甲基化轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3在急性心肌梗死患者外周血中的表達(dá)及對缺氧缺血所致心肌細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)作用▲

周 鈺 白峰華 張 君 詹 峰 董小莉 吳 奎

(海南省人民醫(yī)院1 入院服務(wù)中心，2 科教處，3 急診ICU病房，4 心血管內(nèi)科，?？谑?570311，電子郵箱：zho38763@163.com；5 海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，?？谑?571199)

心肌梗死是全球人類死亡的主要原因之一。急性心肌梗死的特點是冠狀動脈突發(fā)性缺血缺氧，引起心肌細(xì)胞凋亡、壞死，從而導(dǎo)致不可逆的心肌組織損傷[1-2]。盡管已有研究報告了多種信號通路參與心肌細(xì)胞凋亡，包括活性氧、蛋白激酶C、絲裂原活化蛋白激酶和核因子κB信號通路等[3-5]，但心肌梗死以及其他與缺氧缺血相關(guān)的急性心臟疾病的分子機(jī)制仍不完全清楚。

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)修飾是真核mRNA中最普遍的內(nèi)部修飾[6]。盡管m6A修飾存在于成千上萬個具有獨特分布模式的RNA轉(zhuǎn)錄物[7]，但其在大多數(shù)RNA修飾中的功能仍然未知。在哺乳動物細(xì)胞中，m6A的修飾可被甲基化轉(zhuǎn)移酶樣蛋白(methyltransferase-like protein，METTL)3和METTL14等甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化[8]。而且METTL3在哺乳動物中發(fā)揮著多種生物學(xué)功能，例如調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄剪接、控制蛋白質(zhì)翻譯等[9-11]。研究表明，METTL3可調(diào)節(jié)缺血再灌注小鼠心肌細(xì)胞的自噬和凋亡[12]，但其對急性缺血缺氧的人心肌細(xì)胞損傷的調(diào)節(jié)效果仍不清楚。本研究探討m6A-METTL3在心肌梗死患者體內(nèi)的表達(dá)情況，以及對缺氧/缺血(hypoxia/ischemia，HI)心肌細(xì)胞凋亡和自噬的影響，并分析METTL3在急性心肌損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年1月至2019年12月于我院診治的60例急性心肌梗死患者(心肌梗死組)的外周血樣本。心肌梗死組的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《急性心肌梗死診斷和治療指南》[13]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)患者發(fā)病后5 h內(nèi)入院。心肌梗死組的排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝、腎功能障礙者；(2)近6個月有手術(shù)史及重大創(chuàng)傷史者；(3)瓣膜性疾病、急性腦血管疾病患者；(4)自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病患者；(5)合并其他可能影響本研究結(jié)果的疾病者。心肌梗死組中男性35例、女性25例，年齡35～77(53.93±3.69)歲。另從我院體檢中心收集同期60例健康體檢者(健康對照組)的外周血。健康對照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：未患明顯疾病(如特異性感染、骨骼疾病、腫瘤、心臟疾病等疾病)的健康成年人。健康對照組的排除標(biāo)準(zhǔn)：肥胖、殘疾、精神疾病、腫瘤、結(jié)核病以及患其他系統(tǒng)疾病者。健康對照組中男性36例、女性24例，年齡32～79(52.91±3.82)歲，兩組研究對象的年齡和性別比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得所有患者和體檢者的知情同意。

1.2 血液標(biāo)本的采集和處理 收集心肌梗死患者入院4 h內(nèi)的血液標(biāo)本4 mL，及健康對照組體檢抽血后4 h內(nèi)的余血標(biāo)本4 mL。使用抗凝管(肝素抗凝)獲得血漿，然后以3 000 r/min的速度離心15 min，獲取血清。血清和血漿分別置于1.5 mL的EP管中，保存于-20℃環(huán)境中待檢。

1.3 試劑與耗材 TRIzol試劑盒購于美國英杰公司(批號：15596-026)；PrimeScriptTMRT Master Mix和LipofecamineTM2000試劑盒購于德國Eurofins MWG Operon公司(批號：PKD446、200917003)；人心肌細(xì)胞AC16購于通派(上海)生物科技有限公司并經(jīng)專業(yè)認(rèn)證資源鑒定通過。SYBR qPCR Mix和細(xì)胞計數(shù)試劑8(cell counting kit-8，CCK-8)均購于日本TaKaRa公司(批號：201719001)；磷酸酶檢測試劑盒購于中國建城生物工程公司(批號：06104008A)。二辛可寧酸試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司(批號：02093011X)。聚偏二氟乙烯膜購于美國Millipore公司(批號：15630002)。METTL3酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司(批號：201651002)。溶酶體抑制劑巴佛洛霉素A1(批號：ab120497)、兔抗人METTL3(批號：ab195352)、激活型天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase,cleaved-Caspase3；批號：ab32042)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2；批號：ab182858)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax；批號：ab32503)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ；批號：ab232940)、自噬通量減少的標(biāo)志物人死骨片1(sequestosome 1，SQSTM1；批號：ab109012)的第一抗體和第二抗體(批號：ab150077)均購于美國Abcam公司。小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)的構(gòu)建和合成均由上海吉瑪公司完成。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和HI細(xì)胞模型的構(gòu)建和處理 將AC16細(xì)胞在37℃和5% CO2的條件下培養(yǎng)于含5%胎牛血清和青霉素-鏈霉素(100 μg/mL)的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)中，24 h換液一次，48～36 h傳代一次。將傳代后的對數(shù)期AC16細(xì)胞分為5組，包括對照組、HI-2h組、HI-4h組、siMETTL3+HI-2h組、siNC+HI-2h組。對照組AC16細(xì)胞不進(jìn)行任何處理。HI-2h組、HI-4h組AC16細(xì)胞分別進(jìn)行2 h和4 h的低血清(1%胎牛血清)和低氧(1% O2、5% CO2、94% N2)的HI處理。siMETTL3+HI-2h組AC16細(xì)胞在經(jīng)siMETTL3(有效沉默METTL3的siRNA序列)轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)一步行HI處理2 h。siNC+HI-2h組AC16細(xì)胞在siNC(siMETTL3的陰性對照序列)轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)一步行HI處理2 h。在檢測AC16細(xì)胞自噬通量蛋白的實驗中，將終濃度為50 nmol/L的溶酶體抑制劑巴佛洛霉素A1添加到DMEM中，其余處理方式不變，檢測自噬標(biāo)記蛋白水平。

1.5 熒光定量PCR檢測血漿METTL3 mRNA相對表達(dá)水平 使用TRIzol試劑盒提取兩組研究對象血漿中的總RNA，并使用紫外分光光度計檢測RNA的濃度。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒的操作說明，在以下反應(yīng)條件下合成cDNA：40℃持續(xù)6 min，65℃持續(xù)25 min。將cDNA產(chǎn)物儲存在-80℃冰箱中，用于定量PCR。反應(yīng)體系為20 μL：2 μL cDNA產(chǎn)物，0.4 μL 50×ROX，10 μL SYBR qPCR Mix，0.8 μL上游引物和0.8 μL下游引物，補(bǔ)充RNase水至20 μL。反應(yīng)條件：首先在95℃下預(yù)變性1 min，隨后進(jìn)行以下反應(yīng)：95℃下變性30 s，60℃退火40 s，總共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，每個實驗設(shè)置3個復(fù)孔，并將所有樣品重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt計算METTL3 mRNA的相對表達(dá)水平。所有操作均在冰上進(jìn)行。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 ELISA法檢測血清METTL3表達(dá)水平 使用ELISA法檢測兩組研究對象外周血清METTL3表達(dá)水平，操作方法嚴(yán)格按照劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 CCK-8法測定AC16細(xì)胞增殖率 取1.4中分組處理后的AC16細(xì)胞，將其以每孔1×103個的密度重新接種到96孔板中，使用含5%胎牛血清和青霉素-鏈霉素(100 μg/mL)的DMEM在37℃和5% CO2的條件下培養(yǎng)0、12、24、48 h。將CCK-8試劑以10%的最終濃度添加到每個孔中，避光孵育1 h。采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的吸光度值。細(xì)胞增殖率=(觀察組吸光度值-空白管吸光度值)/(陰性對照組吸光度值-空白管吸光度值)×100%。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測AC16細(xì)胞凋亡率 取1.4中分組處理后的AC16細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌兩次，5 min/次，并使用1 mL流式緩沖溶液重懸細(xì)胞使細(xì)胞密度為1×106/mL。將100 μL細(xì)胞懸液添加到5 mL流量管中，隨后添加10 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素染色和10 μL碘化丙錠染色，避光、室溫下孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀(美國安捷倫生物科技有限公司)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.9 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)水平 取1.4中分組處理后的AC16細(xì)胞，加入200 μL M-PERTM裂解液(美國賽默飛公司，批號：78503)，冰上裂解30 min，1 500 r/min離心10 min取上清。根據(jù)二辛可寧酸法測定蛋白的濃度。在變性條件下，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離20 μg總蛋白，并將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。將膜封閉在5%脫脂牛奶中，隨后給予抗METTL3(1 ∶600)、cleaved-Caspase3(1 ∶800)、Bax(1 ∶700)、Bcl-2(1 ∶400)、LC3B-Ⅱ(1 ∶600)、SQSTM1(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶5 000)的一抗4℃孵育過夜，并使用Tris緩沖鹽溶液和Tween 20洗滌膜。隨后將膜與二抗(1 ∶2 000)在室溫下孵育2 h，并用Tween 20洗滌。通過使用增強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光試劑可以觀察到蛋白條帶。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，使用Image J軟件分析條帶的灰度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 使用GraphPad Prism軟件(5.0版)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以(x±s)表示。多組間的比較采用方差分析，其中兩兩比較使用LSD-t檢驗，兩組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對象血漿METTL3 mRNA的相對表達(dá)水平、血清METTL3表達(dá)水平的比較 心肌梗死組血漿METTL3 mRNA相對表達(dá)水平、血清METTL3表達(dá)水平均高于健康對照組(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組研究對象血漿METTL3 mRNA相對表達(dá)水平、血清METTL3表達(dá)水平的比較(x±s)

2.2 敲低METTL3對體外急性HI心肌細(xì)胞增殖的影響 培養(yǎng)0 h時，5組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)12 h、24 h、48 h時，HI-2h組、HI-4h組、siMETTL3+HI-2h、siNC+HI-2h組細(xì)胞增殖率均低于對照組(P<0.05)，siMETTL3+HI-2h組細(xì)胞增殖率均高于HI-2h組、siNC+HI-2h組(均P<0.05)。見表3。

表3 5組AC16細(xì)胞增殖率的比較(x±s，%)

2.3 敲低METTL3對體外急性HI心肌細(xì)胞凋亡的影響 (1)HI-2h組、HI-4h組、siNC+HI-2h組AC16 細(xì)胞的凋亡率高于對照組(均P<0.05)，而siMETTL3+HI-2h組與對照組的凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。siMETTL3+HI-2h組AC16細(xì)胞凋亡率低于siNC+HI-2h組和HI-2h組(均P<0.05)。見表4和圖1。(2)與對照組比較，HI-2h組、HI-4h組、siNC+HI-2h組的cleaved-Caspase3表達(dá)水平，以及HI-2h組、HI-4h組、siMETTL3+HI-2h組、siNC+HI-2h組的Bax/Bcl-2 比值均升高(均P<0.05)，siMETTL3+HI-2h組與對照組的cleaved-Caspase3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；siMETTL3+HI-2h組cleaved-Caspase3表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值均低于HI-2h組和siNC+HI-2h組(P<0.05)。見表5和圖2。

表4 5組AC16細(xì)胞凋亡率的比較(x±s，%)

圖1 各組AC16細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果

2.4 敲低METTL3對體外急性HI心肌細(xì)胞METTL3蛋白表達(dá)水平的影響 HI-2h組、HI-4h組、siNC+HI-2h組的METTL3蛋白表達(dá)水平均高于對照組(均P<0.05)，但siMETTL3+HI-2h組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。HI-4h組的METTL3蛋白表達(dá)水平高于HI-2h組(P<0.05)，siMETTL3+HI-2h組的METTL3蛋白表達(dá)水平低于HI-2h組和siMETTL3+HI-2h組(均P<0.05)。見表6和圖2。

表6 5組AC16細(xì)胞METTL3蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

圖2 5組細(xì)胞各蛋白表達(dá)情況

2.5 敲低METTL3對體外急性HI心肌細(xì)胞自噬通量的影響 與對照組相比，HI-2h組、HI-4h組及siNC+HI-2h組的LC3B-Ⅱ表達(dá)水平均下調(diào)，而HI-2h組、HI-4h組、siMETTL3+HI-2h組以及siNC+HI-2h組SQSTM1表達(dá)水平均上調(diào)(均P<0.05)；與HI-2h組比，HI-4h組的SQSTM1表達(dá)水平上調(diào)(均P<0.05)；與HI-2h組和siNC+HI-2h組比，siMETTL3+HI-2h組的LC3B-Ⅱ表達(dá)水平上調(diào)，而SQSTM1表達(dá)水平下調(diào)(均P<0.05)。見表7和圖2。

表7 5組AC16細(xì)胞自噬通量相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，心肌梗死組血漿中METTL3的mRNA相對表達(dá)水平均高于健康對照組(P<0.05)，提示心肌梗死的發(fā)生可能與METTL3的表達(dá)有關(guān)。

盡管METTL3介導(dǎo)的m6A修飾具有重要的生物學(xué)意義，然而，目前對METTL3如何調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和基因的表達(dá)的研究仍較少。本研究中， siMETTL3+HI-2h組細(xì)胞增殖率均高于HI-2h組、siNC+HI-2h組(P<0.05)，提示沉默METTL3的表達(dá)可以恢復(fù)HI心肌細(xì)胞的增殖，這也表明METTL3可能參與調(diào)節(jié)HI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖抑制。另外，研究表明HI還可以通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡促進(jìn)心肌細(xì)胞損傷[5]。cleaved-Caspase3和Bax/Bcl-2比值是心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵標(biāo)志物[14]。本研究中，與對照組比較，HI-2h組和HI-4h組的心肌細(xì)胞的增殖率均降低，METTL3蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、cleaved-Caspase3水平和Bax/Bcl-2比值均增加(P<0.05)，提示METTL3可能參與調(diào)節(jié)HI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的凋亡和增殖抑制。Song等[12]的研究表明，過表達(dá)METTL3可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡，使用短發(fā)夾RNA敲低METTL3表達(dá)后，缺氧復(fù)氧模型小鼠心肌細(xì)胞的凋亡明顯降低。本研究使用siRNA技術(shù)敲低METTL3的表達(dá)，結(jié)果顯示，與HI-2h組和siNC+HI-2h組比較，siMETTL3+HI-2h組AC16細(xì)胞凋亡率、cleaved-Caspase3表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值均降低(P<0.05)，表明沉默METTL3表達(dá)可以抑制HI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

SQSTM1蛋白是自噬通量減少的標(biāo)志物，LC3B-Ⅱ蛋白是自噬標(biāo)志物[15]。研究顯示，在體內(nèi)和體外抑制細(xì)胞自噬，能引起細(xì)胞凋亡的增加[16]?；诒狙芯坑^察到的沉默METTL3表達(dá)對心肌細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步檢測了HI及沉默METTL3對心肌細(xì)胞自噬標(biāo)記物和自噬通量的影響。結(jié)果顯示，HI-2h組和HI-4h組AC16心肌細(xì)胞的LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)水平低于對照組，而SQSTM1蛋白表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)；當(dāng)敲低METTL3表達(dá)后HI心肌細(xì)胞LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)增加，而SQSTM1蛋白的表達(dá)降低(P<0.05)。以上結(jié)果與既往研究[17]相似，提示METTL3具有抑制心肌細(xì)胞自噬的作用，而敲低METTL3可以上調(diào)HI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的細(xì)胞自噬通量。自噬信號通路哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)-1的下游轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)在轉(zhuǎn)錄水平對細(xì)胞自噬具有關(guān)鍵調(diào)控作用[18]，而有研究表明過表達(dá)METTL3可以明顯抑制TFEB表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞的自噬水平，而敲低METTL3可通過上調(diào)內(nèi)源性TFEB水平來抑制mTOR的磷酸化，從而促進(jìn)自噬[19]，且TFEB已被證明可抑制mTOR活性[20]。以上結(jié)果表明METTL3是心肌細(xì)胞自噬的負(fù)調(diào)控因子。

綜上所述，m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶METTL3在心肌梗死患者體內(nèi)和HI誘導(dǎo)的急性心肌細(xì)胞損傷模型中的表達(dá)均升高，沉默METTL3可以抑制HI心肌細(xì)胞的凋亡并增加自噬通量，促進(jìn)細(xì)胞增殖的恢復(fù)。METTL3或可作為急性缺血缺氧性疾病的潛在診斷和治療靶點。