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    天冬氨酸酶的催化特性及應(yīng)用進展

    2023-08-29 13:10:04賈振華黃媛媛
    河北省科學(xué)院學(xué)報 2023年4期
    關(guān)鍵詞:脫羧酶激活劑丙氨酸

    李 冉,賈振華,宋 聰,張 翔,黃媛媛

    (河北省科學(xué)院生物研究所,河北 石家莊 050051)

    天冬氨酸酶(aspartase,Asp),也稱天冬氨酸氨裂合酶(E.C.4.3.1.1),廣泛存在于大腸桿菌(Escherichiacoli)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、芽孢桿菌YM55-1(Bacillussp.YM55-1)等細菌中,在微生物氮代謝中發(fā)揮著重要作用[1-8]。天冬氨酸酶也是一種重要的生物催化劑,可用于L-天冬氨酸、β-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸衍生物的合成[9-11]。本文將圍繞天冬氨酸酶的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、催化機理及其在生物催化中的應(yīng)用綜述其研究進展。

    1 天冬氨酸酶的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)

    1.1 天冬氨酸酶的結(jié)構(gòu)

    天冬氨酸酶最早被發(fā)現(xiàn)于細菌中,大腸桿菌天冬氨酸酶(AspA)蛋白大小約200 kDa,以同源四聚體形式存在,由4個51 kDa的相同亞基組成,每個亞基包含3個結(jié)構(gòu)域,其C-末端由2個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋模體(helix-turn-helix motif)組成,模體的相對方向約為90°;中心結(jié)構(gòu)域由5個長的α-螺旋組成,占亞單位總殘基的一半以上;N-末端結(jié)構(gòu)域由1個短的雙鏈反平行β折疊和5個α-螺旋組成[12,13]。

    AspA與芽孢桿菌YM55-1天冬氨酸酶(AspB)、延胡索酸酶C(fumarase C,FumC)、腺苷酸琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase,ADL)、精氨酸琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ARL)屬于天冬氨酸酶/富馬酸酶超家族,均含有三段高度保守的氨基酸序列(XXSXNDXXXT、GXTXXQXAXP、GSSXXPXKXN)(圖1),其中一段保守序列(GSSXXPXKXN)所構(gòu)成的一個特殊的環(huán)(SS環(huán)),被證明是與底物結(jié)合的關(guān)鍵位點和活性中心[14-19]。

    圖1 天冬氨酸酶/富馬酸酶超家族保守氨基酸序列比對

    1.2 天冬氨酸酶的理化性質(zhì)

    大腸桿菌AspA對L-天冬氨酸有很強的底物專一性,需要Mg2+、Mn2+等金屬離子作為激活劑,在堿性條件下具有催化活性,在55 ℃和pH8.0條件下酶活性最強,但熱穩(wěn)定性差,在55 ℃條件下30 min會失去酶活性[6,20,21]。中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)AspA的最適pH為8.0~8.5,最適溫暖為35 ℃,在45 ℃以下酶活性穩(wěn)定,需要Mg2+離子作為激活劑[22]。AspA是細菌在復(fù)雜培養(yǎng)基中以及厭氧、酸性和缺鐵離子條件下生長所必需的[23]。腸道細菌假結(jié)核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)的蛋白質(zhì)組學(xué)和 lacz 融合分析表明,在酸性條件下,其AspA表達量增加,添加天冬氨酸可以提高野生型菌株在酸性環(huán)境的存活率,但不能提高敲除AspA 基因的突變體菌株的存活率,表明天冬氨酸酶能夠催化天冬氨酸產(chǎn)生氨,來增加菌株在酸性環(huán)境中的存活率[24]。

    芽孢桿菌YM55-1天冬氨酸酶(AspB)是第一個被發(fā)現(xiàn)的具有熱穩(wěn)定性的天冬氨酸酶[4]。AspB在鹽酸胍存在下,有更強的熱穩(wěn)定性,在65 ℃和pH8.0的條件下酶活性最強[4]。與大腸桿菌AspA相比,AspB有較高的對映體選擇性、廣泛的底物特異性,在堿性環(huán)境中不需要底物變構(gòu)和金屬離子的激活就具有催化活性,因此,AspB作為氨基酸合成的生物催化劑而備受關(guān)注。

    2 天冬氨酸酶的催化機理

    天冬氨酸酶的催化反應(yīng)遵循酸堿反應(yīng)機理如圖2所示。酶活性位點的堿性離子首先從底物的C3原子中提取氫離子,形成的碳負離子穩(wěn)定的中間體,然后中間體崩解后底物的C—N鍵或C—O鍵斷裂,產(chǎn)生富馬酸鹽和相應(yīng)的次級產(chǎn)物。C—N鍵或C—O鍵斷裂是反應(yīng)的限速步驟,由酸促進,為離去基團(NH3)提供質(zhì)子以形成銨離子[25-30]。

    圖2 天冬氨酸酶的催化反應(yīng)機制[28]

    動力學(xué)研究表明,AspA在堿性pH條件下的脫胺反應(yīng)表現(xiàn)出非米氏動力學(xué),在反應(yīng)達到動力學(xué)穩(wěn)態(tài)之前有一個停滯期,由此能夠推出AspA受到變構(gòu)活化。在催化反應(yīng)時,L-天冬氨酸和Mg2+會首先結(jié)合到不同于活性位點的單獨激活劑結(jié)合位點,因此,L-天冬氨酸既作為底物,又作為AspA的激活劑[28]。許多研究涉及定點突變、化學(xué)修飾和基于機理的失活來鑒定AspA的重要催化殘基,有研究者推測第一個激活劑結(jié)合位點位于Cys430附近[16],也有研究者通過比較AspA和富馬酸酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu),推測第二個激活劑結(jié)合位點可能是位于短螺旋段的Gln129和Asn138[29],但是,至今沒有AspA與底物或產(chǎn)物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)被解析,以確定激活劑結(jié)合位點的位置。

    AspB酶的催化活性不需要受到變構(gòu)作用激活,Fibriansah等人[31]成功地解析了AspB與L-天冬氨酸復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),提供了天冬氨酸酶的底物結(jié)合活性位點的第一個詳細視圖。結(jié)果表明,AspB蛋白的Thr101、Ser140、Thr141和Ser319殘基與底物的β-羧酸基團之間形成氫鍵,使底物形成高烯醇化物樣(aci-羧酸鹽樣)構(gòu)象。同時,SS環(huán)的構(gòu)象也發(fā)生變化,由開放構(gòu)象變?yōu)殚]合構(gòu)象,這種構(gòu)象變化提供了額外的底物結(jié)合,并在催化過程中保護底物不受溶劑的影響。SS環(huán)的閉合將Ser318靠近C3質(zhì)子的位置以實現(xiàn)質(zhì)子提取,將SS環(huán)的Ser318突變?yōu)锳la318會導(dǎo)致AspB活性完全喪失,表明Ser318對AspB的酶活性至關(guān)重要[31]。

    3 天冬氨酸酶在生物催化中的應(yīng)用

    3.1 天冬氨酸酶用于合成L-天冬氨酸

    L-天冬氨酸是合成人工甜味劑阿斯巴甜的重要起始化合物,也可作為氨解毒劑、肝機能促進劑、疲勞恢復(fù)劑等醫(yī)藥品和添加劑用于各種清涼飲料的生產(chǎn),在醫(yī)藥、食品和化工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前已發(fā)現(xiàn)多種具有天冬氨酸催化活性的菌株。Yukawa等人[32]在從短桿菌(Brevibacteriumgenus)中篩選到具有天冬氨酸酶活性的突變株,天冬氨酸酶的最適pH和最適溫度分別為9.3和54℃,需要Ca2+作為激活劑,在氨水堿性條件下能將10%的富馬酸轉(zhuǎn)化為天冬氨酸。Suzuki等人[33]從土壤中分離出一株具有高天冬氨酸酶活性的嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus),在65 ℃、pH9.5時能將800 mM富馬酸和氨離子轉(zhuǎn)化為L-天冬氨酸,轉(zhuǎn)化效率為85%。Patel等人[34]發(fā)現(xiàn)銅綠色假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中的AspA可將1 M富馬酸轉(zhuǎn)化生成0.39 mM L-天冬氨酸。Takahisa等人[35]在嗜冷性希瓦氏藻(Shewanellalivingstonensis)中表達大腸桿菌天冬氨酸酶AspA,在50 ℃處理后可使富馬酸轉(zhuǎn)化為L-天冬氨酸而不形成 L-蘋果酸,解決了在大腸桿菌中合成L-天冬氨酸會產(chǎn)生副產(chǎn)物L(fēng)-蘋果酸的問題。Liu等人[36]構(gòu)建了含順反式異構(gòu)酶(MaiA)和天冬氨酸酶(AspA)的雙酶系統(tǒng)的大腸桿菌工程菌,以順丁烯二酸為原料合成 L-天冬氨酸的方法,得到 L-天冬氨酸產(chǎn)量為419.8 g/L,轉(zhuǎn)化率為98.4%。

    固定化天冬氨酸酶能夠提高酶的溫度穩(wěn)定性,具有便于回收、可重復(fù)利用等優(yōu)點,能夠有效降低生產(chǎn)成本。1973年,Chibata等人[37]利用聚丙烯酰胺、角叉菜膠將AspA及含有AspA的大腸桿菌菌體制成固定化酶和固定化細胞,提高了連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸的能力。Sato等人[38]用交叉菜膠固定含AspA的大腸桿菌細胞,與可溶性天冬氨酸酶相比,酶促反應(yīng)的Km值提高了5倍,最適pH由9.5降為8.5,最適溫度提高了5~10 ℃,具有更高的熱穩(wěn)定性。Cárdenas-Fernández等人[39]利用不同材料固定化芽孢桿菌AspB,可重復(fù)利用5次,酶活性及轉(zhuǎn)化效率均在90%以上。Ram等人[40]將中間氣單胞菌(A.mediaNFB-5)中的AspA在大腸桿菌中過表達,結(jié)果表明均質(zhì)化固定化滲透性重組細胞(566 mg/g 濕細胞)比滲透性重組細胞(154 mg/g 濕細胞)產(chǎn)生更多的 L-天冬氨酸。Takahisa等人[35]利用海藻酸鈉固定化嗜冷性希瓦氏藻(S.livingstonensis)可重復(fù)使用9次,并且天冬氨酸產(chǎn)率高。

    3.2 天冬氨酸酶合成L-天冬氨酸衍生物

    L-天冬氨酸衍生物可作為手性中間體用于藥物的合成,利用天冬氨酸酶合成L-天冬氨酸衍生物是重要途徑,但因天冬氨酸酶有很強底物特異性,對廣譜化合物沒有活性,因此,通過定向改造天冬氨酸酶擴大其底物催化范圍,從而獲得種類豐富的天冬氨酸衍生物成為研究的方向。Yumoto等人[41]對AspA進行定點突變,將Lys327突變?yōu)锳sn327,使AspA能夠催化L-天冬氨酸-α-酰胺(β-天冬酰胺)的脫氨基反應(yīng),但反應(yīng)效率很低。Asano等人[42]篩選到一株AspA兩位點突變(C462T、A981T)菌株能夠催化富馬酸單酰胺和氨合成L-天冬氨酸-α-半醛。LI等人[43]利用生物信息學(xué)手段將AspB的活性位點突變?yōu)镃ys187、Ile321、Leu324、Ala326,突變后的菌株能夠催化300g/L 巴豆酸完全轉(zhuǎn)化為R-3-氨基丁酸。

    在天冬氨酸酶反應(yīng)中加入親核試劑也是一種降低其底物特異性,擴大底物催化范圍的方法,Emery[44]發(fā)現(xiàn)羥胺可以作為一種替代親核試劑促進AspA的催化反應(yīng)。Weiner等人[45]在 AspB的催化反應(yīng)中以羥胺作為親核試劑,再向富馬酸鹽中分別加入甲氧基胺、聯(lián)氨和甲胺,能夠分別產(chǎn)生L-羥基天冬氨酸、L-N-甲氧基天冬氨酸、L-2-肼基琥珀酸和L-N-甲基天冬氨酸。在這幾種衍生物中,L-羥基天冬氨酸由于穩(wěn)定性較差不易被分離,L-N-甲氧基天冬氨酸、L-2-肼基琥珀酸和L-N-甲基天冬氨酸均很穩(wěn)定且易于分離[45]。

    3.3 天冬氨酸酶合成β-丙氨酸

    β-丙氨酸是一種重要的中間體,在食品、飼料添加劑、醫(yī)藥、高分子材料等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,以L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸脫羧酶為關(guān)鍵酶合成β-丙氨酸的研究較多。高宇等人[46]利用大腸桿菌AspA和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)α-脫羧酶panD,以富馬酸和氨水為底物合成β-丙氨酸(9.8 g/L)。Qian等人[47]將L-天冬氨酸脫羧酶(panD)的位點突變體后提高了催化穩(wěn)定性,與 L-天冬氨酸酶(AspA)偶聯(lián),以富馬酸為底物合成β-丙氨酸,產(chǎn)率為118.6 g/L,轉(zhuǎn)化率大于99%。Wang等人[48]采用三酶級聯(lián)法,將大腸桿菌AspA、枯草桿菌(B.subtilis)L-天冬氨酸脫羧酶基因BSADC和赤擬谷盜蟲(Triboliumcastaneum)L-天冬氨酸脫羧酶基因TCADC共表達,實現(xiàn)了從富馬酸到β-丙氨酸的一鍋合成法,能夠得到200.3 g/L的β-丙氨酸,轉(zhuǎn)化率為90.0%。Ko等人[49]利用組成型啟動子表達AspA和panD強化了β-丙氨酸合成途徑,并利用該途徑實現(xiàn)了在大腸桿菌中由葡萄糖合成丙烯酸的新生物合成途徑。α-丙氨酸是β-丙氨酸的同分異構(gòu)體,Liu等人[50]克隆了抗輻射不動桿菌(Acinetobacterradioresistens)的天冬氨酸-4-脫羧酶基因ArASD,其突變體(N35D)具有更高的催化效率和穩(wěn)定性,與大腸桿菌AspA構(gòu)建雙酶體系催化富馬酸合成α-丙氨酸,轉(zhuǎn)化率達97.1%。

    4 結(jié)論與展望

    對天冬氨酸酶的研究已有幾十年,關(guān)于它的酶學(xué)特性有了充分的研究,其催化機理也已被闡明。從嗜熱微生物中分離和鑒定出的天冬氨酸酶為工業(yè)化應(yīng)用提供了可能,但因其底物特異性,限制了可催化底物的范圍。因此,利用定點突變等方法對酶基因進行改造來獲得更廣泛的可催化底物范圍、更穩(wěn)定的酶活和更高產(chǎn)的菌種成為研究的方向。天冬氨酸酶用于合成L-天冬氨酸及其衍生物、β-丙氨酸、L-精氨酸等已有較多研究,但還未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),相信隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展,以及市場需求的不斷增加,天冬氨酸酶的規(guī)?;瘧?yīng)用將會實現(xiàn)。

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