陳小梅,李慧玉,曲濤,高萌,徐向紅
(1.甘肅省人民醫(yī)院生物治療中心,蘭州 730000;2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院干細胞中心,武漢 430022)
乳腺癌是全球女性發(fā)病率占據(jù)第一位的惡性腫瘤[1]。近年來開發(fā)出更有效的治療乳腺癌的療法,如光動力療法(photodynamic therapy,PDT),它通過光敏劑引發(fā)的氧化應(yīng)激對目標細胞造成損傷,對一些失去手術(shù)機會或難治性的腫瘤具有良好療效[2-4]。金絲桃素(Hypericum perforatum L,Hyp)是由金絲桃屬植物分離得到的一種天然光敏劑,易被腫瘤細胞攝取,具有強大的光敏特性、低暗毒性和高單線態(tài)氧量子產(chǎn)量[5],可對多種實體腫瘤實施PDT[5-9]。金絲桃素介導(dǎo)的PDT可誘導(dǎo)腫瘤細胞免疫原性細胞死亡(immunogenic cell death,ICD)[10-12],其特點是分泌或暴露損傷相關(guān)分子模式(damaged associated molecular patterns,DAMPs)[5-6]。DAMPs是正常情況下存在于細胞內(nèi)的具有免疫激活作用的分子,在損傷或應(yīng)激的刺激下,表達在細胞表面或從細胞中釋放出來[13-16]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB-1)、熱休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)和鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin,CRT)是3個主要的DAMPs[5-6,12]。雖然PDT并不能有效治療播散性腫瘤[2],但可提高腫瘤細胞的免疫原性[17],因此,有必要與其他治療模式結(jié)合,如PDT聯(lián)合過繼免疫細胞治療[18-19],后者可治療播散性腫瘤。細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine-induced killer,CIK)是抗腫瘤過繼免疫細胞治療的首選方案,是將外周血單個核細胞在體外經(jīng)多種細胞因子培養(yǎng)誘導(dǎo)獲得的免疫效應(yīng)細胞,在培養(yǎng)過程中獲得非特異性、自然殺傷類的抗腫瘤細胞毒性[20]。本研究在體外模擬PDT作用,用金絲桃素作為光敏劑誘導(dǎo)MCF7細胞ICD;同時,用所得上清液與CIK細胞共培養(yǎng)以模擬體內(nèi)DAMPs對免疫細胞的作用,探討Hyp-PDT誘導(dǎo)MCF7細胞ICD對CIK抗腫瘤活性的影響,并初步探討其可能的分子機制。
1.1藥品與試劑 金絲桃素(大連美侖生物技術(shù)有限公司,含量≥98%,批號:S0807AS);還原型谷胱甘肽(reduced L-glutathione,GSH,德國BioFroxx公司,含量:99.4%,批號:EZ1609A126);Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司,批號:8072965);Ficoll淋巴細胞分離液(美國GE公司,批號:10270607);CIK細胞培養(yǎng)試劑(北京康愛瑞浩生物科技股份有限公司,批號:20191020);異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,F(xiàn)ITC)標記的CD3(FITC-CD3)、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標記的CD8及CD16/56單克隆抗體(PE-CD8、PE-CD16/56)購自美國BD公司(批號:49979);1640培養(yǎng)基(批號:AE24464298)、胎牛血清(批號:RC35965)均購自美國Hyclone公司;CRT(批號:N21039163)、HMGB-1(批號:D01039219)和HSP70(批號:E25039218)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自武漢華美生物科技有限公司,噻唑藍(MTT,Sigma公司,批號:MKBF7875)。
1.2儀器與設(shè)備 LED光源(黃光)購自深圳奇異果光電有限公司,雙通道光功率計型號2936-R(美國NEWPORT公司),流式細胞儀型號C6PLUS(美國BD公司),分光光度型號Epoch 2(美國Bio-Rad公司)。
1.3細胞株 人乳腺癌細胞株MCF7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞庫。
1.4實驗方法
1.4.1流式細胞術(shù)檢測Hyp-PDT誘導(dǎo)MCF7細胞凋亡 常規(guī)培養(yǎng)靶細胞MCF-7細胞,待細胞長至瓶底的80%,給予消化、懸浮、計數(shù),向6孔板加入細胞,每孔1×106個,待貼壁生長至瓶底的80%,加入不同濃度的金絲桃素:0.15 μmol·L-1、0.20 μmol·L-1、0.25 μmol·L-1、0.25 μmol·L-1(+0.33 μmol·L-1GSH糾正),繼續(xù)培養(yǎng)2 h,之后分別給予不同光劑量:2.05 J·(cm2)-1、4.05 J·(cm2)-1[5-6]。將未做任何藥物及光照處理的MCF-7細胞作為對照。將Hyp-PDT處理后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h。收集細胞,洗滌,用100 μL1×Binding buffer重懸細胞(1×106·mL-1),加Annexin V-FITC 5 μL,室溫下避光反應(yīng)15 min,上機前5 min再加入碘化丙啶(PI)5 μL。流式檢測各組細胞凋亡率,1 h完成檢測。實驗重復(fù)3次。
1.4.3ICD誘導(dǎo)CIK對MCF-7細胞的抑制率 參照文獻[19]方法培養(yǎng)效應(yīng)細胞CIK細胞。采用淋巴細胞分離液分離健康供者外周血單個核細胞,洗滌2次,用培養(yǎng)液培養(yǎng),加入滅活的自體血清、γ-干擾素,置37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)24 h后,加白細胞介素(IL)-2、CD3mAb,以后每2~3 d適量添加含IL-2、自體血清的新鮮培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)CIK細胞。將MCF-7細胞做PDT處理,處理方法同“1.4.2”項。收集上清液,加入24孔板內(nèi)。將成熟的CIK細胞約2×106個加入含上清液的24孔板內(nèi),未做PDT處理的MCF-7培養(yǎng)上清液及同樣數(shù)量的CIK細胞加入24孔板內(nèi)作為對照。24 h后取出所有CIK細胞,洗滌。將對數(shù)生長期MCF-7細胞加入96孔板,每孔2×104個,培養(yǎng)12 h貼壁,將ICD誘導(dǎo)后并進行洗滌的CIK細胞加入96孔板內(nèi)進行殺傷MCF-7實驗,效靶比為20:1。24 h后結(jié)束殺傷,用MTT法檢測靶細胞抑制率,酶標儀上讀取波長490 nm處吸光度(A)值,計算各試驗組和對照組的平均A值和抑制率。抑制率(%)=[1-(實驗細胞孔A值-效應(yīng)細胞孔A值)/靶細胞孔A值]×100%。實驗重復(fù)3次。
1.4.4ELISA法檢測Hyp-PDT誘導(dǎo)MCF7細胞ICD后培養(yǎng)上清中的DAMPs分子濃度 MCF7 細胞上清液中DAMPs分子常規(guī)培養(yǎng)MCF7細胞,待細胞生長至瓶底80%,給予消化、懸浮、計數(shù),向24孔板每孔加入細胞 1×105個,待貼壁生長至瓶底80%,給予PDT處理,2 h后收集上清液,860×g離心20 min,上清液為待測樣品。按照CRT、HMGB-1、HSP70的ELISA試劑盒說明書操作,將標準品稀釋為要求的倍數(shù),設(shè)標準孔8孔建立標準曲線,待測樣品加入檢測孔,將反應(yīng)板置37 ℃、2 h。棄去孔內(nèi)液體,不洗滌,每孔加入生物素標記抗體100 μL,將反應(yīng)板置37 ℃、1 h。棄去孔內(nèi)液體,用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌3次,濾紙上印干,每孔加酶標試劑100 μL,將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃、1 h。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌3次,濾紙上印干。每孔加底物溶液90 μL,將反應(yīng)板置37 ℃、20 min,注意避光。每孔加入50 μL終止液混勻,5 min內(nèi)用Epoch2分光光度計檢測波長450 nm處A值。使用curve expert軟件繪制標準曲線,標準品濃度為縱坐標,A值為橫坐標,求回歸方程,將樣本A值代入方程計算出各樣品的濃度。
2.1流式細胞術(shù)檢測Hyp-PDT誘導(dǎo)ICD細胞凋亡 MCF7細胞經(jīng)Hyp-PDT處理后發(fā)生凋亡。流式細胞術(shù)檢測早期(Annexin V+/PI-)和晚期(Annexin V+/PI+)凋亡細胞的百分率,數(shù)據(jù)以百分率表示。各組Hyp-PDT(包括GSH糾正組)誘導(dǎo)MCF7細胞早期凋亡和晚期凋亡的細胞的比例較對照組均明顯上升(P<0.05,F(xiàn)Annexin V+/PI-=1510.58,F(xiàn)Annexin V+/PI+=962.42),且隨著Hyp-PDT的增強凋亡細胞比例顯著上升,而外源性抗氧化劑GSH可以部分阻止Hyp-PDT誘導(dǎo)的ICD,結(jié)果見圖1,2。
圖1 MCF7細胞經(jīng)Hyp-PDT誘導(dǎo)后凋亡情況
①與正常對照組比較,P<0.05;②與GSH糾正組比較,P<0.05;③與其他Hyp-PDT組比較,均P<0.05。
A.正常對照組;B.GSH糾正組;C.0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組;D.0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組;E.0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組;F.0.20 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組;G.0.25 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組;①與正常對照組比較,P<0.05;②與GSH糾正組比較,P<0.05;③與其他Hyp-PDT組比較,均P<0.05。
2.3ICD誘導(dǎo)CIK對MCF-7細胞增殖的抑制 MTT實驗結(jié)果見圖4。與對照組比較,除GSH糾正組外,不同強度Hyp-PDT誘導(dǎo)ICD的MCF7細胞上清液誘導(dǎo)的CIK對MCF7細胞增殖的抑制率明顯增高(F=111.49,P<0.05)。不同光劑量聯(lián)合不同質(zhì)量濃度Hyp誘導(dǎo)MCF7細胞ICD的上清液誘導(dǎo)CIK對MCF7細胞增殖的抑制率不同,抑制率隨Hyp-PDT劑量的增加而升高。各Hyp-PDT組相互比較結(jié)果顯示,0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組、0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組、0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組這3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。以上結(jié)果表明,Hyp-PDT誘導(dǎo)ICD的MCF7細胞上清液能增強CIK細胞的抗腫瘤活性。
A.正常對照組;B.GSH糾正組;C.0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組;D.0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組;E.0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組;F.0.20 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組;G.0.25 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組;①與正常對照組比較,P<0.05;②與GSH糾正組比較,P<0.05;③與E,F(xiàn),G組比較,均P<0.05;④與F,G組比較,均P<0.05;⑤與F,G組比較,均P<0.05;⑥與G組比較,P<0.05。
2.4免疫原性死亡MCF7細胞上清液中HMGB-1、HSP70和CRT含量 ELISA實驗結(jié)果見圖5。與對照組比較,除GSH糾正組外,不同強度Hyp-PDT誘導(dǎo)MCF7細胞ICD的上清液中測得CRT、HMGB-1和HSP70濃度顯著升高(P<0.05,F(xiàn)CRT=389.70,F(xiàn)HMGB-1=2907.96,F(xiàn)HSP70=1897.32),提示DAMPs是基于Hyp-PDT誘導(dǎo)的ICD增強CIK殺傷活性的關(guān)鍵因素。
A.正常對照組;B.GSH糾正組;C.0.15 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組;D.0.15 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組;E.0.20 μmol·L-1Hyp+2.05 J·(cm2)-1光劑量組;F.0.20 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組;G.0.25 μmol·L-1Hyp+4.05 J·(cm2)-1光劑量組;①與對照組比較,P<0.05;②與GSH糾正組比較,P<0.05;③與其他Hyp-PDT組比較,均P<0.05
腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療效果不佳和死亡的主要原因[21]。目前,乳腺癌的治療主要以外科手術(shù)和藥物為主[22],但外科手術(shù)和化療藥物會帶來嚴重的副作用。因此,尋找安全有效、毒副作用低的治療方法顯得尤為重要。Hyp-PDT已被證實是在技術(shù)上可行的腫瘤治療的新方法[7-9,23],Hyp-PDT治療通過直接的細胞毒性作用、血管損傷和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答殺死腫瘤[12],尤其是對一些失去手術(shù)機會或難治性的腫瘤,均具有良好療效且毒副作用小。本研究中,筆者將人乳腺癌MCF7細胞作為Hyp-PDT誘導(dǎo)乳腺癌細胞ICD的模型。為明確Hyp-PDT過程對MCF7細胞的損傷程度,分析細胞凋亡,結(jié)果顯示Hyp-PDT組細胞凋亡比例均高于對照組和GSH糾正組,證明Hyp-PDT可引起乳腺癌細胞ICD。在此基礎(chǔ)上進一步分析Hyp-PDT對MCF7細胞的損傷可知,凋亡細胞的比例隨著Hyp-PDT劑量的增加而顯著升高,而GSH可糾正0.25 μmol·L-1Hyp和4.05 J·(cm2)-1光劑量組引起的MCF7細胞ICD。這一結(jié)果與ZHENG等[5]研究報道一致,說明Hyp-PDT能夠激活MCF7細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)并誘導(dǎo)ICD,而GSH能減輕氧化應(yīng)激對MCF7細胞的損傷。
在Hyp-PDT中,一些關(guān)鍵DAMPs的暴露或釋放對ICD至關(guān)重要[17]。通過對Hyp-PDT誘導(dǎo)MCF7細胞ICD后的培養(yǎng)上清液中DAMPs的分析發(fā)現(xiàn),Hyp-PDT組上清液中CRT、HMGB1、HSP70含量顯著高于對照組和GSH糾正組;隨著Hyp-PDT劑量的增加,ICD細胞上清液中DAMPs分子濃度亦升高,因此DAMPs可能是Hyp-PDT強化CIK殺傷腫瘤細胞活性的關(guān)鍵因素。由此可推測,經(jīng)歷ICD的腫瘤細胞通過DAMPs的釋放增加腫瘤細胞的免疫原性,改善免疫抑制微環(huán)境,破壞免疫逃逸平衡,增強淋巴細胞的抗腫瘤活性。本研究結(jié)果初步支持ICD相關(guān)的DAMPs在增強CIK殺傷效能方面的關(guān)鍵作用,當(dāng)然并不排除其他分子的作用。需要說明的是,本研究只針對一種特定的癌癥類型和一種細胞系。即使在同一種癌癥中,癌癥本身也是異質(zhì)性的,因此很難推斷這種治療方法對所有癌癥都有效。
綜上所述,本研究證明將Hyp-PDT與CIK治療聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗腫瘤作用,基于Hyp-PDT的ICD在CIK抗腫瘤免疫應(yīng)答過程中具有重要作用,DAMPs是提高免疫應(yīng)答關(guān)鍵分子,這為PDT和免疫細胞治療的結(jié)合提供了體外試驗證據(jù),為播散性腫瘤的治療提供了新的方法和思路。