沒食子酸脫羧酶及酶法制備焦性沒食子酸研究進展

張亮亮，汪詠梅*，徐曼，陳笳鴻

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)

工程重點開放性實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇南京 210042；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091）

沒食子酸脫羧酶及酶法制備焦性沒食子酸研究進展

張亮亮1，2，汪詠梅1，2*，徐曼1，陳笳鴻1

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)

工程重點開放性實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇南京 210042；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091）

對沒食子酸脫羧酶及酶法制備焦性沒食子酸研究進展進行了介紹和綜述，重點介紹了產(chǎn)沒食子酸脫羧酶的微生物種類、發(fā)酵時間、底物濃度、pH值、溫度、金屬離子，氮源及接種量等對微生物發(fā)酵產(chǎn)高活性沒食子酸脫羧酶的影響因素，并簡述了酶法制備焦性沒食子酸的方法，指出了今后的研究方向。

沒食子酸；焦性沒食子酸；沒食子酸脫羧酶；單寧酶

焦性沒食子酸，又稱焦蒬酚或連苯三酚，是一種具有多種用途的化學(xué)試劑和化工原料，廣泛用于醫(yī)藥合成、染料、食品、農(nóng)藥及電子產(chǎn)品等，作為顯影劑、熱敏劑、高分子材料的助劑以及化學(xué)分析試劑等。目前焦性沒食子酸的市場需求量為600 t／a左右，全國年產(chǎn)量為200～500 t／a，還滿足不了市場需求。生產(chǎn)焦性沒食子酸的主要原料是沒食子酸。沒食子酸主要由五倍子、塔拉等的提取物經(jīng)水解后制得的。沒食子酸受熱脫羧后生成焦性沒食子酸。在我國，目前焦性沒食子酸主要采用化學(xué)法進行制備，其制備工藝主要有兩種［1－3］：一種是對沒食子酸直接高溫脫羧，該工藝需要在高溫下進行人工翻炒，不僅勞動強度大，產(chǎn)品得率較低，質(zhì)量也不穩(wěn)定。另一種是采用催化劑對沒食子酸進行加熱催化脫羧，該工藝具有得率高、操作簡便的優(yōu)點，但產(chǎn)品中容易殘留微量催化劑。而微生物酶法則有助于解決上述弊端，因此，建立酶法制取焦性沒食子酸的新工藝具有“綠色”化學(xué)化工加工新工藝的重要意義。國外最早是日本學(xué)者從20世紀(jì)80年代初發(fā)現(xiàn)沒食子酸脫羧酶并開始研究微生物酶法制備焦性沒食子酸，國內(nèi)目前尚未見到相關(guān)技術(shù)研究的報道。

1 產(chǎn)沒食子酸脫羧酶的微生物

單寧酸可在單寧酶的作用下發(fā)生降解生成沒食子酸，沒食子酸可在沒食子酸脫羧酶（GAD）的作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)生成焦性沒食子酸［4－6］，反應(yīng)過程見圖1。

圖1 單寧酸生物降解過程Fig.1 Degradation of tannic acid

目前已從多種細菌中分離得到?jīng)]食子酸脫羧酶，已報道的能夠產(chǎn)生沒食子酸脫羧酶的細菌主要有成團泛菌（Pantoea agglomerans），弗氏檸檬酸菌（Citrobacter freundiiTB3），檸檬菌株（Citrobactersp.），腸桿菌（Enterobacterspp.），月形單胞菌（Selenomonasspp.）和鏈球菌（Streptococcusspp.）等［5，7－11］，有些微生物種類不僅能產(chǎn)生沒食子酸脫羧酶同時也能產(chǎn)生單寧酶，如鏈球菌（Streptococcus gallolyticus），隆派恩菌（Lonepinella koalarum），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum），戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）和成團泛菌（Pantoea agglomerans）等［5，12－14］。除細菌外還發(fā)現(xiàn)一株酵母菌Rhodotorula glutinis也可以產(chǎn)生沒食子酸脫羧酶［15］。表1列出了已報道的能夠產(chǎn)生沒食子酸脫羧酶的微生物及其參考文獻。已經(jīng)公開的有關(guān)沒食子酸脫羧酶及酶法制備焦性沒食子酸的專利僅有4項，見表2，均為日本研究人員在20世紀(jì)八九十年代所申請。

目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)沒食子酸脫羧酶的菌株主要為腸桿菌屬（Enterobacter）、泛菌屬（Pantoea）和檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）。這類細菌見于人和動物的糞便，或是正常腸道棲居菌，也見于土壤、水、污水和食物中。能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為革蘭氏陰性的兼性厭氧桿菌，有周鞭毛，可以活動。

表1 產(chǎn)沒食子酸脫羧酶的微生物Table 1 Microbial sources of gallic acid decarboxylase（GAD）

表2 已發(fā)表的沒食子酸脫羧酶制備和應(yīng)用的專利Table 2 Published patents regarding to GAD production and application

2 沒食子酸脫羧酶活性的影響因素

Soni等［9］研究了腸桿菌Enterobacter spp.發(fā)酵沒食子酸產(chǎn)沒食子酸脫羧酶的條件及酶活性的影響因素。分別考察了發(fā)酵時間、底物濃度、緩沖液濃度、pH值、發(fā)酵溫度、金屬離子種類及濃度、氮源、攪拌速度和接種量對焦性沒食子酸產(chǎn)量及沒食子酸脫羧酶活性的影響。

2.1 發(fā)酵時間的影響

發(fā)酵時間對焦性沒食子酸的產(chǎn)量及沒食子酸脫羧酶的活性影響較大。經(jīng)20 h發(fā)酵后焦性沒食子酸的產(chǎn)量及沒食子酸脫羧酶的活性均達到最大值，分別為190 μg／mL和0.193 U／mL［9］。發(fā)酵4、8及20 h后取樣分析，焦性沒食子酸產(chǎn)量分別為10.54、13.33及15.81 μg［9］。Yoshida等［21］研究發(fā)酵時間對檸檬菌株（Citrobacterspp.）產(chǎn)沒食子酸脫羧酶的影響時發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵48 h后沒食子酸脫羧酶的產(chǎn)率達到最大，沒食子酸的最大轉(zhuǎn)化率為69.8%。Zeida等［5］研究成團泛菌（Pantoea agglomerans）產(chǎn)沒食子酸脫羧酶發(fā)現(xiàn)在反復(fù)震蕩培養(yǎng)條件下，發(fā)酵24 h后發(fā)酵產(chǎn)物中沒食子酸脫羧酶含量達到最高。

2.2 底物濃度及磷酸緩沖液的影響

以沒食子酸作為唯一碳源進行微生物發(fā)酵時，當(dāng)沒食子酸底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時腸桿菌（Enterobacterspp.）產(chǎn)沒食子酸脫羧酶酶活達到最高（0.156 U／mL），同時胞外蛋白濃度達到最大值（62.45 mg／L）［9］。Zeida等［2］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)沒食子酸底物濃度為3 g／L時成團泛菌（Pantoea agglomerans）產(chǎn)沒食子酸脫羧酶酶活最高。通過對發(fā)酵液中不同緩沖液體系的比較研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵液中添加磷酸鹽緩沖液發(fā)酵產(chǎn)物中沒食子酸脫羧酶酶活最高。發(fā)酵液中磷酸鹽緩沖液濃度為30 mmol／L時發(fā)酵產(chǎn)物中沒食子酸脫羧酶活性最高（0.137 U／mL），蛋白質(zhì)含量為54.67 mg／L［9］。

2.3 pH值及發(fā)酵溫度的影響

發(fā)酵生產(chǎn)沒食子酸脫羧酶過程中，pH值能夠顯著的影響發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含量和沒食子酸脫羧酶活性。當(dāng)pH值為6.6時，腸桿菌（Enterobacterspp.）發(fā)酵產(chǎn)沒食子酸脫羧酶發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量最大且產(chǎn)生的沒食子酸脫羧酶酶活最高，蛋白質(zhì)含量及沒食子酸脫羧酶活性分別為52.45 μg／mL和0.131 U／mL［9］。發(fā)酵時pH值的控制對微生物生長、沒食子酸脫羧酶的產(chǎn)率及發(fā)酵原料的降解都起到至關(guān)重要的作用。文獻報道不同的細菌發(fā)酵產(chǎn)高活性沒食子酸脫羧酶的最適宜pH值范圍為5～6.6之間。

發(fā)酵溫度對沒食子酸脫羧酶的產(chǎn)率及活性同樣具有很大的影響。Soni等［9］考察了不同發(fā)酵溫度（25、30、35、40和45℃）對腸桿菌（Enterobacterspp.）發(fā)酵產(chǎn)沒食子酸脫羧酶產(chǎn)量及活性的影響，發(fā)現(xiàn)最佳發(fā)酵溫度為30℃，在此溫度下發(fā)酵產(chǎn)物中胞外蛋白質(zhì)濃度及沒食子酸脫羧酶的活性最大，分別為42.42 mg／L和0.106 U／mL。

2.4 金屬離子的影響

Soni等［9］以沒食子酸為底物，研究了不同金屬離子（Fe2＋、Cu2＋、Mg2＋、Co2＋、Mn2＋、K＋及Zn2＋）對腸桿菌（Enterobacterspp.）發(fā)酵產(chǎn)物中胞外蛋白質(zhì)含量及沒食子酸脫羧酶產(chǎn)率的影響。發(fā)現(xiàn)Mg2＋對發(fā)酵過程影響最大，當(dāng)有Mg2＋存在的條件下發(fā)酵產(chǎn)物中沒食子酸脫羧酶的含量最高，為0.175 U／mL，同時發(fā)酵產(chǎn)物中胞外蛋白質(zhì)含量最高，為70.29 mg／L。且進一步研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)0.06%Mg2＋時發(fā)酵產(chǎn)物中沒食子酸脫羧酶及蛋白質(zhì)含量最高，分別為0.164 U／mL和65.75 mg／L。Yoshida等［21］研究了以沒食子酸為底物，利用檸檬菌株（Citrobacterspp.）發(fā)酵產(chǎn)沒食子酸脫羧酶的過程，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵原料中添加0.05%的MgSO4得到發(fā)酵產(chǎn)物中沒食子酸脫羧酶含量最高。Kumar等［7］發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵原料中添加濃度為0.5 mol／L的MgSO4同樣能夠促進弗氏檸檬酸菌（Citrobacter freundiiTB3）發(fā)酵產(chǎn)沒食子酸脫羧酶的產(chǎn)率。Zeida等［5］研究發(fā)現(xiàn)每升發(fā)酵原料中添加0.5 g的MgSO4·7H2O和0.01 g的FeSO4·7H2O可促進成團泛菌（Pantoea agglomerans）發(fā)酵產(chǎn)沒食子酸脫羧酶的產(chǎn)率。

2.5 氮源的影響

Soni等［9］通過在發(fā)酵原料中添加硝酸銨，氯化銨及硫酸銨3種不同氮源，考察了不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量及沒食子酸脫羧酶產(chǎn)率的影響。發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵原料中添加0.04%（NH4）2SO4作為發(fā)酵氮源時得到發(fā)酵產(chǎn)物中沒食子酸脫羧酶活性最高，為0.101 U／mL，蛋白質(zhì)含量也最高，為43.11 mg／L。在利用微生物發(fā)酵產(chǎn)沒食子酸脫羧酶過程中，通常添加NH4Cl作為氮源。

2.6 攪拌速率及接種量的影響

研究發(fā)現(xiàn)攪拌速率對微生物發(fā)酵產(chǎn)沒食子酸脫羧酶具有一定的影響，當(dāng)攪拌速率為150 r／min時，發(fā)酵產(chǎn)物中沒食子酸脫羧酶活性最高，為0.095 U／mL，焦性沒食子酸含量也達到最高，為37.92 mg／L。Soni等［9］研究了在含有100 mL發(fā)酵原料的三角瓶中分別按照1%、2%、3%、4%、5%和6%的接種量進行接種培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種量為5%時發(fā)酵產(chǎn)物中沒食子酸脫羧酶和蛋白質(zhì)含量最高，分別為0.057 U／mL和22.64 mg／L。

3 酶法制備焦性沒食子酸研究狀況

Yoshida等［8］研究了酶法制備焦性沒食子酸的生物脫羧過程：檸檬菌株（Citrobactersp.）在28℃下培養(yǎng)24 h后，加入7.5%沒食子酸引發(fā)反應(yīng)。為避免底物氧化及氧氣引起的其它副反應(yīng)，反應(yīng)操作應(yīng)在無氧條件下進行，加入少量L-抗壞血酸作除氧劑，調(diào)pH值為4.5，加入沒食子酸即有大量CO2氣體放出。每2 h取一次樣分析，8 h后停止。產(chǎn)物經(jīng)離心沉降、溶劑萃取、再蒸發(fā)溶劑即得焦性沒食子酸，焦性沒食子酸產(chǎn)率達到97.4%。

Soni等［9］報道了腸桿菌（Enterobacterspp.）30℃下在含有0.2%沒食子酸、0.4%（NH4）2SO4、0.05%MgSO4、pH值為6.6、30 mmol／L磷酸鹽作為緩沖液的培養(yǎng)液中培養(yǎng)20 h，可得到焦性沒食子酸產(chǎn)品。Kumar等［7］設(shè)計了一種能夠進行連續(xù)發(fā)酵控制的圓柱形生物反應(yīng)器，將弗氏檸檬酸菌（Citrobacter freundii）固定到κ-型卡拉膠（κ-carrageenan）上進行沒食子酸連續(xù)脫羧反應(yīng)制備焦性沒食子酸，控制發(fā)酵混合液以0.5 mL／min的流速通過反應(yīng)器進行沒食子酸脫羧反應(yīng)，得到發(fā)酵產(chǎn)物中焦性沒食子酸最高含量為7.3 g／L，焦性沒食子酸的轉(zhuǎn)化率達到98.5%。

Shinya等［23］從土壤中分離得到一株能夠產(chǎn)生沒食子酸脫羧酶的細菌成團泛菌（Pantoea agglomerans），并研究了沒食子酸脫羧酶制備焦性沒食子酸的脫羧過程。發(fā)現(xiàn)沒食子酸脫羧酶酶活的最佳條件為：pH值5.5～6.5，溫度50℃。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析沒食子酸脫羧酶分子量為58 ku，經(jīng)凝膠滲透色譜-液相色譜法分析沒食子酸脫羧酶分子量為442 ku，經(jīng)氨基酸序列測定其N-末端氨基酸序列為Ser-Asn-Thr-Gln-Asn-Leu-Pro-Ala-Asn-Asp-Val-Tyr-Asp-Leu-Arg。

最早研究酶法制備焦性沒食子酸，是利用微生物發(fā)酵沒食子單寧（gallotannin）或塔拉單寧（tara tannin）來制備焦性沒食子酸。但這類脫羧反應(yīng)過程非常緩慢，只有25.8%的沒食子單寧（發(fā)酵液中為1%的沒食子單寧）和28.5%的塔拉單寧（發(fā)酵液中為1%的塔拉單寧）轉(zhuǎn)化為焦性沒食子酸［8］。之后研究人員開始直接以沒食子酸為底物，研究微生物發(fā)酵制備焦性沒食子酸，焦性沒食子酸的產(chǎn)率得到了提高，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后焦性沒食子酸的轉(zhuǎn)化率普遍能達到90%以上。除了以植物單寧或沒食子酸為原料制備焦性沒食子酸外，近年來有研究者利用重組大腸桿菌（Escherichia coliKL7／pSK6.161）以自然界資源更為豐富的葡萄糖為原料，合成了沒食子酸和焦性沒食子酸［24］。在該反應(yīng)中葡萄糖轉(zhuǎn)化為沒食子酸的轉(zhuǎn)化率為12%，沒食子酸轉(zhuǎn)化為焦性沒食子酸的轉(zhuǎn)化率達到了93%～97%。

4 小結(jié)與展望

采用微生物發(fā)酵法對沒食子酸脫羧制備焦性沒食子酸的研究已經(jīng)在國外進行了多年，篩選出了多種具有高效沒食子酸脫羧能力的微生物菌株。這些研究主要集中在產(chǎn)高活性沒食子酸脫羧酶菌株的篩選和酶法制備焦性沒食子酸發(fā)酵條件的優(yōu)化上。目前國內(nèi)尚未見到酶法制備焦性沒食子酸產(chǎn)業(yè)化的報道。這是因為沒食子酸脫羧酶的應(yīng)用還受到一定程度的限制，有些細菌產(chǎn)生的沒食子酸脫羧酶酶活太低而沒有實用價值，有些酶活雖高卻沒有合適的應(yīng)用手段等條件的制約。對于前者，可以借鑒單寧酶的研究手段運用物理、化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合以及分子克隆和遺傳工程手段改良菌種。目前國際上尚未見到這方面的研究報道，這是目前該領(lǐng)域需要重點研究的工作。對于后者，人們正通過酶的固定化等方法加以克服。對單寧酶及其應(yīng)用的研究國內(nèi)已有大量報道。但國內(nèi)至今仍未見到?jīng)]食子酸脫羧酶及酶法制備焦性沒食子酸的相關(guān)報道。目前，產(chǎn)高活性沒食子酸脫羧酶菌株的篩選及酶法制備焦性沒食子酸技術(shù)的研究已列為國家863研究課題計劃。相信隨著對沒食子酸脫羧酶的深入研究，必將促進我國五倍子加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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Research Progress on Gallic Acid Decarboxylase and Microbial Production of Pyrogallol through Decarboxylation of Gallic Acid

ZHANG Liang-liang1，2，WANG Yong-mei1，2，XU Man1，CHEN Jia-hong1
（1.Institute of Chemical Industry of Forest Products，CAF；National Engineering Lab.for Biomass Chemical Utilization；Key and Open Lab.of Forest Chemical Engineering，SFA；Key Lab.of Biomass Energy and Material，Jiangsu Province，Nanjing 210042，China；2.Research Institute of Forestry New Technology，CAF，Beijing 100091，China）

The gallic acid decarboxylase and microbial production of pyrogallol through decarboxylation of gallic acid was reviewed.Main focuses were enzyme-producing strains and the factors influencing the activities of gallic acid decarboxylase，such as time，concentration of gallic acid，pH value，temperature，metal ions，nitrogen sources and inoculums size.Finally，methods of microbial production of pyrogallol through decarboxylation of gallic acid were introduced briefly.The future study direction was pointed out.

Gallic acid；Pyrogallol；Gallic acid decarboxylase；Tannase

TQ35

A

1673-5854（2014）04-0035-05

10.3969／j.issn.1673-5854.2014.04.007

2013-10-24

國家863計劃資助（SS2014AA021802）

張亮亮（1981—），男，江蘇沭陽人，博士，副研究員，主要從事植物化學(xué)研究；E-mail：zhll20086＠gmail.com

*通訊作者：汪詠梅，副研究員，主要從事植物資源化學(xué)利用研究；E-mail：njlhswym＠163.com。