中國(guó)彝族人群p表型家系分析及新A4GALT等位基因鑒定*

賀坤華 蘇品璨 許先國(guó) 林裕翔 徐路瓊 徐銀霞 趙瑜 馬麗瓊

2011年國(guó)際輸血協(xié)會(huì)（ISBT）已將P血型系統(tǒng)重新命名為P1PK血型系統(tǒng)（編號(hào)003），P1PK血型系統(tǒng)包括Pl（003001）、PK（003002）及NOR抗原（003004）；Globside血型系統(tǒng)僅有P抗原（028001）；LKE抗原（209003）、PX2抗原（209004）則歸入GLOB血型集合，也稱糖苷脂集合[1-3]。p表型表現(xiàn)為患者紅細(xì)胞上P、P1和PK、LKE這4種抗原全部缺失（null），因此其極易產(chǎn)生抗體[4，5]。

p表型在中國(guó)人群中極為罕見(jiàn)，在中國(guó)香港篩選100萬(wàn)人才發(fā)現(xiàn)1例[6]。目前國(guó)內(nèi)有10余例的p表型報(bào)道，但對(duì)其分子機(jī)制研究甚少[7]。研究顯示A4GALT編碼的酶催化合成P1和PK抗原，B3GALNT1控制P抗原，A4GALT基因第3外顯子發(fā)生變異導(dǎo)致氨基酸改變時(shí)，可能會(huì)引起α1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶失活，導(dǎo)致P1、PK及其下游 P、LKE抗原丟失形成p表型[8]。

我們通過(guò)對(duì)1個(gè)p表型彝族家系的血清學(xué)和相關(guān)的A4GALT和B3GALNT1基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)導(dǎo)致p表型的新的A4GALTc.456-457insACACCCC等位基因，闡明p表型形成的分子遺傳機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 標(biāo)本來(lái)源 患者（先證者），女，25歲，孕12周，彝族，無(wú)輸血史，云南曲靖人?；颊咴诘谝惶ピ?周時(shí)自然流產(chǎn)，反復(fù)檢查均未查明流產(chǎn)原因，現(xiàn)第2次懷孕來(lái)我院產(chǎn)檢，做血型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)ABO血型正反定型不一致，丈夫?yàn)闈h族，其余家系成員為彝族，均為云南曲靖人。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)并簽署知情同意書(shū)后，采集患者及家系成員血樣，EDTA-K2抗凝管和促凝管各5 mL，用于血清學(xué)檢測(cè)和基因檢測(cè)。

2 儀器和試劑 A B O D E血型檢測(cè)卡（批號(hào)20190911）、Rh分型卡（批號(hào)20191017）、抗球蛋白檢測(cè)卡（批號(hào)20191017）、ABO血型反定型試劑盒（批號(hào)20191007）、抗篩細(xì)胞（批號(hào)20190823）、2-Me（批號(hào)20190501）均由長(zhǎng)春博迅生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；抗人球蛋白試劑（批號(hào)20190209）、抗-H（批號(hào)20190707），抗-P1（批號(hào)20190130）、抗-M（批號(hào)20191031）、抗-N（批號(hào)20191204），均由上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)；譜細(xì)胞（批號(hào)20191020）、紅細(xì)胞稀有血型基因分型試劑盒（批號(hào)20191109）、商用稀有血型測(cè)序試劑盒（批號(hào)20191018）均由江蘇中濟(jì)萬(wàn)泰生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；人源抗-Tja、人p表型紅細(xì)胞均由浙江省血液中心提供；TD-A型血型血清學(xué)用離心機(jī)、FYQ型免疫微柱孵育器（長(zhǎng)春博研科學(xué)儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)）；KA-2200型離心機(jī)（日本久保田生產(chǎn)）；SSW-600-2S型電熱恒溫水浴槽由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)。所有試劑均在有效期內(nèi)。

3 血型鑒定、直接抗球蛋白試驗(yàn)、抗體篩查及鑒定均按說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn)介紹方法[9]進(jìn)行。

4 家系調(diào)查 對(duì)先證者及父母、丈夫、同胞、表姐、姑母、侄兒等共34人進(jìn)行家系調(diào)查。

5 分子生物學(xué)檢測(cè) 紅細(xì)胞稀有血型基因分型采用熒光定量PCR法；同時(shí)采用商用稀有血型測(cè)序試劑盒對(duì)A4GALT和B3GALNT1進(jìn)行Sanger測(cè)序。A4GALT、B3GALNT1基因擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物純化、PCR產(chǎn)物直接序列分析參照相關(guān)文獻(xiàn)[4，7]。序列比對(duì)分析采用GENEWIZ軟件，測(cè)序結(jié)果與A4GALT（Gen Bank AJ245581）和B3GALNT1（Gen Bank AB050855）參考序列進(jìn)行比對(duì)，以確定單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）。

結(jié) 果

1 血清學(xué)檢查結(jié)果 先證者及其哥哥ABO正定型為B型，反定型發(fā)現(xiàn)其血清與A、B、O標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞反應(yīng)均為陽(yáng)性，懷疑有意外抗體。抗體鑒定發(fā)現(xiàn)先證者及其哥哥血清與篩選細(xì)胞和譜細(xì)胞反應(yīng)均陽(yáng)性且凝集強(qiáng)度一致，在鹽水試驗(yàn)中均出現(xiàn)2+凝集、在抗人球介質(zhì)中均出現(xiàn)3+s凝集，直抗和自身對(duì)照陰性，可與自身抗體區(qū)分，并懷疑有高頻抗原抗體。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該抗體能在室溫反應(yīng)5 min后或37℃溫育后引起紅細(xì)胞溶血，結(jié)合先證者的紅細(xì)胞表型，可以排除抗-H、抗-I等IgM抗體的特異性；進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)，先證者及其哥哥血清與人p表型紅細(xì)胞反應(yīng)陰性；細(xì)胞與人源抗-PP1PK血清反應(yīng)陰性，說(shuō)明先證者及哥哥均是罕見(jiàn)的p表型，其血清中均含有能與所有非p表型紅細(xì)胞反應(yīng)的抗-PP1PK抗體。采用EDTA-2K抗凝血漿與抗篩細(xì)胞和譜細(xì)胞反應(yīng)均有凝集反應(yīng)，而無(wú)溶血反應(yīng)，提示該抗體具有補(bǔ)體活性。血清經(jīng)2-Me處理后鹽水試驗(yàn)陰性，IAT試驗(yàn)陽(yáng)性，說(shuō)明該抗體具有IgM和IgG的性質(zhì)，這些均符合抗-PP1PK特異性（血清學(xué)檢查結(jié)果與昆明市血液中心和浙江省血液中心結(jié)果一致）。

2 先證者紅細(xì)胞稀有血型基因分型結(jié)果 CCDee, LW（a+b-）, Fy（a+b-）, Jk（a+b-）, MMSs Mur-,Di（a-b+）, Wr（a-b+）, kk, Kp（a-b+）, Co（a+b-）, Do（a+b-）, Au（a+b+）, Yt（a+b-）。

3 家系調(diào)查結(jié)果 先證者（27）及其哥哥（28）為罕見(jiàn)p表型，其他家系成員為正常的P1或P2表型（圖1）?；驍y帶情況詳見(jiàn)圖注。

4A4GALT和B3GALNT1測(cè)序結(jié)果 測(cè)序結(jié)果顯示（圖2），先證者及其哥哥為A4GALT456-457insACACCCC（Bank IT：MG812384）純合突變。同時(shí)在該家系中發(fā)現(xiàn)6例456-457insACACCCC雜合突變，7例109 A＞G和987G＞A雜合突變，3例IVS+228C＞T雜合突變。其他家系成員A4GALT序列與正常參考序列（Gen Bank AJ245581）相同；所有家系成員B3GALNT1序列均與參考序列（Gen Bank AB050855）完全一致，即在該基因上未發(fā)現(xiàn)任何堿基突變。

圖1 先證者家系圖

討 論

研究表明A4GALT基因（也稱CD77合成酶基因）突變可導(dǎo)致p表型[10，11]。A4GALT基因定位于22q11.2-q13.2，基因組全長(zhǎng)為29500 bp，有3個(gè)外顯子，其中外顯子1長(zhǎng)25 bp，外顯子2長(zhǎng)141 bp，外顯子3長(zhǎng)1876 bp，開(kāi)始密碼子和基因編碼區(qū)都位于第3外顯子上，編碼353個(gè)氨基酸。目前國(guó)際上發(fā)現(xiàn)的與p表型相關(guān)的A4GALT基因突變已達(dá)到52個(gè)，大多數(shù)都發(fā)生在外顯子3上[1]，突變類型包括單核苷酸突變、核苷酸插入或缺失等[4]。

使用經(jīng)典的血清學(xué)方法檢測(cè)血型，必須依賴大量的標(biāo)準(zhǔn)抗血清，稀有血型抗血清難以獲得且價(jià)格昂貴[12]。本研究中采用熒光定量PCR法進(jìn)行紅細(xì)胞稀有血型基因分型，可用1份DNA標(biāo)本檢測(cè)多個(gè)血型系統(tǒng)的多種抗原，也可檢出稀有血型和輔助檢測(cè)高頻抗原抗體[13]?；蚍中徒Y(jié)果排除了常見(jiàn)的高頻抗原抗體，包括Jknull、RH變異體、Fya-、Dib-、LWa-、Colton和Domcrock，但不排除JMH、Vel、Lan、Lutheran和p。進(jìn)一步采用人p表型紅細(xì)胞和人源抗-PP1PK血清等血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果充分說(shuō)明先證者及哥哥均是罕見(jiàn)的p表型。

家系基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，所有家系成員B3GALNT1序列均與正常參考序列相同，而先證者及其哥哥A4GALT基因編碼區(qū)存在c.456-457insACACCCC純合突變。我們將該序列在NCBI (National Center for Biotechnology Information, NCBI )基因庫(kù)中進(jìn)行Blast搜索，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相同的等位基因；進(jìn)一步與ISBT、ERYTHROGENE數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，沒(méi)有找到相同序列。已知文獻(xiàn)中未發(fā)現(xiàn)關(guān)于該突變的報(bào)道，因此我們將c.456-457insACACCCC突變序列作為新的A4GALT等位基因上報(bào)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)并取得登記號(hào)（Bank IT:MG812384）。c.456-457insACACCCC突變導(dǎo)致開(kāi)放閱讀框移碼，從第156個(gè)氨基酸開(kāi)始發(fā)生序列改變，終止于第283個(gè)氨基酸。突變基因翻譯的氨基酸鏈與野生型（353個(gè)氨基酸）相比，只有前155個(gè)氨基酸是相同的，如此大的氨基酸序列改變將引起多肽鏈空間折疊構(gòu)象的改變，進(jìn)而引起酶活性喪失，導(dǎo)致酶催化產(chǎn)物P1和Pk抗原及其下游的P、LKE抗原不能正常合成而形成p表型。

圖2 A4GALT基因序列圖譜（突變位點(diǎn)由紅框和箭頭標(biāo)示）

家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)，先證者及其哥哥均為c.456-457insACACCCC純合突變，其父母均為c.456-457insACACCCC突變攜帶者，因而推測(cè)先證者及哥哥分別繼承了父母的突變基因，從而導(dǎo)致p表型，另有4名家系成員也攜帶此突變，但所有c.456-457insACACCCC雜合子均表現(xiàn)為非p表型。此外該家系中檢出的7例109A＞G和987G＞A雜合突變，3例IVS+228C＞T雜合突變也未產(chǎn)生p表型，只有純合子才表現(xiàn)罕見(jiàn)的p表型, 且p表型往往在同代中出現(xiàn)，表明其遺傳方式為常染色體隱性遺傳[14]。

對(duì)A4GALT基因中SNPs的系統(tǒng)研究表明[15]，A4GALT基因的差異性表達(dá)，是P1/P2血型的分子遺傳基礎(chǔ)，其中P1個(gè)體中的A4GALT表達(dá)水平高于P2個(gè)體。同時(shí)有研究顯示[16]，單個(gè)堿基插入（A4GALT/insC）會(huì)降低A4GALT活性。至于109A＞G和987G＞A、IVS+228C＞T突變是否會(huì)影響酶活性，目前尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。另外，多名家系成員同時(shí)攜帶109A＞G和987G＞A突變，而大部分家系成員同時(shí)不攜帶109A＞G和987G＞A突變，未檢測(cè)到只攜帶其中一種突變的個(gè)體，因而推測(cè)109A＞G和987G＞A是發(fā)生在同一等位基因上的兩種突變。鑒于實(shí)驗(yàn)條件限制，未進(jìn)一步采用克隆測(cè)序進(jìn)行證實(shí)。本研究從多名家系成員中檢出多種A4GALT基因突變，說(shuō)明該家系具有豐富的A4GALT基因多態(tài)性。因條件限制，本次未能深入進(jìn)行體外表達(dá)及酶活性研究，然而從先證者表現(xiàn)為p表型的事實(shí)可以推測(cè)c.456-457insACACCCC突變可造成αl，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性喪失。綜上所述，我們首次在彝族家系中發(fā)現(xiàn)的A4GALT基因c.456-457insACACCCC突變導(dǎo)致了p表型的形成。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，云南第1例p表型是由濟(jì)寧市中心血站耿微[5]發(fā)現(xiàn)的，患者系云南少數(shù)民族婦女，31歲，無(wú)輸血史，孕2產(chǎn)2，因產(chǎn)后出血需要輸血而進(jìn)行血型鑒定和交叉配血時(shí)被發(fā)現(xiàn)。此后昆明市血液中心也在云南發(fā)現(xiàn)了1例p表型[17]，系女性，24歲，佤族，為無(wú)償獻(xiàn)血者。云南是中國(guó)少數(shù)民族種類最多的省份，人口在6000人以上的世居少數(shù)民族有25個(gè)。全省少數(shù)民族人口數(shù)達(dá)1621.26萬(wàn)人，其中彝族是云南少數(shù)民族中人口最多的一個(gè)民族，主要分布在滇東北、滇中和滇北廣大地區(qū)。由于民族遷徙和融合，云南彝族可能存在獨(dú)特的遺傳背景，進(jìn)一步采用大樣本研究其血型多態(tài)性，將有助于稀有血型資料庫(kù)建立。（致謝：感謝臺(tái)大附屬醫(yī)院輸血科張志昇教授對(duì)本研究的指導(dǎo)和幫助?。?/p>

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突