石斑魚虹彩病毒主要衣殼蛋白的表達及其生物學功能分析

肖賀賀 徐鳳巧 劉明珠 蘇美珍 余慶 李夢夢 李鵬飛

摘要：【目的】明確石斑魚虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）主要衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP）的生物學功能，為闡明SGIV感染致病機理及研發(fā)抗病毒產(chǎn)品提供理論依據(jù)?！痉椒ā渴褂脤崟r熒光定量PCR檢測SGIV感染過程中MCP基因的轉(zhuǎn)錄時序及其在SGIV感染石斑魚脾臟、肝臟、腎臟、腸道、胃和鰓組織中的表達水平;將SGIV MCP基因分別克隆至真核表達載體pEGFP-N3和pcDNA3.1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MCP和pcDNA3.1-MCP，然后以重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MCP轉(zhuǎn)染石斑魚脾細胞（Grouper spleen cell，GS）進行亞細胞定位分析，同時以重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MCP轉(zhuǎn)染胖頭鯉細胞（Fathead minnow cells，F(xiàn)HM）構(gòu)建能穩(wěn)定表達MCP蛋白的FHM細胞系（FHM-MCP），用于分析MCP蛋白對宿主細胞生長增殖及SGIV感染壓力下細胞存活率和病毒復(fù)制的影響?！窘Y(jié)果】在SGIV感染8 h后即可檢測到MCP基因的特異性轉(zhuǎn)錄，即MCP基因是一個晚期基因。在SGIV感染24 h后，MCP基因在石斑魚脾臟中的相對表達量最高，其次是在肝臟、腎臟和腸道組織中，而在胃和鰓組織中的相對表達量較低，提示胃和鰓組織并非SGIV感染的主要靶器官。SGIV的MCP蛋白主要定位于細胞核附近的胞質(zhì)中。細胞生長增殖曲線和細胞計數(shù)結(jié)果均證實，MCP蛋白能調(diào)節(jié)細胞生長及促進細胞分裂增殖。在SGIV感染后24和48 h，F(xiàn)HM-MCP細胞的存活率均顯著高于FHM-Vector細胞（真核表達載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染FHM細胞），其存活率分別是FHM-Vector細胞的1.12和1.15倍。此外，F(xiàn)HM-MCP細胞在SGIV感染24和48 h后，其病毒滴度均高于FHM-Vector細胞，即MCP蛋白能促進SGIV病毒復(fù)制?！窘Y(jié)論】SGIV的MCP基因是一個晚期基因，其編碼蛋白主要定位于細胞核附近的胞質(zhì)中，通過促進宿主細胞分裂增殖及病毒復(fù)制，最終提高SGIV的病毒滴度和感染力。

關(guān)鍵詞： 石斑魚虹彩病毒（SGIV）;主要衣殼蛋白（MCP）;表達分析;亞細胞定位;宿主細胞

中圖分類號： S941.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）03-0806-09

Expression and biological functional analysis of major capsid protein （MCP） of Singapore grouper iridovirus

XIAO He-he1，2， XU Feng-qiao1，3， LIU Ming-zhu1， SU Mei-zhen1，2，

YU Qing1， LI Meng-meng4， LI Peng-fei1，3*

（1Guangxi Academy of Sciences/Guangxi Fishery Major Diseases Control and Efficient Breeding Technology Research Center/Guangxi Key Laboratory of Marine Natural Products and Combinatorial Biosynthesis Chemistry， Nanning? 530007， China; 2College of Fisheries and Life Science， Shanghai Ocean University/Key Laborratory of Freshwater Aquatic Germplasm Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Shanghai? 201306， China; 3College of Marine Sciences， Beibu Gulf? University/Guangxi Key Laboratory of Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation， Qinzhou， Guangxi? 535011， China; 4College of Life Science， Henan Normal University， Xinxiang， Henan? 453007， China）

Abstract：【Objective】The biological function of major capsid protein（MCP） of Singapore grouper iridovirus（SGIV） was analyzed in this study， which could provide data support and theoretical basis for elucidating the pathogenic mechanism of SGIV infection and developing antiviral products. 【Method】Real-time fluorescence quantitative PCR was used to perform the transcriptional analysis of MCP gene， and identify the expression of MCP in the spleen， liver， kidney， intestine， stomach and gill tissues of grouper during SGIV infection. SGIV MCP genes were cloned into eukaryotic expression vectors pEGFP-N3 and pcDNA3.1， respectively， to construct the recombinant plasmids pEGFP-N3-MCP and pcDNA3.1-MCP. Then pEGFP-N3-MCP was transfected into grouper spleen cells （GS） for subcellular localization analysis. At the same time， the recombinant plasmid pcDNA3.1-MCP was transfected into fathead minnow cells （FHM） to construct a FHM cell line（FHM-MCP） capable of stably expressing MCP protein， which was used to analyze the effects of MCP protein on host cell growth and proliferation and effects of on cell survival rates and viral replication during SGIV infection. 【Result】The specific transcription of MCP gene could be detected 8 h after SGIV infection， which meaned that MCP gene was a late gene. After 4 h of SGIV infection， the expression of MCP gene was the highest in spleen， followed by liver， kidney and intestine， however， the relative expression levels in stomach and gill tissues were low， suggesting that stomach and gill tissues were not the main target organs for SGIV infection. Subcellular localization results showed that MCP proteins of SGIV were mainly located in the cytoplasm near the nucleus. Both cell growth curve and cell count results were confirmed that? MCP protein could regulate cell growth and promote cell proliferation. At 24 and 48 h after SGIV infection， the survival rate of FHM cells overexpressing MCP gene（FHM-MCP） was significantly higher than that of FHM-Vector cells （transfected with eukaryotic expression vector pcDNA3.1）， and the survival rate was as 1.12 and 1.15 times as that of FHM-Vector cells， respectively. Furthermore， the virus titers of FHM-MCP cells were higher than FHM-Vector cells 24 and 48 h after SGIV infection， that was， overexpression of MCP protein could promote virus replication after SGIV infection. 【Conclusion】SGIV MCP gene is a late gene， and its encoded protein is mainly located in the cytoplasm near the nucleus. By promoting the division and proliferation of host cells and virus replication， it ultimately improves the virus titer and infectivity of SGIV.

Key words： Singapore grouper iridovirus（SGIV）; major capsid protein（MCP）; expression analysis; subcellular localization; host cell

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（41706145）; Guangxi Key Research and Development Project（GuikeAB18221111）; Natural Science Foundation of Guangxi（2019GXNSFAA245054，AD19245022）

0 引言

【研究意義】虹彩病毒（Iridovirus）是目前公認嚴重危害海水和淡水養(yǎng)殖魚類的傳染性病原之一，石斑魚虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）是從患病石斑魚中分離獲得的高致病性虹彩病毒（Qin et al.，2003），可導致石斑魚發(fā)病死亡率在90%以上，給石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失（關(guān)麗雅等，2013）。主要衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP）是虹彩病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有多種生物學功能，在病毒的包裝和感染過程中發(fā)揮重要作用（Ouyang et al.，2012;Yan et al.，2015;周小愿等，2016），尤其是病毒的抗原相關(guān)蛋白已成為設(shè)計和制備抗病毒藥物及疫苗的關(guān)鍵靶標（苗素英等，2001）。因此，明確MCP的轉(zhuǎn)錄時序、亞細胞定位、調(diào)控細胞周期作用及其對SGIV復(fù)制的影響，可為揭示SGIV感染致病分子機理提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】石斑魚是我國南方沿海地區(qū)及東南亞國家重要的海水養(yǎng)殖魚類之一，其經(jīng)濟價值極高（王大鵬等，2012;余慶等，2019;張顯良等，2019）。但在高密度養(yǎng)殖條件下，各種水產(chǎn)疫病頻繁暴發(fā)，嚴重制約了石斑魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展（饒穎竹等，2016;李鵬飛等，2018，2019;Xiao et al.，2019;Yu et al.，2019b）。其中，SGIV是最主要的病毒性疫病病原之一，最早由Qin等（2003）從患病石斑魚中分離獲得，通過序列比對證實SGIV隸屬于蛙虹彩病毒屬。2017年出版的《國際病毒分類手冊》（第10版）正式將SGIV確定為蛙病毒屬的1個新種（Qin et al.，2003;Chinchar et al.，2017）。SGIV呈正二十面體結(jié)構(gòu)，其直徑介于154～176 nm，純化的SGIV顆粒具有雙層膜結(jié)構(gòu)，包括最外層的脂蛋白囊膜和最內(nèi)層的脂質(zhì)膜。雙層膜包圍著1個約90 nm的電子致密核，含有雙鏈DNA;囊膜與脂質(zhì)膜間為規(guī)律排列的蛋白質(zhì)衣殼，由衣殼亞單位緊密連接形成（秦啟偉和黃曉紅，2019）。MCP是虹彩病毒的核心蛋白，其分子量約50 kD，占整個病毒蛋白的40%～45%，約占病毒可溶性蛋白的90%（蕭楓和張奇亞，2004;Zhao et al.，2007）。MCP基因在虹彩病毒科同屬間高度保守，不同屬間差異顯著，是研究虹彩病毒分類及系統(tǒng)演變的重要靶基因（Song et al.，2004;Whittington et al.，2010）。MCP也是研究病毒感染機制的重要抗原相關(guān)蛋白。Caipang等（2006）基于MCP基因構(gòu)建紅鯛虹膜病毒（RSIV）DNA疫苗，并證實其對紅鯛具有良好的免疫保護作用，免疫紅鯛群體的相對存活率（RPS）介于42.8%～71.4%，顯著高于對照組，即構(gòu)建的DNA疫苗能誘導魚類產(chǎn)生抗RSIV感染的強大保護作用。曾憲輝等（2015）將MCP基因定向克隆至真核表達載體pcDNA3.1（+）中，構(gòu)建大鯢虹彩病毒MCP基因DNA疫苗表達載體，并探究DNA疫苗免疫對大鯢的保護效果，結(jié)果表明該DNA疫苗可誘導大鯢產(chǎn)生較強的細胞免疫活性，同時刺激機體產(chǎn)生特異性抗體?！颈狙芯壳腥朦c】MCP作為虹彩病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒組裝合成及其侵染過程中發(fā)揮重要作用（Ou-yang et al.，2012;Yan et al.，2015;周小愿等，2016），但針對SGIV MCP的研究至今鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從SGIV的基因組中克隆MCP基因，并研究分析其轉(zhuǎn)錄時序、亞細胞定位、調(diào)控細胞周期作用及其對SGIV復(fù)制的影響，旨在明確MCP的生物學功能，為闡明SGIV感染致病機理及研發(fā)抗病毒產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

SGIV廣西株由廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室保存提供（Xiao et al.，2019）;石斑魚脾臟組織細胞系（Grouper spleen cell，GS）和胖頭鯉細胞（Fathead minnow cells，F(xiàn)HM）由廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室建立并保存提供;胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司;PCR純化回收試劑盒、凝膠回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶及pMD19-T載體等購自TakaRa公司;真核表達載體pEGFP-N3和pcDNA3.1、表達菌株DH5α和Rosetta（DE3）購自Novagen公司;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 3000購自賽默飛世爾科技公司;G418購自美國Sigma-Aldrich公司;細胞培養(yǎng)瓶、波點皿及細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司。

1. 2 SGIV感染過程中MCP基因的轉(zhuǎn)錄時序

將2.0×105個GS細胞接入12孔板，28 ℃培養(yǎng)18 h，然后將SGIV（MOI=1）接入GS細胞中，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別于接種SGIV后2、4、8、12、16、24和48 h時收集12孔板中的GS細胞及其培養(yǎng)基。采用RNA提取試劑盒提取SGIV感染的GS細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;然后以cDNA為模板、β-actin為內(nèi)參基因，利用實時熒光定量PCR檢測MCP基因（ORF072）的轉(zhuǎn)錄情況。以正常GS細胞為對照處理，每處理設(shè)3個重復(fù)（余慶等，2020）。實時熒光定量PCR檢測MCP基因的引物見表1。

1. 3 SGIV感染過程中MCP基因在不同組織中的表達情況

為闡明SGIV感染過程中MCP基因在不同組織中的表達情況，采用實時熒光定量PCR分別檢測SGIV感染石斑魚脾臟、肝臟、腎臟、腸道、胃和鰓組織中MCP基因的相對表達量。取體長約10 cm的石斑魚，空腹24 h后腹腔注射100 μL SGIV（106 TCID50/mL），分別于攻毒后12和24 h剖解取樣，以健康石斑魚為對照。使用RNA提取試劑盒提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;然后以cDNA為模板、β-actin基因為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR檢測MCP基因的表達情況。每處理設(shè)3個重復(fù)。

1. 4 重組質(zhì)粒構(gòu)建

SGIV MCP基因（ORF072）（GenBank登錄號YP_ 164167.1;核苷酸位置66404～67795 nt）全長1392 bp，共編碼463個氨基酸殘基，根據(jù)MCP基因核苷酸全長序列設(shè)計相應(yīng)的特異性擴增引物。同時根據(jù)pEGFP-N3綠色熒光質(zhì)粒圖譜在上、下游引物分別引入EcoR I和BamH I酶切位點，根據(jù)pcDNA3.1質(zhì)粒圖譜在上、下游引物分別引入BamH I和EcoR I酶切位點。以SGIV基因組DNA為模板進行PCR擴增，利用PCR純化回收試劑盒收集PCR擴增片段，使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別對純化回收的PCR片段和真核表達載體進行雙酶切，T4連接酶16 ℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜。經(jīng)菌落PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性克隆送至武漢金開瑞生物工程有限公司測序，對測序結(jié)果正確的菌液進行PCR擴增，并以去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別命名為pEGFP-N3-MCP和pcDNA3.1-MCP。

1. 5 亞細胞定位分析

將1.0×104個GS細胞接入細胞波點皿，28 ℃培養(yǎng)18 h。將重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MCP轉(zhuǎn)染至GS細胞中，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后于4 ℃下以4%多聚甲醛固定細胞2 h，經(jīng)Hoechst33342室溫染色3 min，再用PBS輕輕漂洗細胞3次，略干燥后用抗熒光淬滅劑封片，使用激光共聚焦顯微鏡對各組細胞進行熒光觀察。以真核表達載體pEGFP-N3轉(zhuǎn)染的GS細胞為對照。

1. 6 穩(wěn)定表達MCP蛋白的FHM細胞系構(gòu)建

將2.0×105個FHM細胞接入12孔板，28 ℃培養(yǎng)18 h，分別以重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MCP和真核表達載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染FHM細胞，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。以胰酶對細胞進行消化處理，將細胞加入含400 μg/mL G418的細胞培養(yǎng)基中，混勻，然后接入12孔板，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。每4 d傳代一次，待細胞在G418壓力下不再死亡且正常生長后，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)傳代培養(yǎng)，細胞系分別命名為FHM-MCP和FHM-Vector。收集細胞并提取其總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;并以cDNA為模板，使用MCP基因引物檢測目的基因。

1. 7 MCP蛋白對細胞生長增殖的影響

將2.0×105個FHM-MCP細胞接入24孔板，28 ℃培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48和72 h時檢測細胞數(shù)量，繪制細胞生長增殖曲線。參照Li等（2015）的方法，使用CCK-8溶液檢測細胞活力變化。具體操作：將1.0×104個FHM-MCP細胞接入96孔板，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48和72 h時向96孔板的各孔中加入10 ?L CCK-8溶液，室溫孵育4 h，利用酶標儀檢測450 nm處的吸光值，繪制細胞生長增殖曲線。以FHM-Vector細胞為對照。各組細胞均設(shè)3個重復(fù)。

1. 8 MCP蛋白對SGIV感染細胞存活率的影響

將1.0×104個FHM-MCP細胞和FHM-Vector細胞分別接入96孔板，28 ℃培養(yǎng)18 h;然后將SGIV（MOI=1）接入細胞中，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別于攻毒后24、48和72 h時向各孔中加入10 ?L CCK-8溶液，室溫孵育4 h后，利用酶標儀檢測450 nm處的吸光值，以檢測細胞活性，各組細胞均設(shè)3個重復(fù)。以正常培養(yǎng)的FHM-Vector細胞為對照。將測得的吸光值代入如下公式（1），計算各組細胞的存活率（Survival rate，SR）（余慶等，2020）：

SR（%）=OD450 nm（SGIV攻毒組）/OD450 nm（FHM-Vector）×100 （1）

1. 9 MCP蛋白對SGIV復(fù)制增殖的影響

將2.0×105個FHM-MCP細胞接入12孔板，28 ℃培養(yǎng)18 h;然后將SGIV（MOI=1）接入細胞中，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。以SGIV（MOI=1）感染的FHM-Vector細胞為對照組。分別于攻毒后12、24和48 h時收集12孔板中的細胞及其培養(yǎng)基，各樣品經(jīng)-80 ℃反復(fù)凍融3次后，梯度稀釋并接入96孔板的FHM細胞中，利用TCID50法計算病毒滴度。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SGIV MCP基因的轉(zhuǎn)錄時序分析結(jié)果

為分析SGIV MCP基因的轉(zhuǎn)錄時序，分別收集病毒感染0、2、4、8、12、16、24和48 h后的GS細胞，提取細胞總RNA，并以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果（圖1）顯示，在SGIV感染8 h后即可檢測到MCP基因的特異性轉(zhuǎn)錄，進一步證實MCP基因是一個晚期基因。

2. 2 SGIV感染過程中MCP基因在石斑魚不同組織中的表達情況

采用實時熒光定量PCR檢測SGIV感染過程中MCP基因在石斑魚脾臟、肝臟、腎臟、腸道、胃和鰓組織中的表達情況。如圖2所示，對石斑魚腹腔注射SGIV后，MCP基因的轉(zhuǎn)錄表達持續(xù)升高;至攻毒24 h后MCP基因在脾臟中的相對表達量最高，其次是在肝臟、腎臟和腸道組織中，而在胃和鰓組織中MCP基因的相對表達量較低，提示胃和鰓組織可能并非SGIV感染的主要靶器官。SGIV主要感染脾臟、肝臟、腎臟和腸道等靶器官的上皮和內(nèi)皮細胞（Huang et al.，2004）。

2. 3 SGIV MCP蛋白的亞細胞定位分析結(jié)果

為探究SGIV MCP蛋白在細胞內(nèi)的定位情況，以重組質(zhì)粒pEGFP-N3-MCP及真核表達載體pEGFP-N3分別轉(zhuǎn)染GS細胞，結(jié)果顯示，與真核表達載體pEGFP-N3轉(zhuǎn)染全細胞分布的定位特征不同，SGIV MCP蛋白主要定位于細胞核附近的胞質(zhì)中（圖3）。SGIV主要在宿主細胞質(zhì)中完成自組裝，MCP蛋白是構(gòu)成SGIV核衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，核衣殼以晶體排列方式存在于細胞核附近的病毒加工廠，電子致密核進入核衣殼中形成成熟的完整病毒核衣殼，最終完成病毒裝配及釋放等侵染過程（秦啟偉和黃曉紅，2019;Yu et al.，2019a）。

2. 4 穩(wěn)定表達MCP蛋白FHM細胞的構(gòu)建情況

為深入研究SGIV MCP蛋白的生物學功能，以重組質(zhì)粒pcDNA3.1-MCP轉(zhuǎn)染FHM細胞，構(gòu)建能穩(wěn)定表達MCP蛋白的FHM細胞系（FHM-MCP）;以真核表達載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的FHM細胞（FHM-Vector）為對照。提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞總RNA，并以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模版，使用MCP基因特異引物進行PCR擴增，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。如圖4所示，F(xiàn)HM-MCP細胞出現(xiàn)單一的條帶，且PCR擴增產(chǎn)物大小與編碼MCP蛋白的MCP基因（約1400 bp）一致;而FHM-Vector細胞未檢出任何條帶。可見，F(xiàn)HM-MCP細胞已構(gòu)建成功。

2. 5 MCP蛋白能促進FHM細胞分裂增殖

已有研究表明，一些病毒編碼的蛋白具有促進細胞分裂增殖及促進細胞生長的作用，如SGIV的VP51、ICP18和VP96等（Xia et al.，2009，2010;Yu et al.，2016）。為驗證SGIV MCP蛋白是否具有類似功能，使用穩(wěn)定表達MCP蛋白的FHM-MCP細胞進行增殖試驗，以CCK-8測定細胞活力，并繪制細胞生長增殖曲線，結(jié)果顯示，MCP蛋白可有效促進FHM細胞增殖（圖5），且細胞計數(shù)進一步證實MCP蛋白能調(diào)節(jié)細胞生長及促進細胞分裂增殖（圖6）。

2. 6 MCP蛋白能提高SGIV感染細胞存活率及促進病毒復(fù)制

SGIV感染FHM細胞會引起典型的凋亡反應(yīng)，導致細胞存活率下降（Huang et al.，2011）。為進一步闡明MCP蛋白的功能，檢測FHM-MCP細胞在SGIV感染壓力下的存活率變化。如圖7所示，在SGIV感染后12 h，F(xiàn)HM-MCP細胞的存活率與對照組FHM-Vector細胞無顯著差異（P>0.05）;在SGIV感染后24和48 h，F(xiàn)HM-MCP細胞的存活率均顯著高于對照組FHM-Vector細胞（P<0.05，下同），且FHM-MCP細胞在SGIV感染后24和48 h的存活率分別是FHM-Vector細胞的1.12和1.15倍。為揭示MCP對病毒復(fù)制的影響，采用TCID50法計算FHM-MCP細胞在SGIV感染壓力下的滴度變化，結(jié)果（圖8）顯示，F(xiàn)HM-MCP細胞在SGIV感染后24和48 h，其病毒滴度均顯著高于FHM-Vector細胞，說明MCP蛋白能促進SGIV病毒復(fù)制。

3 討論

病毒侵染宿主細胞起始于病毒與細胞表面受體的接觸結(jié)合，病毒在受體介導下進入宿主細胞，并在細胞內(nèi)開始復(fù)制、組裝和釋放，而完成完整的侵染周期。在此過程中，病毒為了保證順利完成復(fù)制、裝配和傳播等過程，會編碼多種蛋白發(fā)揮調(diào)控作用（秦啟偉和黃曉紅，2019）。因此，深入開展病毒侵染宿主的基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學等研究，可為闡明病毒侵入宿主細胞的分子機制及研發(fā)高效的靶向抗病毒藥物和免疫防控產(chǎn)品提供參考依據(jù)。SGIV具有雙鏈環(huán)狀DNA，目前已有針對SGIV基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學等的系統(tǒng)研究，相關(guān)結(jié)論部分揭示了SGIV的侵染致病機理。SGIV基因組全長140131 bp，共編碼162個開放閱讀框（ORF），而編碼ORF的基因根據(jù)轉(zhuǎn)錄表達先后順序又可被分為立即早期基因（Immediate-early，IE）、早期基因（Early，E）和晚期基因（Late，L）（Song et al.，2004）。SGIV在體外感染宿主細胞中存在15個IE轉(zhuǎn)錄本、89個E轉(zhuǎn)錄本及53個L轉(zhuǎn)錄本。ORF086R和ORF162L屬于立即早期基因，二者的轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)物能促進細胞生長及促進SGIV復(fù)制;ORF016L、ORF019R、ORF088L和ORF039L屬于晚期基因，能編碼病毒囊膜蛋白。值得注意的是：在細胞系水平和魚活體水平，SGIV感染的基因轉(zhuǎn)錄模式差異明顯，尤其是在魚活體水平SGIV感染的基因轉(zhuǎn)錄模式更復(fù)雜。為了抵抗病毒感染，宿主通過抑制與病毒復(fù)制有關(guān)的IE轉(zhuǎn)錄本和E轉(zhuǎn)錄本以干擾病毒復(fù)制，最終實現(xiàn)對病毒的免疫清除（秦啟偉和黃曉紅，2019）。本研究通過分析SGIV MCP基因轉(zhuǎn)錄時序，證實MCP基因是一個晚期基因，其編碼MCP蛋白是構(gòu)成SGIV核衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白（Song et al.，2004），與針對大鯢虹彩病毒的研究結(jié)果（Chinchar et al.，2011;周小愿等，2016）一致。

最新研究結(jié)果顯示，除了非結(jié)構(gòu)蛋白，病毒的結(jié)構(gòu)蛋白也能在病毒的侵染及復(fù)制過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用（Yu et al.，2016;Lu et al.，2017）。草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）的外衣殼蛋白VP5作為重要的結(jié)構(gòu)蛋白，能與VP7結(jié)合形成三聚體復(fù)合物，進而在GCRV表面構(gòu)成三聚體網(wǎng)絡(luò)，以保護病毒粒子及維持病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（Fang et al.，2005）。此外，VP5能與宿主細胞膜上的層黏連蛋白（LamR）發(fā)生相互作用，進而介導GCRV吸附和侵入宿主細胞（Wang et al.，2016）。據(jù)報道，SGIV的外衣殼通過與宿主細胞膜相互作用，而介導病毒侵染進入宿主細胞;隨后病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制促使病毒組裝位點（Viral assembly site，VAS）形成，此時作為前體出現(xiàn)的膜結(jié)構(gòu)通過招募衣殼蛋白，形成雙殼新月形結(jié)構(gòu)，進而形成二十面體衣殼。在此過程中，若抑制MCP蛋白表達，可有效阻斷病毒衣殼形成（Liu et al.，2016）。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然MCP基因在SGIV感染后8 h即出現(xiàn)少量表達，且隨時間延長其轉(zhuǎn)錄表達水平持續(xù)增加，但MCP基因的轉(zhuǎn)錄表達在SGIV感染后8～16 h增加趨勢較緩慢，直至感染24 h后其轉(zhuǎn)錄表達水平才顯著增高，故推測前期少量表達的MCP蛋白可能對宿主細胞發(fā)揮部分調(diào)控功能，而后期大量表達的MCP蛋白主要參與SGIV的組裝。

明確病毒蛋白在細胞內(nèi)的定位可為其功能研究提供極具價值的思路與線索。本研究通過體外轉(zhuǎn)染表達MCP融合蛋白，觀察綠色熒光的分布情況以判定MCP蛋白的亞細胞定位，結(jié)果表明，SGIV MCP蛋白主要定位于細胞核附近的胞質(zhì)中。說明SGIV主要在宿主細胞核附近的病毒加工廠中進行組裝，而MCP蛋白正是構(gòu)成其核衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白（秦啟偉和黃曉紅，2019）。也有研究顯示，在SGIV感染宿主細胞的過程中，MCP蛋白會出現(xiàn)在細胞膜上。Yu等（2019a）利用特異性識別SGIV侵染宿主細胞的核酸適配體Q5，通過微納米磁珠—磁性分離技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)對核酸適配體的靶標蛋白進行分離、富集與鑒定，證明核酸適配體Q5在SGIV感染細胞上的靶標蛋白即為MCP蛋白。該研究成果首次證明SGIV在侵染過程中其MCP蛋白可能會出現(xiàn)在細胞膜上（Li et al.，2015;Yu et al.，2019a）。為進一步探究MCP蛋白影響SGIV侵染宿主細胞的作用機制，Yu等（2020）利用核酸適配體Q5構(gòu)建了高特異性的熒光分子探針，并通過Q5熒光探針研究MCP蛋白在病毒感染宿主內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制，證實MCP蛋白進入宿主細胞不依賴于網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞途徑，也不依賴于巨胞飲途徑，而是主要依賴小窩蛋白介導的內(nèi)吞途徑，同時需要發(fā)動蛋白（Dynamin）參與，且依賴于低pH條件和細胞骨架微絲。該結(jié)論不僅從嶄新的角度闡明SGIV侵染致病的分子機理及MCP蛋白的作用機制，還為從活細胞水平研究病毒生命活動提供理想的病毒—細胞模型和探針工具，進而為研發(fā)有效的抗病毒手段提供新思路。

病毒在侵染過程中會編碼一些基因以調(diào)節(jié)細胞周期，影響宿主細胞的分裂增殖，最終促進病毒復(fù)制（Xia et al.，2009，2010）。人類巨細胞病毒會通過US27基因產(chǎn)物調(diào)控細胞周期及增強細胞增殖（La-res et al.，2013）。SGIV的ORF51基因能轉(zhuǎn)錄表達腫瘤壞死因子受體（TNFR）類似物，可有效調(diào)節(jié)細胞生長及促進病毒復(fù)制（Yu et al.，2016）。本研究也發(fā)現(xiàn)，SGIV的MCP基因不僅能促進細胞分裂增殖，還可提高SGIV感染壓力下的細胞存活率。故推測MCP蛋白在SGIV的侵染過程中對宿主細胞生長具有一定調(diào)節(jié)作用，能促使SGIV更有效地完成復(fù)制，最終提高病毒滴度和病毒感染力。

4 結(jié)論

SGIV的MCP基因是一個晚期基因，其編碼蛋白主要定位于細胞核附近的胞質(zhì)中，通過促進宿主細胞分裂增殖及病毒復(fù)制，最終提高SGIV的病毒滴度和感染力。

參考文獻：

關(guān)麗雅，黃友華，蔡佳，黃曉紅，秦啟偉. 2013. 石斑魚虹彩病毒ORF050的分子特征和功能初步分析[J]. 水產(chǎn)學報，37（7）：1095-1105. doi：10.3724/SP.J.1231.2013.38537. [Guan L Y，Huang Y H，Cai J，Huang X H，Qin Q W. 2013. Molecular characterization and tentative functional analysis of Singapore grouper iridovirus open reading frame 050（SGIV ORF050）[J]. Journal of Fisheries of China，37（7）：1095-1105.]

李鵬飛，余慶，羅永巨，秦啟偉，劉明珠，肖俊，聶振平. 2019. 廣西水產(chǎn)疫病防控技術(shù)體系建設(shè)與水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)高質(zhì)化生態(tài)發(fā)展展望[J]. 廣西科學院學報，35（3）：161-165. doi：10.13657/j.cnki.gxkxyxb.20190905.003. [Li P F，Yu Q，Luo Y J，Qin Q W，Liu M Z，Xiao J，Nie Z P. 2019. Aquatic diseases control technical system construction and prospects for high-quality ecological development of aquaculture in Guangxi，China[J]. Journal of Guangxi Aca-demy of Sciences，35（3）：161-165.]

李鵬飛，余慶，覃仙玲，李菲，陳憲云，董德信，秦啟偉. 2018. 廣西北部灣海水養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀與病害防控技術(shù)體系研究展望[J]. 廣西科學，25（1）：15-25. doi：10.13656/j.cnki.gxkx.20180125.001. [Li P F，Yu Q，Qin X L，Li F，Chen X Y，Dong D X，Qin Q W. 2018. Current situation and research prospects of disease control technology system of mariculture in Beibu gulf，Guangxi[J]. Guangxi Scien-ces，25（1）：15-25.]

苗素英，何建國，張利紅，曾慷，王曉紅，張旻，江靜波. 2001. 虎紋蛙病毒主要衣殼蛋白基因的克隆及其序列[J]. 水產(chǎn)學報，25（6）：559-563. [Miao S Y，He J G，Zhang L H，Zeng K，Wang X H，Zhang M，Jiang J B. 2001. Cloning，sequence analysis of the major capsid protein gene of newly isolated iridovirus from Rana tigrina[J]. Journal of Fisheries of China，25（6）：559-563.]

秦啟偉，黃曉紅. 2019. 石斑魚虹彩病毒SGIV感染致病的細胞分子基礎(chǔ)及免疫防控對策[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報，40（5）：78-90. doi：10.7671/j.issn.1001-411X.201905083. [Qin Q W，Huang X H. 2019. Pathogenesis of Singapore grouper iridovirus（SGIV） and its immune control strategies[J]. Journal of South China Agricultural University，40（5）：78-90.]

饒穎竹，梁靜真，陳蓉，楊廷寶. 2016. 海水養(yǎng)殖斜帶石斑魚致病性鰻弧菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，47（8）：1416-1422. doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2016.08. 1416. [Rao Y Z，Liang J Z，Chen R，Yang T B. 2016. Isolation，identification and drug sensitivity test of pathoge-nic Vibrio anguillarum from marine cultured Epinephelus coioides[J]. Journal of Southern Agriculture，47（8）：1416-1422.]

王大鵬，曹占旺，謝達祥，甘西. 2012. 石斑魚的研究進展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，43（7）：1058-1065. doi：10.3969/j：issn. 2095-1191.2012.07.1058. [Wang D P，Cao Z W，Xie D X，Gan X. 2012. Research progress in Epinephelus industry[J]. Journal of Southern Agriculture，43（7）：1058-1065.]

蕭楓，張奇亞. 2004. 水生動物虹彩病毒的分子生物學[J]. 水生生物學報，28（2）：202-206. [Xiao F，Zhang Q Y. 2004. Molecular biology of iridoviruses from aquatic animals[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，28（2）：202-206.]

余慶，劉明珠，肖賀賀，吳思婷，董德信，覃仙玲，朱冬琳，陳憲云，陸蘭天，聶振平，羅永巨，李鵬飛. 2019. 珍珠龍膽石斑魚工廠化健康育苗技術(shù)的研究[J]. 廣西科學院學報，35（3）：246-252. doi：10.13657/j.cnki.gxkxyxb.20190903. 009. [Yu Q，Liu M Z，Xiao H H，Wu S T，Dong D X，Qin X L，Zhu D L，Chen X Y，Lu L T，Nie Z P，Luo Y J，Li P F. 2019. Study on industrialized healthy breeding technology of hybrid grouper（Epinephelus fuscoguttatus ♀×E. Lanceolatus ♂）[J]. Journal of Guangxi Academy of Sciences，35（3）：246-252.]

余慶，劉明珠，肖賀賀，易弋，程昊，Dedi Fazriansyah Putra，黎思巧，李鵬飛. 2020. 特異性檢測珍珠龍膽石斑魚虹彩病毒病的核酸適配體的篩選與鑒定[J]. 分析化學，48（5）：650-661. doi：10.19756/j.issn.0253-3820.191647. [Yu Q，Liu M Z，Xiao H H，Yi Y，Cheng H，Putra D F，Li S Q，Li P F. 2020. Selection and characterization of aptamers for specific detection of iridovirus disease in cultured hybrid grouper（Epinephelus Fuscoguttatus ♀×E. Lanceolatus ♂）[J]. Chinese Journal of Analysis Chemistry，48（5）：650-661.]

張顯良，崔利鋒，李書民. 2019. 中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社. [Zhang X L，Cui L F，Li S M. 2019. China fishery statistical yearbook[M]. Beijing：China Agricultural Press.]

曾憲輝，曾令兵，周勇，范玉頂，陳倩，劉文枝，張雪萍，張琳琳. 2015. 大鯢虹彩病毒主衣殼蛋白MCP基因DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫效果[J]. 中國水產(chǎn)科學，22（5）：1055-1067. doi：10.3724/SP.J.1118.2015.15099. [Zeng X H，Zeng L B，Zhou Y，F(xiàn)an Y D，Chen Q，Liu W Z，Zhang X P，Zhang L L. 2015. Construction and immune efficacy of an MCP-containing DNA vaccine for Chinese giant salamander iridovirus[J]. Journal of Fishery Sciences of China，22（5）：1055-1067.]

周小愿，張星朗，賈秋紅，韓亞慧，高宏偉. 2016. 大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白主要抗原表位區(qū)的原核表達及抗血清制備[J]. 細胞與分子免疫學雜志，32（10）：1407-1411. doi：10.13423/j.cnki.cjcmi.007929. [Zhou X Y，Zhang X L，Jia Q H，Han Y H，Gao H W. 2016. Prokaryotic expression and antiserum preparation for major antigenic epitope region of major capsid protein of Chinese giant salamander（Andrias davidianus） iridovirus[J]. Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology，32（10）：1407-1411.]

Caipang C M A，Takano T，Hirono I，Aoki T. 2006. Genetic vaccines protect red seabream，Pagrus major，upon challenge with red seabream iridovirus（RSIV）[J]. Fish & Shellfish Immunology，21（2）：130-138. doi：10.1016/j.fsi. 2005.10.012.

Chinchar V G，Waltzek T B，Subramaniam K. 2017. Ranaviruses and other members of the family Iridoviridae：Their place in the virosphere[J]. Virology，511：259-271. doi：10. 1016/j.virol.2017.06.007.

Chinchar V G，Yu K H，Jancovich J K. 2011. The molecular biology of frog virus 3 and other iridoviruses infecting cold-blooded vertebrates[J]. Viruses，3（10）：1959-1985. doi：10.3390/v3101959.

Fang Q，Shah S，Liang Y H，Zhou H Z. 2005. 3D reconstruction and capsid protein characterization of grass carp reovirus[J]. Science in China. Life Sciences，48（6）：593-600. doi：10.1360/062004-105.

Huang C H，Zhang X B，Gin K Y H，Qin Q W. 2004. In situ hybridization of a marine fish virus，Singapore grouper iridovirus with a nucleic acid probe of major capsid protein[J]. Journal of Virology Methods，117（2）：123-128. doi：10.1016/j.jviromet.2004.01.002.

Huang X H，Huang Y H，Ouyang Z L，Xu L X，Yan Y，Cui H C，Han X，Qin Q W. 2011. Singapore grouper iridovirus，a large DNA virus，induces nonapoptotic cell death by a cell type dependent fashion and evokes ERK signaling[J]. Apoptosis，16（8）：831-845. doi：10.1007/s10495-011-0616-y.

Lares A P，Tu C C，Spencer J V. 2013. The human cytomegalovirus US27 gene product enhances cell proliferation and alters cellular gene expression[J]. Virus Research，176（1）：312-320. doi：10.1016/j.virusres.2013.07.002.

Li P F，Wei S N，Zhou L L，Yang M，Yu Y P，Wei J G，Jiang G H，Qin Q W. 2015. Selection and characterization of novel DNA aptamers specifically recognized by Singapore grouper iridovirus-infected fish cells[J]. Journal of General Virology，96（11）：3348-3359. doi：10.1099/jgv.0. 000270.

Liu Y，Tran B N，Wang F，Ounjai P，Wu J，Hew C L. 2016. Visualization of assembly intermediates and budding va-cuoles of Singapore grouper iridovirus in grouper embryo-nic cells[J]. Scientific Reports，6：18696. doi：10.1038/srep 18696.

Lu L F，Li S，Wang Z X，Du S Q，Chen D D，Nie P，Zhang Y G. 2017. Grass carp reovirus VP41 targets fish MITA to abrogate the interferon response[J]. Journal of Virology，91（14）：e00391-17. doi：10.1128/JVI.00390-17.

Ouyang Z L，Wang P R，Huang Y H，Huang X H，Wan Q J，Zhou S，Wei J G，Zhou Y C，Qin Q W. 2012. Selection and identification of Singapore grouper iridovirus vaccine candidate antigens using bioinformatics and DNA vaccination[J]. Veterinary Immunology and Immunopatho-logy，149（1-2）：38-45. doi：10.1016/j.vetimm.2012.05.021.

Qin Q W，Chang S F，Ngoh-Lim G H，Gibson-Kueh S，Shi C，Lam T J. 2003. Characterization of a novel ranavirus isolated from grouper，Epinephelus tauvina[J]. Disease of Aquatic Organisms，53（1）：1-9. doi：10.3354/dao053001.

Song W J，Qin Q W，Qiu J，Huang C H，Wang F，Hew C L. 2004. Functional genomics analysis of Singapore grouper iridovirus：Complete sequence determination and proteomic analysis[J]. Journal of Virology，78（22）：12576-12590. doi：10.1128/JVI.78.22.12576-12590.2004.

Wang H，Yu F，Li J，Lu L Q. 2016. Laminin receptor is an interacting partner for viral outer capsid protein VP5 in grass carp reovirus infection[J]. Virology，490：59-68. doi：10. 1016/j.virol.2016.01.011.

Whittington R J，Becker J A，Dennis M M. 2010. Iridovirus infections in finfish-critical review with emphasis on ranaviruses[J]. Journal of Fish Diseases，33（2）：95-122. doi：10.1111/j.1365-2761.2009.01110.x.

Xia L Q，Cao J H，Huang X H，Qin Q W. 2009. Characterization of Singapore grouper iridovirus（SGIV） ORF086R，a putative homolog of ICP18 involved in cell growth control and virus replication[J]. Archives of Virology. 154（9）：1409-1416. doi：10.1007/s00705-009-0457-y.

Xia L Q，Liang H Y，Huang Y H，Ouyang Z L，Qin Q W. 2010. Identification and characterization of Singapore grouper iridovirus（SGIV） ORF162L，an immediate-early gene involved in cell growth control and viral replication[J]. Virus Research，147（1）：30-39. doi：10.1016/j.virusres. 2009.09.015.

Xiao H H，Liu M Z，Li S Q，Shi D Q，Zhu D L，Ke K，Xu Y H，Dong D X，Zhu L B，Yu Q，Li P F. 2019. Isolation and characterization of a ranavirus associated with di-sease outbreaks in cultured hybrid grouper（♀ Tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus×♂ Giant grouper E. lanceolatus） in Guangxi，China[J]. Journal of Aquatic Animal Health，31（4）：364-370. doi：10.1002/aah.10090.

Yan Y，Guo C Y，Ni S W，Wei J G，Li P F，Wei S N，Cui H C，Qin Q W. 2015. Singapore grouper iridovirus （SGIV） encoded SGIV-miR-13 attenuates viral infection via modu-lating major capsid protein expression[J]. Virus Research，205（2）：45-53. doi：10.1016/j.virusres.2015.05.010.

Yu Q，Liu M Z，Wei S N，Xiao H H，Wu S T，Ke K，Huang X H，Qin Q W，Li P F. 2019a. Identification of major capsid protein as a potential biomarker of grouper iridovirus-infected cells using aptamers selected by SELEX[J]. Frontiers in Microbiology，10：2684. doi：10.3389/fmicb.2019. 02684.

Yu Q，Liu M Z，Wei S N，Xiao H H，Wu S T，Qin X L，Shi D Q，Li S Q，Wang T X，Li P F. 2019b. Isolation of nervous necrosis virus from hybrid grouper（Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂） cultured in Guangxi，China[J]. Fish Pathology，54（1）：16-19. doi：10. 3147/jsfp.54.16.

Yu Q，Liu M Z，Wu S T，Wei X X，Xiao H H，Yi Y，Cheng H，Wang S W，Zhang Q，Qin Q W，Li P F. 2020. Specific aptamer-based probe for analyzing biomarker MCP entry into Singapore iridovirus-infected host cells via clathrin-mediated endocytosis[J]. Frontiers in Microbiology，11：1206. doi：10.3389/fmicb.2020.01206.

Yu Y P，Huang Y H，Wei S N，Li P F，Zhou L L，Ni S W，Huang X H，Qin Q W. 2016. A tumour necrosis factor receptor-like protein encoded by Singapore grouper iridovirus modulates cell proliferation，poptosis and viral replication[J]. The Journal of General Virology，97（3）：756-766. doi：10.1099/jgv.0.000379.

Zhao Z L，Teng Y，Liu H，Lin X M，Wang K，Jiang Y L，Chen H C. 2007. Characterization of a late gene enco-ding for MCP in soft-shelled turtle iridovirus （STIV）[J].Virus Research，129（2）：135-144. doi：10.1016/j.virusres. 2007.07.002.

（責任編輯 蘭宗寶）