(fā)酵3 d時,酵母菌對辣木液的降解作用達到了頂端,降解作用大小順序為熱帶假絲酵母>產(chǎn)朊假絲酵母>釀酒酵母1>釀酒酵母2>空白對照,而釀酒酵母2有降低的趨勢。當發(fā)酵3 d后,吸光值呈現(xiàn)下降趨勢,可能是因為大部分辣木的營養(yǎng)成分及降解的小分子如單糖、氨基酸等作為酵母菌的生長因子而被利用。

    圖4 酵母菌對蛋白的降解率Fig.4 The protein degradation for yeast

    2.3.3 總游離氨基酸含量

    由圖5可知,隨著酵母菌的生長,4種酵母菌一般在第3天時氨基酸的含量達到最大,熱帶假絲酵母的氨基酸含量達到398.732 mg/100g;在第7天時氨基酸含量最小,釀酒酵母1的氨基酸含量最低,為105.171 mg/100g。張云娟等[18]的研究表明,不同發(fā)酵時間對辣木葉中游離氨基酸總量的影響是顯著的,發(fā)酵前辣木葉中游離氨基酸總量僅為22.28%,之后一直顯著増加(P<0.05),發(fā)酵12 d時,其含量增加到34.27%,之后増加趨于平緩。由此可知,不同發(fā)酵時間,酵母菌對游離氨基酸的降解情況是不一樣的,其中最適酵母菌發(fā)酵辣木液的時間為3 d左右。

    圖5 酵母菌對游離氨基酸的降解情況Fig.5 The degradation of yeast on free amino acid

    2.3.4 蛋白質(zhì)的降解情況

    由圖6可知,對比未發(fā)酵的辣木液,采用4株酵母菌發(fā)酵的辣木液蛋白電泳條帶均有不同程度的減弱甚至消失,說明酵母菌發(fā)酵對辣木蛋白產(chǎn)生了較好的降解作用。辣木葉中的蛋白種類多,而主要蛋白分子質(zhì)量集中在70、20、10 kDa及以下。釀酒酵母1和釀酒酵母2的光密度在4株酵母菌中最大,但較未發(fā)酵的有所降低,38 kDa附近的蛋白條帶完全消失,20 kDa附近的蛋白條帶均變淺。產(chǎn)朊假絲酵母的光密度次之,70 kDa附近的2條蛋白條帶變淺,38 kDa附近的蛋白條帶完全消失,<15 kDa的蛋白條帶顏色變深,說明產(chǎn)朊假絲酵母將大分子蛋白降解成了小分子的蛋白。熱帶假絲酵母的光密度最小,所有蛋白條帶顏色均變淺,且20~70 kDa的蛋白條帶幾乎全部消失,<10 kDa的蛋白條帶最少,說明熱帶假絲酵母的降解能力較強,可以將大分子蛋白降解成小肽和氨基酸。有研究表明,辣木籽經(jīng)益生菌發(fā)酵后,能夠顯著增加維生素、氨基酸、小肽等營養(yǎng)物質(zhì)的含量,降解抗營養(yǎng)因子[19-20],提高發(fā)酵物的營養(yǎng)價值和口感風味[21-23],這與本研究結(jié)論相似。

    2.3.5 草酸含量的降解情況

    由圖7可知,空白組的峰面積為1 037.60 mAU·s,4株酵母菌的峰面積依次為431.78、24.53、313.32、310.37 mAU·s,得出空白組草酸含量5.34 mg/g,發(fā)酵組2.25、1.97、1.64、1.62 mg/g。根據(jù)數(shù)據(jù)可知,酵母菌發(fā)酵可以明顯降低草酸的含量且熱帶假絲酵母降解草酸的能力最強,降解率達70%左右,降解能力依次為熱帶假絲酵母>產(chǎn)朊假絲酵母>釀酒酵母菌2>釀酒酵母菌1>空白組。李凌飛等[24]的研究發(fā)現(xiàn),酵母菌對辣木粉中的草酸有很好的降解效果,可運用于降低辣木粉中的草酸含量,進而降低食用辣木而引發(fā)的結(jié)石風險。因此,可以利用熱帶假絲酵母發(fā)酵辣木,從而最大程度的提高人們對辣木營養(yǎng)成分的消化吸收。

    1-蛋白標樣(10~170 kDa);2~6-未發(fā)酵辣木液、釀酒酵母菌1發(fā)酵辣木液、釀酒酵母菌2發(fā)酵辣木液、產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵辣木液、熱帶假絲酵母辣木發(fā)酵液圖6 酵母菌發(fā)酵辣木的蛋白電泳圖Fig.6 Protein electrophoresis of Moringa fermented liquid for yeast

    A~E-空白組、釀酒酵母菌1、釀酒酵母菌2、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母4株不同菌種的發(fā)酵液在7.421 min時檢測的峰值圖7 四株酵母菌對草酸的降解情況Fig.7 The degradation of oxalic acid for the four strains of yeast

    3 討論與結(jié)論

    本實驗利用酵母菌對辣木進行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)若將不同的酵母菌直接接種到辣木液中進行發(fā)酵,則酵母菌活菌數(shù)會大幅度下降,究其原因是辣木中含有4-(a-2-鼠李糖基氧)-苯異硫氛酸鹽等抑菌成分,不利于酵母菌的生長。蘇科巧[5]的研究證明對菌株進行馴化會提高菌株的適應能力。于是對4株酵母菌進行馴化,發(fā)現(xiàn)熱帶假絲酵母菌在辣木液環(huán)境中適應能力優(yōu)于其他3株酵母菌,且發(fā)酵液中的可溶性蛋白、氨基酸含量都有顯著增加,另外,發(fā)酵第3天時,熱帶假絲酵母菌對草酸或草酸鹽的降解能力最強,可以降解70%以上的草酸。王欣宇[25]的研究表明,利用微生物發(fā)酵技術(shù)可以將原料中所含的多種難以吸收的營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過降解或合成,產(chǎn)生利于消化、吸收的高營養(yǎng)物質(zhì)成分。徐丹等[26]對桑葉進行發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵桑葉的營養(yǎng)價值、蛋白含量都得到了提高。王憲波[27]利用酵母對辣木進行發(fā)酵,得到辣木基料。當然,發(fā)酵不僅僅局限于酵母菌,目前還有利用細菌和霉菌對底物進行發(fā)酵的,如王田田等[28]、石鴻輝等[29]、JOUNG等[30]的研究。然而,能夠降解辣木中草酸含量的菌種,目前報道的只有酵母菌。

    通過對4株酵母菌進行馴化,使其適應辣木液環(huán)境,發(fā)現(xiàn)熱帶假絲酵母菌對辣木中蛋白質(zhì)、草酸的降解效果均優(yōu)于其他酵母菌,可以降解70%以上的草酸,減輕辣木的苦辣味、改善口感,顯著提高辣木營養(yǎng)物質(zhì)的利用率,有利于促進辣木產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

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