紅茶菌和中草藥紅茶菌體外抑制沙門氏菌的比較研究

蔣小強(qiáng)，邱紅輝，符乃方，蔣盛軍* ，董志超，何際禪，闞 飆，閆梅英，梁未麗(.海南省東方市畜牧獸醫(yī)局，海南東方57600;.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州5777;.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，北京006)

紅茶菌發(fā)酵液一般是利用紅茶菌母液發(fā)酵茶葉、糖水溶液所發(fā)酵而成的生物活性菌液。由于紅茶菌中含有醋酸菌、酵母和乳酸菌等生物活性菌，再加上茶葉提取物的作用，紅茶菌發(fā)酵菌液一般對病原細(xì)菌都有較好的抑制作用。研究表明，紅茶菌發(fā)酵液對大腸桿菌(Eschrichia coli)、宋內(nèi)志賀氏菌(Shigella sonnei)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等病原細(xì)菌［1－3］，但是該制劑對酵母菌粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、產(chǎn)阮假絲酵母(Candida utilis)、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis(Fres.)Harrison)和霉菌黑根霉(Rhizopus nigricans)、黃曲霉(Aspergillus.flavus)無抑制作用［4］。

中草藥紅茶菌是在紅茶菌菌培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，利用紅茶菌中草提取液甘草、菊花、羅漢果、啤酒花等中草藥提取液所獲得新型紅茶菌制劑，因為含有大量中草藥提取液，所以新型紅茶菌制劑被命名為中草藥紅茶菌制劑［5］。研究表明，中草藥紅茶菌制劑對口蹄疫病毒在體外和體外都有殺滅或抑制作用，對易感動物噴霧中草紅茶菌可以有效預(yù)防口蹄疫的發(fā)生［6－7］。沙門氏菌是世界上造成食源性食物中毒最多的病原細(xì)菌。我國內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位。最近30年，由于人們生活水平的提高以及西餐的飲食方式的引進(jìn)，鮮食蔬菜以及海鮮等水產(chǎn)品越來越容易導(dǎo)致沙門氏菌的感染，因此如何預(yù)防沙門氏菌的感染成為我國日常流行性細(xì)菌疾病預(yù)防與控制的重要研究課題之一。沙門氏菌的最適培養(yǎng)pH為6.5～7.5，屬于喜歡偏中性以及弱堿性的病原菌。因此，能夠產(chǎn)生大量有機(jī)酸以及耐酸性強(qiáng)的益生菌都能有效抑制或拮抗沙門氏菌。紅茶菌包含自然界產(chǎn)酸性最強(qiáng)的醋酸菌，因此紅茶菌能夠有效抑制沙門氏菌［8－10］。為了研究紅茶菌和中草藥紅茶菌對沙門氏菌的抑菌特性，筆者以沙門氏標(biāo)準(zhǔn)菌和臨床分離沙門氏菌菌株為材料，研究紅茶菌和中草藥紅茶菌對沙門氏菌的抑菌效果，旨在為臨床上預(yù)防沙門氏菌的感染提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試中草藥紅茶菌制劑與菌種 紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑為實驗室自制［5－7］。鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株LT2(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)［11］以及 20 個沙門氏菌臨床分離株(Salmonella Typhi，編號分別為:4371、4373、42、1396、4369、1607、1449、4368、1220、1395、79、353、198、4367、1301、4374、1601、245、781、1430)。這些菌種都由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所腹瀉病室鑒定、保存和提供。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基為法國科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，購自鄭州博賽科技有限責(zé)任公司;MH肉湯、紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑均為實驗室自制［5－7］。紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑使用一次性微孔濾膜過濾器過濾滅菌。

1.2.2 主要儀器。微量加液器、電子天平、37℃培養(yǎng)箱、振蕩器。

1.3 方法

1.3.1 鼠傷寒沙門氏菌細(xì)菌培養(yǎng)。鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株LT2(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)［11］以及 20個沙門氏菌臨床分離株(Salmonella Typhi，編號分別為4371、4373、42、1396、4369、1607、1449、、4368，1220、1395、79、353、198、4367、1301、4374、1601、245、781、1430)分別接種到法國科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，然后挑單菌落接種到5 ml肉湯培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 致病菌懸液的制備。將肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)的鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株LT2(Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2)以及10個沙門氏菌臨床分離株(Salmonella Typhi，編號分別為 4367、79、13、4374、4371、1091、1220、1396、4369、4373)分別置于生理鹽水管中，充分混勻，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫?約1×108cfu/ml)和5.0麥?zhǔn)蠞岫?1×109cfu/ml)。

1.3.3 試管稀釋法測定微生態(tài)制劑對沙門氏菌的抑制濃度。每排放置6只2 ml的離心管，除每排第1支離心管外，每只離心管內(nèi)加已高壓滅菌的MH肉湯1 ml，每排的第1、2管分別加入2 ml受試物，依次對倍稀釋至第7管，此時試管內(nèi)紅茶菌制劑或中草藥紅茶菌制劑濃度依次為1∶1、1∶2、1∶4和1∶8，第6管作為測試菌生長質(zhì)控，然后每管加入3.6 μl 0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y試菌液，使用振蕩器混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12 h后，取出1環(huán)接種沙門氏顯色平板培養(yǎng)基，根據(jù)是否有病原菌生長來確定微生態(tài)制劑對測試菌的抑菌濃度.

1.3.4 共培養(yǎng)時間對紅茶菌和中草藥紅茶菌體外抑制沙門氏菌的影響。每排安排5只2 ml的離心管，每只離心管內(nèi)加1 ml紅茶菌原液、紅茶菌稀釋液、中草藥紅茶菌原液和稀釋液，然后每管加入3.6 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y試菌液，用振蕩器混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)1、2、4、8和12 h后，每小時取出1環(huán)接種沙門氏顯色平板培養(yǎng)基，根據(jù)是否有病原菌生長來確定共培養(yǎng)時間對微生態(tài)制劑抑菌效果的影響。

1.3.5 紅茶菌和中草藥紅茶菌原液對接種大劑量、高濃度沙門氏菌的體外抑制作用。為了探索通過口服紅茶菌和中草藥紅茶菌預(yù)防沙門氏菌感染的可能性，每排安排6只2 ml的離心管，每只離心管內(nèi)加入1 ml紅茶菌原液、中草藥紅茶菌原液，然后每管加入20、50、125、250、500 和1 000 ml 5.0 麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y試菌液，用振蕩器混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12 h后，取出1環(huán)接種沙門氏顯色平板培養(yǎng)基，根據(jù)是否有病原菌生長來確定微生態(tài)制劑的抑菌效果。

1.3.6 紅茶菌原液和中草藥紅茶菌原液對接種大劑量、高濃度臨床沙門氏菌的體外抑制作用。為了探索通過口服紅茶菌和中草藥紅茶菌預(yù)防沙門氏菌感染的可能性，每排安排20只2 ml的離心管，每只離心管內(nèi)加入1 ml紅茶菌原液、中草藥紅茶菌原液，然后每管分別加入20個沙門氏菌臨床菌株200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊臏y試菌液，用振蕩器混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)12 h后，取出1環(huán)接種沙門氏顯色平板培養(yǎng)基，根據(jù)是否有病原菌生長來確定微生態(tài)制劑的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 過濾滅菌的中草藥紅茶菌對接種低濃度沙門氏菌的體外抑制作用 由表1可知，1 ml過濾紅茶菌菌液，接種3.6 μl麥?zhǔn)蠞岫?.50沙門氏標(biāo)準(zhǔn)株LT2菌液，培養(yǎng)12 h后只有過濾的紅茶菌原液無沙門氏菌生長，其余處理包括對照大多有沙門氏菌生長;過濾的中草藥紅茶菌制劑的原液以及1∶1稀釋的菌液能夠完全抑制所接種的沙門氏菌的生長，1∶2稀釋的過濾滅菌中草藥紅茶菌制劑的原液雖然不能完全抑制所接種的沙門氏菌的生長。這表明過濾滅菌的中草藥紅茶菌制劑原液以及1∶1倍稀釋液都能夠完全抑制所接種的低濃度的沙門氏菌，其余稀釋液濃度不能完全殺滅低濃度的沙門氏菌;與紅茶菌相比，過濾滅菌的中草藥紅茶菌的抑菌效果顯著強(qiáng)于紅茶菌。

表1 過濾滅菌紅茶菌和中草藥紅茶菌對接種低濃度沙門氏菌的體外抑制作用

2.2 過濾滅菌紅茶菌和中草藥紅茶菌對接種高濃度沙門氏菌的體外抑制作用 由表2可知，1 ml過濾滅菌的紅茶菌菌液，接種3.6 μl(麥?zhǔn)蠞岫?5.0)，培養(yǎng) 12 h 后只有過濾的原液中無沙門氏菌生長，其余處理包括對照大多有沙門氏菌生長;過濾滅菌的中草藥紅茶菌制劑的原液以及1∶1稀釋的菌液能夠抑制沙門氏菌的生長。這表明過濾滅菌的紅茶菌制劑只有原液能夠殺滅大量的高濃度的沙門氏菌，其余稀釋液不能完全殺滅大量的高濃度的沙門氏菌。與過濾滅菌的紅茶菌菌液相比，過濾滅菌的中草藥紅茶菌的抑菌效果顯著強(qiáng)于紅茶菌液。

表2 過濾滅菌紅茶菌和中草藥紅茶菌對接種高濃度沙門氏菌的體外抑制作用

2.3 紅茶菌和中草藥紅茶菌對接種低濃度沙門氏菌的體外抑制作用 由表3可知，紅茶菌原液和稀釋菌液，接種3.6 μl(麥?zhǔn)蠞岫?.50)，培養(yǎng)12 h后只有過濾的原液無沙門氏菌生長，其余處理包括對照多有沙門氏菌生長;中草藥紅茶菌制劑的原液以及1∶1稀釋的菌液能夠抑制沙門氏菌的生長。這表明紅茶菌只有原液能夠殺滅大量的低濃度沙門氏菌，其余稀釋液不能完全殺滅低濃度的沙門氏菌;與紅茶菌相比，中草藥紅茶菌的抑菌效果顯著強(qiáng)于紅茶菌。

表3 紅茶菌和中草藥紅茶菌對接種低濃度沙門氏菌的體外抑制作用

2.4 紅茶菌和中草藥紅茶菌對接種高濃度沙門氏菌的體外抑制作用 由表4可知，1 ml紅茶菌接種3.6 μl(麥?zhǔn)蠞岫?.0)沙門氏菌，培養(yǎng)12 h后只有紅茶菌原液無沙門氏菌生長，其余處理包括對照多有沙門氏菌生長;中草藥紅茶菌原液以及1∶1稀釋的菌液能夠抑制沙門氏菌的生長。這表明紅茶菌制劑只有原液能夠殺滅大量的高濃度的沙門氏菌，其余稀釋液不能完全殺滅大量的高濃度的沙門氏菌;與紅茶菌相比，中草藥紅茶菌的抑菌效果更強(qiáng)一些。

表4 紅茶菌和中草藥紅茶菌對接種高濃度沙門氏菌的體外抑制作用

2.5 紅茶菌和中草藥紅茶菌對接種大劑量、高濃度沙門氏菌的體外抑制作用 在上述研究的基礎(chǔ)上，為了探索通過口服紅茶菌和中草藥紅茶菌預(yù)防沙門氏菌感染的可能性，在紅茶菌菌液乳酸菌制劑的原液中接種大劑量、高濃度鼠沙門氏菌LT2，觀察乳酸菌制劑的原液對這些大劑量、高濃度的沙門氏菌的的體外拮抗作用。由表5可知，1 ml紅茶菌原液最大可以拮抗250 μl高濃度的沙門氏菌(麥?zhǔn)蠞岫?.0);1 ml中草藥紅茶菌原液最大可以拮抗1 000 μl高濃度的沙門氏菌，中草藥紅茶菌明顯比紅茶菌具有更強(qiáng)的抑制沙門氏菌的作用效果。

表5 紅茶菌與中草藥紅茶菌原液對接種大劑量、高濃度沙門氏菌的體外拮抗作用

2.6 紅茶菌和中草藥紅茶菌對臨床分離沙門氏菌的抑制效果 為了進(jìn)一步探索紅茶菌和中草藥紅茶菌是不是對醫(yī)院臨床分離的沙門氏菌菌株有拮抗作用以及預(yù)防效果，利用從醫(yī)院分離的20株臨床沙門氏分離菌株為材料，培養(yǎng)這些菌液后將200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木航臃N到紅茶菌和中草藥紅茶菌制劑原液中。由表6可知，1 ml紅茶菌菌液僅對臨床分離的3個菌種 245、781、1430的200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木壕哂型耆囊种谱饔茫瑢ζ溆嗟?3個臨床菌株菌液200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木簺]有完全的抑制作用;中草藥紅茶菌制劑的原液對這20個臨床分離菌種200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木涸壕哂型耆囊种谱饔?。這表明一些臨床分離的沙門氏菌拮抗紅茶菌和中草藥紅茶菌抑制作用的能力顯著強(qiáng)于沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)株LT2。但是，由于中草藥紅茶菌具有顯著的抑菌作用，1 ml中草藥紅茶菌能完全抑制所有這20個臨床分離沙門氏菌200 μl 5.0麥?zhǔn)蠞岫鹊木骸?/p>

表6 紅茶菌對不同沙門氏桿菌菌株拮抗效果的比較

3 討論

沙門氏菌是一種發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家都普通流行的一種腹瀉病原細(xì)菌。它也是一種人畜共患致病病菌。沙門氏菌感染可以引起人和動物的傷寒、副傷寒、胃腸炎和敗血癥等疾病，因此沙門氏菌的傳染和爆發(fā)對人和動物的危害很大［12］。沙門氏菌為腸桿菌科沙門氏菌屬成員，有約2 500多種血清型。通過使用沙門氏菌疫苗來預(yù)防眾多血清型的病原菌難度很大。利用益生菌來預(yù)防沙門氏菌是其中最好的選擇之一，乳酸菌、芽孢桿菌等益生菌都用于預(yù)防沙門氏菌的感染。雖然效果不錯，但是在很多情況下這種效果又不顯著，從而增加推廣和應(yīng)用的難度。此外，這些都是產(chǎn)酸性偏弱的益生菌。因此，如何預(yù)防沙門氏菌的感染在發(fā)達(dá)國家都是一個重要的難題。

該研究結(jié)果表明，1 ml紅茶菌制劑和中草藥紅茶菌制劑都可以殺滅或抑制250 μl或1 000 μl高濃度的沙門氏菌。由于中草藥紅茶菌抑制沙門氏菌的能力約比紅茶菌菌液強(qiáng)近4倍。

沙門氏菌是一種通過口服傳染的病原體。對于身體虛弱的群體，少量的沙門氏菌感染(如15～20個菌)即可發(fā)病;成人的致病菌量需高達(dá)104～1010個以上。1 ml紅茶菌制劑可以殺滅250×109cfu，相當(dāng)于高致病劑量的2.5×106～25.0×106倍感染劑量;1 ml中草藥紅茶菌制劑預(yù)計可以殺滅1.0×1012個沙門氏菌，相當(dāng)高致病劑量的1×107～1×109倍感染劑量。如此推理，口服200 ml紅茶菌，200 ml紅茶菌制劑可以殺滅4×1011個沙門氏菌，相當(dāng)于400倍正常情況的感染劑量，相當(dāng)于低感染劑量情況下4×109～4×1011倍感染劑量;同理，口服200 ml中草藥紅茶菌，200 ml中草藥紅茶菌制劑可以殺滅8×1011個沙門氏菌，相當(dāng)于800倍正常情況的感染劑量，相當(dāng)于特殊情況下8×109～8×1011倍感染劑量。因此，如果每次在食用高風(fēng)險含沙門氏菌的海鮮或食品，口服200 ml紅茶菌或中草藥紅茶菌菌液都能很好地預(yù)防沙門氏菌的感染。

為了控制由食用雞蛋而導(dǎo)致的沙門氏菌食物中毒，我國食品專家利用我國的有關(guān)資料與信息建立了帶殼鮮雞蛋沙門氏菌定量危險性評估模型，對我國帶殼鮮雞蛋的沙門氏菌污染情況進(jìn)行定量評估:消費前每個污染雞蛋中的沙門氏菌菌量平均70 CFU［13］。通過對傳統(tǒng)方法的改進(jìn)，對采自皖南山區(qū)的80枚土雞蛋樣品進(jìn)行了沙門氏菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋黃沙門氏菌感染率為2.5%，蛋清沙門氏菌感染率為5.0%。蛋殼表面沙門氏菌感染率為27.5%，沙門氏菌帶菌數(shù)為1.22×103［14］。根據(jù)上述雞蛋的帶菌量，每次口服200 ml中草藥紅茶菌是可以殺滅這些沙門氏菌的。由此可見，雞蛋中帶有的沙門氏菌是一個很大的疾病感染源。由于我國很少有食用生雞蛋的習(xí)慣，因此在食用雞蛋導(dǎo)致的感染比較少見。然而，在美國等有食用生雞蛋的國家，雞蛋感染的沙門氏菌是一個很重要的致病菌來源。2010年美國發(fā)生由于雞蛋沙門氏菌導(dǎo)致的人體感染，沙門氏菌爆發(fā)已經(jīng)導(dǎo)致逾1 000人發(fā)病，召回被疑感染沙門氏菌雞蛋的數(shù)量超過5億枚。在澳大利亞，沙門氏菌平均每年導(dǎo)致11 992例感染［15］。一般而言，國外雞蛋的沙門氏菌帶菌量比國內(nèi)的略少或相差不多，因此食用生雞蛋的情況下，每次飲用100～200 ml中草藥紅茶菌菌液就可以殺滅這些病原菌，從而減少沙門氏菌感染的風(fēng)險。

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