上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性及其耐藥基因檢測分析

高曉華 安偉 張明輝

摘要：【目的】掌握上海地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對蝦源副溶血弧菌的耐藥性及耐藥基因攜帶情況，并明確耐藥表型與耐藥基因間的相關(guān)性，為科學(xué)防控凡納濱對蝦副溶血弧菌病及揭示耐藥機制提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^K-B紙片擴散法檢測21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素的敏感性，采用二倍稀釋法測定高度敏感抗生素對副溶血弧菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），并以PCR檢測其耐藥基因的攜帶情況，包括β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM和blaCARB、磺胺類耐藥基因 Sul II和Sul III、氨基糖苷類耐藥基因strA和strB、四環(huán)素類耐藥基因tetA及 I類整合子inT1基因。【結(jié)果】21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素表現(xiàn)出不同程度的多重耐藥性，六重耐藥1株（4.76%），五重耐藥3株（14.29%），四重耐藥5株（23.81%），三重耐藥8株（38.10%），二重耐藥4株（19.05%）;AMP/PG/SMX和PG/SMX為優(yōu)勢耐藥菌譜。上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對恩諾沙星的敏感率最高（90.48%），對應(yīng)的MIC為0.10～1.60 μg/mL、MBC為3.20～12.80 μg/mL。blaTEM、blaCARB、Sul II、Sul III、strB和inT1等耐藥基因的檢出率分別為23.81%、71.43%、33.33%、19.05%、9.52%和23.81%，未檢測出strA和tetA基因。從21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中共檢出11種耐藥基因型，其優(yōu)勢耐藥基因型有blaCARB（28.57%）、blaCARB-blaTEM（14.29%）、blaCARB-Sul II（14.29%）和Sul III-inT1（9.52%）。除strA基因和tetA基因外，其余耐藥基因與其對應(yīng)抗生素耐藥表型間均存在相關(guān)性，但其相關(guān)性不顯著（P>0.05）。【結(jié)論】上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素表現(xiàn)出不同程度的敏感性，對恩諾沙星的敏感性最高，故可考慮將恩諾沙星作為上海地區(qū)凡納濱對蝦副溶血弧菌病防控的備選藥物。此外，針對對蝦源副溶血弧菌日趨嚴(yán)重的多重耐藥問題，應(yīng)同時加強副溶血弧菌耐藥基因及整合子攜帶情況的監(jiān)測，掌握其流行趨勢，以提高對蝦副溶血弧菌病的防控策略。

關(guān)鍵詞： 凡納濱對蝦;副溶血弧菌;耐藥性;耐藥基因;上海

中圖分類號： S945.49? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）03-0827-10

Resistance of Litopenaeus vannamei from Shanghai to Vibrio parahaemolyticus and detection and analysis of resistance genes

GAO Xiao-hua， AN Wei， ZHANG Ming-hui*

（Shanghai Fisheries Research Institute/Shanghai Fisheries Technical Extension Station， Shanghai? 200433， China）

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for scientific control of Vibrio parahaemolyticus disease in Litopenaeus vannamei and further reveal the antibiotics resistance mechanism of V. parahaemolyticus， the antibiotics resistance and the carrying status of related resistance genes were detected in V. parahaemolyticus isolated from L. vannamei in Shanghai， the correlation between resistance phenotype and resistance genes was also studied. 【Method】The susceptibility of 21 strains of V. parahaemolyticus （isolated from L. vannamei in Shanghai） against 14 common antibiotics were detected by K-B disc diffusion test， and the minimum inhibitory concentration（MIC） and minimum bactericidal concentration（MBC） of more sensitive antibiotics were determined by double dilution method. The carrying statuses of blaTEM and blaCARB of β-lactam resistance genes， Sul II and Sul III of sulfanilamide resistance genes， strA and strB of aminoglycoside resistance genes， tetA of tetracycline resistance genes and inT1 of integrons of class I genes in V. parahaemolyticus were detected by PCR method. 【Result】The 21 strains of V. parahaemolyticus showed multi-drug resistance to 14 antibiotics， which were one strain of resistance manifested to 6（4.76%）， three strains of resistance manifested to 5（14.29%）， five strains of resistance manifested to 4（23.81%）， eight strains of resistance manifested to 3（38.10%） and four strains of resistance manifested to 2（19.05%）. The dominant antibiotic resistance phenotypes were AMP/PG/SMX and PG/SMX. For the sensitivity rates of the tested antibiotics in the strains of V. parahaemolyticus，enrofloxacin was the most sensitive antibiotic（90.48%）. MIC and MBC of enrofloxacin were 0.10-1.60 μg/mL and 3.20-12.80 μg/mL. PCR results of resistance genes showed that the detection rates of gene blaTEM， blaCARB， Sul II， Sul III， strB and inT1 were 23.81%，71.43%，33.33%，19.05%，9.52% and 23.81%， respectively. strA and tetA were not detected . A total of 11 drug-resistant genotypes were detected from 21 strains of V. parahaemolyticus from L. vannamei in Shanghai， the dominant genotypes including blaCARB（28.57%）， blaCARB - blaTEM（14.29%）， blaCARB-Sul II（14.29%） and Sul III-inT1（9.52%）. Except strA and tetA， other resistance genes were correlated with their antibiotic resistance phenotypes， but the correlation was not significant（P>0.05）. 【Conclusion】The strains of V. parahaemolyticus isolated from L. vannamei in Shanghai showed different sensitivity levels to 14 antibiotics， enrofloxacin with the most sensibility. So， enrofloxacin can be considered as an alternative drug for the prevention and control of V. parahaemolyticus in L. vannamei in Shanghai. Besides， to solve the problem of multiple drug resistance of V. parahaemolyticus， detecting drug resistance genes and integrons in V. parahaemolyticus frequently and studying the trends are recognized as the effective strategies in V. parahaemolyticus prevention and control in L. vannamei.

Key words： Litopenaeus vannamei; Vibrio parahaemolyticus;? antibiotics resistance; resistance genes; Shanghai

Foundation item：Youth Talent Growth Plan Project of Shanghai Municipal Agricultural System（Hunongqingzi〔2017〕3-9）

0 引言

【研究意義】副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）為革蘭氏陰性菌，廣泛分布于海洋、河海交匯處及魚蝦貝類等水生動物體內(nèi)，是多種水生動物的條件致病菌（李毅財?shù)龋?012;茆丹，2014）。近年來的研究表明，攜帶有特異質(zhì)粒的副溶血弧菌是引起對蝦急性肝胰腺壞死?。ˋcute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）暴發(fā)的主要原因（Lee et al.，2015）。AHPND可造成養(yǎng)殖對蝦大批量死亡，嚴(yán)重制約對蝦養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展（文國樑等，2015）。目前，抗生素治療仍是防治對蝦副溶血弧菌病的主要手段，但長期使用抗生素極易造成菌株多重耐藥現(xiàn)象加重及環(huán)境污染（Rodríguez-Blanco et al.，2012;Lopatek et al.，2018），已引起從業(yè)者們的高度重視。此外，副溶血弧菌能通過食物鏈傳播給人類，而引起食源性中毒，危及人體健康（陳志蕓等，2015）。因此，加強副溶血弧菌的耐藥性檢測及其耐藥機制研究，對指導(dǎo)人工養(yǎng)殖對蝦副溶血弧菌病科學(xué)防控和維護(hù)人類健康均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】至今，針對人工養(yǎng)殖對蝦及魚源副溶血弧菌的耐藥性問題國外已有較多研究報道（de Melo et al.，2011;Mohamad et al.，2019）;國內(nèi)也有學(xué)者對江蘇（張曉君等，2009）、廣西（黃偉德等，2018）及廣東（劉歡等，2018）等地的蝦源副溶血弧菌分離株進(jìn)行耐藥性研究，并證實不同來源分離株的耐藥程度存在一定差異，部分菌株已出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。細(xì)菌多重耐藥性的形成與菌株攜帶相應(yīng)耐藥基因及耐藥基因可隨質(zhì)?；蛘献拥瓤梢苿舆z傳元件在細(xì)菌間水平傳播的機制密切相關(guān)（Ceccarelli et al.，2006）。blaTEM和blaCARB是β-內(nèi)酰胺類常見耐藥基因，分別位于質(zhì)粒和染色體上（Colomer-Lluch et al.，2011;Chiou et al.，2015）;Sul II和Sul III基因編碼二氫葉酸合成酶，介導(dǎo)細(xì)菌對磺胺類藥物的耐藥性，在質(zhì)粒和染色體上均有檢出（喬毅等，2018）;strA和strB是常見的氨基糖苷類耐藥基因，編碼氨基糖苷類磷酸轉(zhuǎn)移酶（Kitiyodom et al.，2010;劉旭，2016）;tetA基因常位于質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上，介導(dǎo)四環(huán)素類抗生素的耐藥性（Ng et al.，2001）;I類整合子（inT1）在細(xì)菌中最常見，能整合、捕獲外源耐藥基因，且可在細(xì)菌間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移（Hall and Collis，1995）。黃偉德等（2018）通過檢測廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌對常見抗生素的敏感性及其耐藥基因攜帶率，結(jié)果顯示，廣西沿海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對氟苯尼考最敏感，對磺胺二甲嘧啶和青霉素G耐藥性最強，其優(yōu)勢耐藥基因型是ant（3"）-I ?Sul1+tet（A）?TEM ?和ant（3"）-I ?Sul1?tet（A）?TEM ?。趙姝等（2019）通過分析海南、江蘇及山東等地分離自海水患病水產(chǎn)動物源副溶血弧菌喹諾酮類藥物耐藥基因的分布狀況，發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌對喹諾酮類藥物的耐藥表型與基因型存在明顯差異，其中外排泵抑制劑對副溶血弧菌喹諾酮類藥物的耐藥性具有顯著影響。【本研究切入點】目前，有關(guān)凡納濱對蝦源副溶血弧菌的研究主要集中在分離株耐藥性與耐藥基因相關(guān)性方面（黃偉德等，2018;趙姝等，2019;賀曉晨等，2020），但鮮見針對上海地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性及其耐藥基因檢測的相關(guān)研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過K-B紙片擴散法檢測分離自上海地區(qū)凡納濱對蝦源副溶血弧菌對常見抗生素的敏感性，運用PCR檢測副溶血弧菌耐藥基因的攜帶情況，分析耐藥表型與耐藥基因間的相關(guān)性，并測定敏感抗生素對凡納濱對蝦源副溶血弧菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），以期為科學(xué)防控凡納濱對蝦副溶血弧菌病及揭示其耐藥機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 菌株來源

2017—2020年從上海地區(qū)低鹽度淡化對蝦養(yǎng)殖場凡納濱對蝦肝胰腺部位分離得到21株副溶血弧菌，由上海市水產(chǎn)研究所病害防治科鑒定并采用甘油冷凍保存法保存于-80 ℃冰箱中。菌株按分離時間順序分別編號為1～21，菌株來源信息詳見表1。菌株藥敏試驗采用大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC25922為質(zhì)控菌株。

1. 2 主要試劑

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;Muller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基（MHA）購自英國Oxoid公司，瓊脂糖、4S Red Plus核酸染色劑及4種抗生素（恩諾沙星、氟苯尼考、硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素）購自生工生物工程（上海）股份有限公司;PCR Premix Taq、DL2000 DNA Marker及TaKaRa MiniBEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司;14種常見抗生素藥敏紙片均購自英國Oxoid公司，包括青霉素G（PG，10 μg/片）、氨芐西林（AMP，10 μg/片）、磺胺甲噁唑（SMX，100 μg/片）、多西環(huán)素（DO，30 μg/片）、土霉素（OT，30 μg/片）、新霉素（N，30 μg/片）、鏈霉素（S，10 μg/片）、慶大霉素（CN，10 μg/片）、氯霉素（C，30 μg/片）、氟苯尼考（FFC，30 μg/片）、恩諾沙星（ENR，5 μg/片）、諾氟沙星（NOR，10 μg/片）、環(huán)丙沙星（CIP，5 μg/片）、紅霉素（E，15 μg/片），所有藥敏紙片置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 菌株活化

無菌條件下，將-80 ℃保存的副溶血弧菌在室溫解凍后，接種至TSA培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落接種至TSB液體培養(yǎng)基中，再置于30 ℃恒溫?fù)u床（200 r/min）過夜培養(yǎng)，獲得的菌懸液用于藥敏試驗及細(xì)菌基因組DNA提取。

1. 4 藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法檢測21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素的藥敏性，參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSL）抗生素敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，藥敏結(jié)果分別以S（敏感）、I（中介）和R（耐藥）進(jìn)行記錄。

1. 5 最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測定

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選取高度敏感的抗生素，采用試管二倍稀釋法，將抗生素分別加入含2.00 mL無菌TSB培養(yǎng)基的試管中，使其終質(zhì)量濃度分別為0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40、12.80、25.60、51.20、102.40和204.80 μg/mL，并設(shè)陰性對照組（空白無菌TSB培養(yǎng)基），然后接種菌懸液至終濃度為1.0×108 CFU/mL，置于30 ℃恒溫?fù)u床（200 r/min）培養(yǎng)24 h，無菌生長的最高抗生素質(zhì)量濃度即為MIC。從所有無細(xì)菌生長的各試管中分別取100 μL菌懸液，涂布于無菌TSA培養(yǎng)基上，置于30 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，無菌生長的最低抗生素質(zhì)量濃度即為MBC。

1. 6 耐藥基因檢測

1. 6. 1 基因組DNA提取 取適量活化菌懸液置于離心管內(nèi)中，12000 r/min離心2 min，收集菌體，根據(jù)TaKaRa細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明提取各菌株基因組DNA，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行DNA濃度測定， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 6. 2 引物設(shè)計與合成 參照Colomer-Lluch等（2011）、Chiou等（2015）的方法設(shè)計β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM和blaCARB的擴增引物，參照Pei等（2006）的方法設(shè)計磺胺類耐藥基因Sul II和Sul III的擴增引物，參照Kitiyodom等（2010）、劉旭（2016）的方法設(shè)計氨基糖苷類耐藥基因strA和strB的擴增引物，參照Ng等（2001）的方法設(shè)計四環(huán)素類耐藥基因tetA的擴增引物，參照左志晗等（2018）的方法設(shè)計整合子inT1基因的擴增引物，上述所有擴增引物（表2）均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 6. 3 耐藥基因PCR擴增 PCR反應(yīng)體系25.0 μL：PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，細(xì)菌基因組DNA模板2.0 μL，無菌雙蒸水補足至25.0 μL。設(shè)無菌雙蒸水為陰性對照模板。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，退火30 s（具體退火溫度見表2），72 ℃ 60 s，進(jìn)行35個循環(huán);72 ℃ 延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳（130 V，30 min）檢測后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果輸入GenBank中進(jìn)行BLAST比對分析。

1. 7 數(shù)據(jù)分析

耐藥表型與耐藥基因間符合率（%）=攜帶耐藥基因且具有相應(yīng)耐藥表型菌株數(shù)/相應(yīng)耐藥表型菌株總數(shù)×100。菌株耐藥表型和耐藥基因的相關(guān)性采用SPSS 13.0進(jìn)行費爾希精確檢驗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 藥敏試驗結(jié)果

由表3可知，21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素表現(xiàn)出不同程度的多重耐藥性，其中，六重耐藥1株（4.76%），五重耐藥3株（14.29%），四重耐藥5株（23.81%），三重耐藥8株（38.10%），二重耐藥4株（19.05%）。21株副溶血弧菌的耐藥菌譜分別是：AMP/PG/SMX占被檢測菌株總數(shù)的14.29%（3/21），PG/SMX占被檢測菌株總數(shù)的9.52%（2/21），其余依次為AMP/PG/SMX/CIP/S、AMP/PG/SMX/OT/CIP、PG/SMX/S、AMP/PG/CN、PG/E、AMP/PG/S/CN/SMX、AMP/PG/NOR、PG/SMX/CN、PG/AMP、AMP/PG/CN/SMX/E、AMP/PG/S/SMX、PG/SMX/E、PG/SMX/N、PG/SMX/E/S、AMP/PG/S/E和PG/SMX/OT，均占被檢測菌株總數(shù)的4.76%（1/21）。

21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種常見抗生素的耐藥程度也存在一定差異（圖1），對青霉素G、磺胺甲噁唑、氨芐西林的耐藥率分別95.24%、71.43%和61.91%。21株副溶血弧菌對恩諾沙星、氟苯尼考、氯霉素和多西環(huán)素均呈敏感或中介，其中對恩諾沙星的敏感率最高（90.48%），其次為氟苯尼考（85.71%）和氯霉素（85.71%）;對新霉素、土霉素、慶大霉素、鏈霉素、環(huán)丙沙星和諾氟沙星的敏感率介于45.00%～70.00%。大部分上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對紅霉素的敏感性為中介，其中介率為61.91%。

2. 2 MIC和MBC測定結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選取高度敏感且水產(chǎn)養(yǎng)殖中允許使用的4種抗生素（恩諾沙星、氟苯尼考、多西環(huán)素和新霉素）進(jìn)行MIC和MBC測定，結(jié)果表明，恩諾沙星對21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的MIC為0.10～1.60 μg/mL，MBC為3.20～12.80 μg/mL;氟苯尼考對上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的MIC為0.80～25.60 μg/mL，MBC為6.40～51.20 μg/mL;多西環(huán)素對上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的MIC為0.20～12.80 μg/mL，MBC為3.20～25.60 μg/mL;新霉素對上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的MIC為0.80～51.20 μg/mL，MBC為6.40～51.20 μg/mL。這4種抗生素對上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的抑菌效果和殺菌效果排序為恩諾沙星>多西環(huán)素>氟苯尼考>新霉素。

2. 3 耐藥基因檢測結(jié)果

7種常見耐藥基因及I類整合子inT1基因的PCR擴增電泳結(jié)果見圖2。其中，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCARB檢出率分別為23.81%（5/21）和71.43%（15/21）;磺胺類耐藥基因Sul II、Sul III檢出率分別為33.33%（7/21）和19.05%（4/21）;氨基糖苷類耐藥基因strB檢出率為9.52%（2/21），但未檢出strA基因;四環(huán)素類耐藥基因tetA也未檢出;整合子inT1基因檢出率為23.81%（5/21），且inT1陽性菌株均表現(xiàn)為多重耐藥表型，部分副溶血弧菌可同時對青霉素G、氨芐西林、環(huán)丙沙星、磺胺甲噁唑及鏈霉素等5種抗生素表現(xiàn)出耐藥表型。從21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中共檢出11種耐藥基因型，分別為：blaCARB（28.57%）、blaCARB-blaTEM（14.29%）、blaCARB-Sul II（14.29%）、Sul III-inT1（9.52%）、bla-CARB-strB-Sul II-inT1（4.76%）、strB-Sul II-Sul III-inT1（4.76%）、blaCARB-inT1（4.76%）、blaTEM-Sul II（4.76%）、blaCARB-Sul III（4.76%）、blaTEM（4.76%）和Sul II（4.76%）。

2. 4 耐藥表型與耐藥基因型的相關(guān)性

由表4可知，在21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中，青霉素G耐藥表型與blaCARB基因間的符合率為75.00%，與blaTEM基因間的符合率為20.00%;氨芐西林耐藥表型與blaCARB基因間的符合率為69.23%，與blaTEM基因間的符合率為23.08%;土霉素耐藥表型與tetA基因間的符合率為0，由于未檢測出對多西環(huán)素的耐藥菌株，故無法計算多西環(huán)素耐藥表型與tetA基因間的符合率;磺胺甲噁唑耐藥表型與Sul II基因間符合率為40.00%，磺胺甲噁唑耐藥表型與Sul III基因間符合率為20.00%;新霉素、鏈霉素、慶大霉素耐藥表型與strA基因、strB基因間符合率均為0;由于未檢測出strA基因和tetA基因，故無法計算新霉素、鏈霉素和慶大霉素耐藥表型與strA基因間的相關(guān)性，以及土霉素和多西環(huán)素耐藥表型與tetA基因間的相關(guān)性。除strA基因和tetA基因外，其余耐藥基因與其對應(yīng)抗生素耐藥表型間均存在相關(guān)性，但其相關(guān)性不顯著（P>0.05）。

3 討論

近年來，我國學(xué)者針對不同地區(qū)蝦源副溶血弧菌耐藥性問題已開展了系列相關(guān)研究。魏文娟等（2020）對2017—2018年分離自江蘇和福建等地的蝦源副溶血弧菌進(jìn)行耐藥性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些分離株對磺胺甲噁唑的耐藥率為66.70%。本研究結(jié)果表明，21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對磺胺甲噁唑的耐藥率高達(dá)71.43%，究其原因是磺胺甲噁唑因具有廣譜抗菌作用、價格低廉等特點，被長期應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細(xì)菌性疾病防治，隨著時間積累在水體環(huán)境中的殘留問題日漸凸顯。汪濤等（2017）研究認(rèn)為，養(yǎng)殖水環(huán)境中殘留的磺胺類藥物能誘導(dǎo)副溶血弧菌對其產(chǎn)生耐藥性。本研究中，上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對青霉素G和氨芐西林均表現(xiàn)出較高耐藥性，與張曉君等（2009）對江蘇省凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性的研究結(jié)果相似，可能與菌株攜帶能水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥基因有關(guān)（Chiou et al.，2015）。此外，上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對紅霉素、土霉素和新霉素等表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，且多重耐藥比例為80.85%，明顯高于劉旭（2016）檢測2014—2015年分離自上海郊區(qū)弧菌分離株的多重耐藥比例（66.67%），表明副溶血弧菌多重耐藥問題已經(jīng)較嚴(yán)重，且呈逐年持續(xù)增長的趨勢。上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對恩諾沙星的敏感率為90.48%，對應(yīng)的MIC、MBC分別為0.10～1.60和3.20～12.80 μg/mL，即恩諾沙星的抑菌和殺菌效果明顯優(yōu)于其他抗生素，因此可考慮將其作為上海凡納濱對蝦副溶血弧菌病防控的備選藥物，但需謹(jǐn)慎選擇使用濃度，避免大劑量濫用，已減少抗生素殘留誘發(fā)水體細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥的風(fēng)險。

在細(xì)菌耐藥表型與耐藥基因型相關(guān)性的研究中，喬毅等（2018）研究認(rèn)為Sul基因通過編碼產(chǎn)生二氫葉酸合成酶，促使細(xì)菌失去對磺胺類藥物的敏感性，而介導(dǎo)細(xì)菌對磺胺類藥物耐藥。本研究結(jié)果表明，磺胺甲噁唑耐藥表型與Sul II和Sul III基因間的符合率分別為40.00%和20.00%，但在攜帶Sul基因（Sul II和Sul III）的10株副溶血弧菌中僅有2株對磺胺甲噁唑中介，說明Sul基因與副溶血弧菌對磺胺類耐藥表型間并非完全對應(yīng)，可能與不同來源副溶血弧菌體內(nèi)耐藥基因的拷貝量及耐藥基因有效表達(dá)程度存在差異有關(guān)。在本研究中，上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌的blaTEM基因檢出率為23.81%，高于廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌的檢出率（13.30%）（黃偉德等，2018），但低于寧波地區(qū)副溶血弧菌的檢出率（91.47%）（吳蓓蓓等，2011）;blaCARB基因檢出率高達(dá)71.43%，青霉素G、氨芐西林耐藥表型與bla-CARB基因間的符合率分別為75.00%和69.23%，青霉素G、氨芐西林耐藥表型與blaTEM基因間的符合率分別為20.00%和23.08%，說明上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌blaCARB基因產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶（CARB），可能是介導(dǎo)副溶血弧菌對青霉素G和氨芐西林耐藥的主要原因，也提示blaCARB基因在采樣區(qū)的養(yǎng)殖蝦塘內(nèi)已廣泛流行，而養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌是加速耐藥基因傳播的主要媒介。tetA基因是四環(huán)素類耐藥基因，其編碼產(chǎn)生的膜蛋白tetA可特異性將細(xì)菌胞內(nèi)的四環(huán)素類藥物泵到胞外，以降低胞內(nèi)藥物濃度，介導(dǎo)細(xì)菌對四環(huán)素類的耐藥性（Miranda et al.，2003）。在21株上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中均未檢測到tetA基因，但仍有9.25%的試驗菌株對四環(huán)素類抗生素耐藥，與黃偉德等（2018）對廣西蝦源副溶血弧菌的研究結(jié)果相似。四環(huán)素類藥物耐藥機理除了tetA基因介導(dǎo)的外排泵耐藥機制外，還存在tetM和tetX等基因介導(dǎo)的四環(huán)素類鈍化及核糖體保護(hù)等其他作用機制（梁靜真等，2018;黃雪龍等，2019）。因此，上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對四環(huán)素類的耐藥表型是否由其他耐藥基因介導(dǎo)產(chǎn)生尚有待進(jìn)一步探究。strA和strB基因編碼產(chǎn)生鏈霉素鈍化酶，介導(dǎo)細(xì)菌對鏈霉素的耐藥性（楊元斌等，2011）。strB基因在上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中的檢出率為9.52%，對鏈霉素、新霉素、慶大霉素的耐藥率分別為28.57%、23.81%和19.05%，耐藥基因與耐藥表型間的符合率為0。楊明偉等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，在魚源鏈球菌中鏈霉素耐藥表型與ant（3'）-I基因間的符合率高達(dá)75.00%，氨基糖苷類的耐藥基因還包括aac（3'）-Ib、aph（3'）-Ia及aac（6'）-Ib等。本研究僅檢測strA基因和strB基因有一定局限性，今后應(yīng)增加耐藥基因不同類型的檢測，而更有利于揭示菌株耐藥基因與耐藥表型間的相關(guān)性。inT1基因在上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌中的檢出率為23.81%，與李林桂（2013）、姚小娟（2014）的研究結(jié)果存在明顯差異，且攜帶inT1基因的菌株均出現(xiàn)多重耐藥表型，可能與整合子具有整合、捕獲外源耐藥基因的特性相關(guān)（Hall and Collis，1995）。因此，針對對蝦源副溶血弧菌日趨嚴(yán)重的多重耐藥問題，應(yīng)同時加強副溶血弧菌耐藥基因及整合子攜帶情況的監(jiān)測，掌握其流行趨勢，以提高對蝦副溶血弧菌病的防控策略。

本研究還發(fā)現(xiàn)，上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對抗生素的耐藥表型與耐藥基因間的相關(guān)性并不顯著，究其原因可能是：①不同來源菌株的基因拷貝量存在明顯差異，以致部分低拷貝量的耐藥基因不能被檢出（石優(yōu)章等，2007）。②細(xì)菌外膜蛋白參與啟動菌體的主動藥物外排系統(tǒng)，減少胞內(nèi)藥物濃度而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥（Matsuo et al.，2007）。③不同菌株耐藥基因轉(zhuǎn)錄與翻譯受其啟動子類別、強弱及距啟動子距離等多種因素的影響。如blaTEM基因位于質(zhì)粒上，其上游啟動子有P3、P4及Pa/Pb等不同類別，尤其是P4啟動子能有效促進(jìn)blaTEM基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)（Lartigue et al.，2002）。④菌株耐藥表型還由其他耐藥基因介導(dǎo)產(chǎn)生，當(dāng)菌株所處環(huán)境不利于其生長時，可通過整合外源耐藥基因，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)以適應(yīng)環(huán)境變化（袁璐等，2014）。⑤抗生素能誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥形成，如嗜水氣單胞菌在多次低抑菌濃度的鹽酸沙拉沙星刺激下，可誘導(dǎo)產(chǎn)生對鹽酸沙拉沙星高耐藥性的菌株（黃新財?shù)龋?013）。綜上所述，菌株對抗生素的耐藥表型受諸多因素影響，且大部分耐藥基因可在菌株間水平傳播，勢必增加凡納濱對蝦副溶血弧菌病的防控難度和風(fēng)險。因此，加強副溶血弧菌耐藥性及其耐藥基因的監(jiān)測，可為科學(xué)防控凡納濱對蝦副溶血弧菌病及揭示其耐藥機制提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

上海凡納濱對蝦源副溶血弧菌對14種抗生素表現(xiàn)出不同程度的敏感性，對恩諾沙星的敏感性最高，故可考慮將恩諾沙星作為上海凡納濱對蝦副溶血弧菌病防控的備選藥物。此外，針對對蝦源副溶血弧菌日趨嚴(yán)重的多重耐藥問題，應(yīng)同時加強副溶血弧菌耐藥基因及整合子攜帶情況的監(jiān)測，掌握其流行趨勢，以提高對蝦副溶血弧菌病的防控策略。

參考文獻(xiàn)：

陳志蕓，施春雷，周秀娟，張茜，周敏，王大鵬，史賢明. 2015. 上海市售海產(chǎn)品中副溶血性弧菌的分布狀況[J]. 中國食品學(xué)報，15（8）：196-202. doi：10.16429/j.1009-7848.2015. 08.028. [Chen Z Y，Shi C L，Zhou X J，Zhang Q，Zhou M，Wang D P，Shi X M. 2015. Distribution status of Vi-brio parahaemolyticus in seafood markets of Shanghai[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology，15（8）：196-202.]

賀曉晨，韓書煜，黎姍梅，胡大勝，黃德生，吳偉鋒，黃鈞，梁靜真，胡庭俊. 2020. 廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性及其整合子—基因盒檢測[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，33（4）：893-900. doi：10.16213/j.cnki.scjas.2020.4.032. [He X C，Han S Y，Li S M，Hu D S，Huang D S，Wu W F，Huang J，Liang J Z，Hu T J. 2020. Detection of antibiotic resi-stance and integron-gene cassettes in Vibrio parahaemolyticus from Litopenaeus vannamei in Guangxi[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，33（4）：893-900.]

黃偉德，肖雙燕，黎姍梅，黃德生，張振豪，鐘昌艷，陳福彩，梁毅，梁靜真，黃鈞. 2018. 廣西凡納濱對蝦源副溶血弧菌耐藥性和耐藥基因的檢測[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，31（9）：1979-1988. doi：10.16213/j.cnki.scjas.2018.9.034. [Huang W D，Xiao S Y，Li S M，Huang D S，Zhang Z H，Zhong C Y，Chen F C，Liang Y，Liang J Z，Huang J. 2018. Detection of antibiotics resistance and resistance genes in Vibrio parahaemolyticus from Litopenaeus vannamei of Guangxi[J]. Southwest China Journal of Agricultural Scien-ces，31（9）：1979-1988.]

黃新財，彭民毅，黃鈞，胡大勝，彭亞，黃艷華，施金谷，溫華成，韋貴花. 2013. 黃顙魚源嗜水氣單胞菌對鹽酸沙拉沙星耐藥性獲得與消失速率的測定[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，44（10）：1731-1734. doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2013. 10.1731. [Huang X C，Peng M Y，Huang J，Hu D S，Peng Y，Huang Y H，Shi J G，Wen H C，Wei G H. 2013. Acquisition and vanishing rate of drug resistance of Aeromonas hydrophila in Pelteobagrus fulvidraco against sarafloxacin hydrochloride[J]. Journal of Southern Agriculture，44（10）：1731-1734.]

黃雪龍，單敏，陳燁，劉玲俐，何晶，王小蘭，于圣青，羅廷榮，涂劍，李濤. 2019. 鴨疫里默氏桿菌Tet（X）基因原核表達(dá)及其功能鑒定[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，50（4）：844-850. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.04.23. [Huang X L，Shan M，Chen Y，Liu L L，He J，Wang X L，Yu S Q，Luo T R，Tu J，Li T. 2019. The prokaryotic expression and function identification of Tet（X） gene in Riemerella anatipestifer[J]. Journal of Southern Agriculture，50（4）：844-850.]

李林桂. 2013. 海水弧菌耐藥性I類整合子分析與副溶血弧菌分子分型研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué). [Li L G. 2013. Study on class I antibiotic resistance integrons of Vibrios and multilocus sequence typing of Vibrio parahaemolyticus[D]. Yaan：Sichuan Agricultural University.]

李毅財，趙峰，朱蘭蘭，趙曉君，周德慶. 2012. 黃渤海區(qū)域貝類中副溶血弧菌污染調(diào)查及血清學(xué)分型[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，43（2）：241-244. doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2012. 02.241. [Li Y C，Zhao F，Zhu L L，Zhao X J，Zhou D Q. 2012. Investigations on contamination and serotype of Vibrio parahaemolyticus in shellfish obtained from Ye-llow Sea and Bohai Sea areas[J]. Journal of Southern Agriculture，43（2）：241-244.]

梁靜真，黃立春，韋慕蘭，馬沙，黎姍梅，文衍紅，蒙蘭麗，黃維，黃松，黃鈞. 2018. 廣西羅非魚源無乳鏈球菌耐藥性及其四環(huán)素耐藥基因檢測[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，49（10）： 2077-2086. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2018.10.26. [Liang J Z，Huang L C，Wei M L，Ma S，Li S M，Wen Y H，Meng L L，Huang W，Huang S，Huang J. 2018. Detection of antibiotics resistance and tetracycline resistance genes in Streptococcus agalactiae from tilapia in Guangxi[J]. Journal of Southern Agriculture，49（10）：2077-2086.]

劉歡，謝婷，何美珊，丁楠，鐘青萍. 2018. 廣州市售海產(chǎn)品中副溶血弧菌分離菌株的鑒定及其耐藥性分析[J]. 食品與發(fā)酵工程，44（11）：28-34. doi：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.017408. [Liu H，Xie T，He M S，Ding N，Zhong Q P. 2018. Isolation， identification and antibiotic resistance analysis of Vibrio parahaemolyticus in seafood from Guangzhou[J]. Food and Fermentation Industries，44（11）：28-34.]

劉旭. 2016. 海水養(yǎng)殖源弧菌耐藥性調(diào)查及qnrVC基因在弧菌中的流行情況研究[D]. 上海：上海海洋大學(xué). [Liu X. 2016. Investigation on antimicrobial resistance and the prevalence of qnrVC gene in Vibrios from mariculture sources[D]. Shanghai：Shanghai Ocean University.]

茆丹. 2014. 不同來源副溶血弧菌分子分型及其毒力基因篩查[D]. 上海：上海交通大學(xué). [Mao D. 2014. Molecular typing and virulence genes screening of Vibrio parahaemolyticus from different sources[D]. Shanghai：Shanghai Jiao Tong University.]

喬毅，沈輝，萬夕，王李寶，史文軍，黎慧，蔣葛，范賢平，張建明. 2018. 異育銀鯽源嗜水氣單胞菌對磺胺類耐藥性分析[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，37（4）：456-463. doi：10.16378/j.cnki. 1003-1111.2018.04.004. [Qiao Y，Shen H，Wang X，Wang L B，Shi W J，Li H，Jiang G，F(xiàn)an X P，Zhang J M. 2018. Drug resistance of Aermonas hydrophila isolate from allogyogenetic silver crucian carp Carassius auratus gibelio to sulfonamides[J]. Fisheries Science，37（4）：456-463.]

石優(yōu)章，宋啟發(fā)，徐景野，金春光，楊元斌. 2007. O139群霍亂弧菌β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)耐藥基因檢測及分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，17（8）：1390-1391. doi：10.3969/j.issn.1004-8685.2007.08.017. [Shi Y Z，Song Q F，Xu J Y，Jin C G，Yang Y B. 2007. Study of β-lactamase related resistance genes in Vibrio cholerae O139 serogroup[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology，17（8）：1390-1391.]

汪濤，楊再福，陳勇航，孫冉冉，張姚姚，王亞楠. 2017. 磺胺類抗性基因的產(chǎn)生及演變研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境污染與防治，39（11）：1251-1255. doi：10.15985/j.cnki.1001-3865.2017. 11.019. [Wang T，Yang Z F，Chen Y H，Sun R R，Zhang Y Y，Wang Y N. 2017. Review on the production and evolution of sulfonamide resistance genes[J]. Environmental Pollution & Control，39（11）：1251-1255.]

魏文娟，趙姝，王元，周俊芳，李新蒼，房文紅. 2020. 副溶血弧菌養(yǎng)殖對蝦分離株耐藥性及耐藥基因分析[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，16（1）：9-16. doi：10.12131/20190165. [Wei W J，Zhao S，Wang Y，Zhou J F，Li X C，F(xiàn)ang W H. 2020. Detection of antibiotics resistance and distribution of resistance genes in Vibrio parahaemolyticus from cultured shrimp[J]. South China Fisheries Science，16（1）：9-16.]

文國樑，曹煜成，徐煜，胡曉娟，徐武杰，李卓佳. 2015. 養(yǎng)殖對蝦肝胰腺壞死綜合癥研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，42（11）：118-123. doi：10.16768/j.issn.1004-874x.2015.11. 022. [Wen G L，Cao Y C，Xu Y，Hu X J，Xu W J，Li Z J. 2015. Review on hepatopancreas necrosis syndrome of shrimp[J]. Guangdong Agricultural Science，42（11）：118-123.]

吳蓓蓓，俞盈，金培婕，方維煥. 2011. 寧波地區(qū)海產(chǎn)品及環(huán)境中副溶血弧菌主要毒力及耐藥性分析[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，27（5）：381-385. [Wu B B，Yu Y，Jin P J，F(xiàn)ang W H. 2011. Analysis of major virulence and antibiotics resistance in Vibrio parahaemolyticus isolates from environment and seafood in Ningbo of Zhejiang Province[J]. Chinese Journal of Zoonoses，27（5）：381-385.]

楊明偉，韋慕蘭，羅福廣，黎姍梅，黃立春，李明，呂小麗，王強，米強，梁靜真，黃鈞. 2018. 羅非魚源無乳鏈球菌對氨基糖苷類耐藥性及耐藥基因檢測[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，31（11）：2438-2444. doi：1016213/j.cnki.scjas.2018.11.035. [Yang M W，Wei M L，Luo F G，Li S M，Huang L C，Li M，Lü X L，Wang Q，Mi Q，Liang J Z，Huang J. 2018. Resistance and related genes detection of tilapia Streptococcus agalactiae against aminoglycosides[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，31（11）：2438-2444.]

楊元斌，宋啟發(fā)，徐景野，金春光，閆鵬. 2011. O139群霍亂弧菌耐藥譜和相關(guān)耐藥基因研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，21（5）：1070-1072. [Yang Y B，Song Q F，Xu J Y，Jin C G，Yan P. 2011. Study of resistance patterns and related resistance genes in O139-Serogroup Vibrio cholrae[J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology，21（5）：1070-1072.]

姚小娟. 2014. 海水養(yǎng)殖源弧菌耐藥性檢測與整合子分析[D]. 上海：上海海洋大學(xué). [Yao X J. 2014. Drug resistance detection and integrons analysis of Vibrios from mariculture source[D]. Shanghai：Shanghai Ocean University.]

袁璐，劉紅波，鄒雅如，許歡，陳體，漆涌，伍勇. 2014. 細(xì)菌整合子調(diào)控機制中啟動子的作用研究進(jìn)展[J]. 臨床檢驗雜志，32（8）：603-605. doi：10.13602/j.cnki.jcls.2014.08. 13. [Yuan L，Liu H B，Zou Y R，Xu H，Chen T，Qi Y，Wu Y. 2014. Research progress on the role of promoters in the regulation mechanism of bacterial integrons[J]. Chinese Journal of Clinical Laboratory Science，32（8）：603-605.]

張曉君，陳翠珍，閻斌倫，房海，秦國民，徐靜. 2009. 凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）病原副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的表型及分子特征[J]. 海洋與湖沼，40（5）：654-662. [Zhang X J，Chen C Z，Yan B L，F(xiàn)ang H，Qin G M，Xu J. 2009. Phenotypic and molecular characterization of pathogenic Vibrio parahaemolyticus isolated from Litopenaeus vannamei[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica，40（5）：654-662.]

趙姝，李健，馬立才，劉旭，王元，房文紅. 2019. 海水養(yǎng)殖動物源弧菌喹諾酮類藥物耐藥表型與基因型分析[J]. 海洋漁業(yè)，41（4）：463-471. doi：10.13233/j.cnki.mar.fish.2019. 04.008. [Zhao S，Li J，Ma L C，Liu X，Wang Y，F(xiàn)ang W H. 2019. Analysis of phenotype and genetype in quinolone resistance in Vibrio from mairculture[J]. Marine Fishe-ries，41（4）：463-471.]

左志晗，李艷紅，邵迎春，耿緒云，董學(xué)旺，孫金生. 2018. 天津市周邊地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對蝦腸道菌株的分離鑒定及耐藥性分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報，42（5）：797-807. doi：10.11964/jfc.20170410809. [Zuo Z H，Li Y H，Shao Y C，Geng X Y，Dong X W，Sun J S. 2018. Isolation，identification and antibiotic resistance analysis of intestinal strains of aquaculture Litopenaeus vannamei in surrounding areas of Tianjin[J]. Journal of Fisherier of China，42（5）：797-807.]

Ceccarelli D，Salvia A M，Sami J，Cappuccinelli P，Colombo M M. 2006. New cluster of plasmid-located class 1 integrons in Vibrio cholerae O1 and a dfrA15 cassette-containing integron in Vibrio parahaemolyticus isolated in Angola[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，50（7）：2493-2499. doi：10.1128/AAC.01310-05.

Chiou J C，Li R C，Chen S. 2015. CARB-17 family of β-lactamases mediates intrinsic resistance to penicillins in Vibrio parahaemolyticu[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，59（6）：3593-3595. doi：10.1128/AAC.00047-15.

Colomer-Lluch M，Jofre J，Muniesa M. 2011. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples[J]. PLoS One，6（3）：e17549. doi：10. 1371/journal.pone.0017549.

de Melo L M R，Almeida D，Hofer E，Reis C M F D，Theophilo G N D，Santos A F M，Vieira R H S D F. 2011. Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus isolated from pond-reared Litopenaeus vannamei marke-ted in natal，brazil[J]. Brazilian Journal of Microbiology，42（4）：1463-1469. doi：10.1590/S1517-83822011000400 0032.

Hall R M，Collis C M. 1995. Mobile gene cassettes and integrons：Capture and spread of genes by site-pecific recombination[J]. Molecular Microbiology，15（4）：593-600. doi：10.1111/j.1365-2958.1995.tb02368.x.

Kitiyodom S，Khemtong S，Wongtavatchai J，Chuanchuen R. 2010. Characterization of antibiotic resistance in Vibrio spp. isolated from farmed marine shrimps（Penaeus mono-don）[J]. FEMS Microbiology Ecology，72（2）：219-227. doi：10.1111/j.1574-6941.2010.00846.x.

Lartigue M F，Leflon-Guibout V，Poirel L，Nordmann P，Nicolas-Chanoine M H. 2002. Promoters P3，Pa/Pb，P4，and P5 upstream from bla（TEM） genes and their relationship to beta-lactam resistance[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，46（12）：4035-4037. doi：10.1128/aac.46.12. 4035-4037.2002.

Lee C T，Chen I T，Yang Y T，Ko T P，Huang Y T，Huang J Y，Huang M F，Lin S J，Chen C Y，Lin S S，Lightner D V，Wang H C，Wang A H J，Wang H C，Hor L I，Lo C F. 2015. The opportunistic marine pathogen Vibrio arahaemolyticus becomes virulent by acquiring a plasmid that expresses a deadly toxin[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，112（34）：10798-10803. doi：10.1073/pnas.1503129112.

Lopatek M，Wieczorek K，Osek J. 2018. Antimicrobial resistance，virulence factors，and genetic profiles of Vibrio parahaemolyticus from seafood[J]. Applied and Environmental Microbiology，84（16）：e00537-18. doi：10.1128/AEM.00537-18.

Matsuo T，Hayashi K，Morita Y，Koterasawa M，Ogawa W，Mizushima T，Tsuchiya T，Kuroda T. 2007. VmeAB，an RND-type multidrug efflux transporter in Vibrio parahaemolyticus[J]. Microbiology，153（12）：4129-4137. doi：10. 1099/mic.0.2007/009597-0.

Miranda C D，Kehrenberg C，Ulep C，Schwarz S，Roberts M C. 2003. Diversity of tetracycline resistance genes in bacteria from Chilean salmon farms[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，47（3）：883-888. doi：10.1128/aac.47.3. 883-888.2003.

Mohamad N，Amal M N A，Saad M Z，Yasin I S M，Zulkiply N A，Mustafa M，Nasruddin N S. 2019. Virulence-associa-ted genes and antibiotic resistance patterns of Vibrio spp. isolated from cultured marine fishes in Malaysia[J]. BMC Veterinary Research，15（1）：176. doi：10.1186/s12917-019- 1907-8.

Ng L K，Martin，Alfa M，Mulvey M. 2001. Multiplex PCR for the detection of tetracycline resistant genes[J]. Mole-cular and Cellular Probes，15（4）：209-215. doi：10.1006/mcpr.2001.0363.

Pei R T，Kim S C，Carlson K H，Pruden A. 2006. Effect of river landscape on the sediment concentrations of antibiotics and corresponding antibiotic resistance genes （ARG）[J]. Water Research，40（12）：2427-2435. doi：10. 1016/j.watres.2006.04.017.

Rodríguez-Blanco A，Lemos M L，Osorio C R. 2012. Integra-ting conjugative elements as vectors of antibiotic，mercuy，and quaternary ammonium compound resistance in marine aquaculture environments[J]. Antimicrobial Agents and Chemitherapy，56（5）：2619-2626. doi：10.1128/AAC. 05997-11.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）