大黃?蟲丸對TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞增殖的影響

蔣鋒利，蔡 松，任士杰，孫文麗，張 晶，趙明鏡，張立山

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院呼吸科，北京 100029）

關(guān)鍵字：肺絡(luò)干血；IPF；含藥血清；EMT；cck-8

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一種病因不明、慢性進(jìn)展、致死性間質(zhì)性肺疾病，以肺組織中存在“成纖維細(xì)胞灶”為特征，它是由成纖維細(xì)胞在內(nèi)的間充質(zhì)細(xì)胞聚集體和能表達(dá)a-SMA，并能促進(jìn)有絲分裂及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）分泌增加的肌成纖維細(xì)胞構(gòu)成[1]。該病隸屬于中醫(yī)“肺痿”“肺痹”范疇，病性為本虛標(biāo)實(shí)。武維屏、姜良鐸為代表的肺病專家提出“肺系絡(luò)病”理論，將本病病機(jī)概括為“氣虛血瘀、痰熱互結(jié)、痹阻肺絡(luò)”[2-3]。基于以上認(rèn)識，本課題組提出“特發(fā)性肺纖維化患者存在肺絡(luò)干血”的假說，認(rèn)為“肺絡(luò)干血是肺纖維化病因，細(xì)胞外基質(zhì)沉積是干血實(shí)質(zhì)”[4]。針對“干血”一證，張仲景治以“緩中補(bǔ)虛”之大黃?蟲丸，尤在涇將本方治法概括為“潤以濡其干，蟲以動其瘀，通以去其閉”，此實(shí)為仲景治療“干血”的三大法門。研究[5]證實(shí)大黃?蟲丸對博來霉素致特發(fā)性肺纖維化大鼠的保護(hù)作用可能通過抑制MMP-2 的產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)選擇吡非尼酮作為陽性對照藥，通過制備不同濃度大黃?蟲丸含藥血清，對獲取的TGF-β1干預(yù)48h 后A549 細(xì)胞進(jìn)行Masson 染色，使用cck-8 法觀察24 h、48 h、72 h大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1干預(yù)后的A549 細(xì)胞增殖情況的影響，探索大黃?蟲丸對IPF 防治作用的更多內(nèi)在機(jī)制，進(jìn)一步豐富捜剔肺絡(luò)法防治特發(fā)性肺纖維化的學(xué)術(shù)內(nèi)涵。

1 材料與方法

1.1 動物與細(xì)胞健康SD 雄性大鼠60 只，體質(zhì)量250～300 g。由北京維通利華試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，SPF/VAF 級，許可證號：SCXK（京）2016－0006。人肺泡上皮A549 細(xì)胞株（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，北京）。

1.2 藥物及試劑大黃?蟲丸（國藥準(zhǔn)字：Z11020002，批號：17013170），購自北京同仁堂；吡非尼酮膠囊（國藥準(zhǔn)字：H20133376，批號：190505），購自北京康蒂尼藥業(yè)。均在常溫干燥處保存。DMEM/F-12培養(yǎng)基（Biological Industries），F(xiàn)BS（Biological Industries），重組人TGF-β1（PeproTech），0.25%Trypsin EDTA（Biological Industries），PBS（Biological Industries），青-鏈霉素（Caisson Labs），cck-8（北京北仁化學(xué)），戊巴比妥鈉（中國醫(yī)藥北京公司）。

1.3 主要儀器超凈工作臺FLC-3型（哈爾濱市東聯(lián)），二氧化碳培養(yǎng)箱MC0175 型（日本SANYO），離心機(jī)5417R 型（德國Eppendorf），倒置顯微鏡CKX41 型（日本OLYMPUS），全景掃描儀Pannoramic MIDI 型（匈牙利3D HISTECH），酶標(biāo)儀352 型（芬蘭Thermo Multiskan MS）。

1.4 方法

1.4.1 大黃?蟲丸含藥血清的制備及保存 SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，參考盧磊[6]等人方法，按人與動物等效劑量換算法，分別算得大黃?蟲丸高、中、低及吡非尼酮給藥劑量為1.8、0.9、0.4 5、0.18 mg·kg-1·d-1，以上劑量分別各給10 只SD 大鼠灌服，每日1 次，持續(xù)7 d。末次給藥1 h 后，3%戊巴比妥鈉（0.15 mL·100 g-1）腹腔內(nèi)麻醉，無菌條件腹主動脈取血，冰上靜置2 h，4℃，3 000 r·min-1離心15 min 取上清，分裝并標(biāo)記，56℃滅活30 min，-80 ℃快速凍固保存，待用。剩余20 只SD 大鼠灌以等量等滲鹽水，以同樣方法制備空白血清并保存，待用。

1.4.2 IPF 細(xì)胞模型的建立 參照Kasai H 等的方法復(fù)制特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞模型[7]。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組（K 組）、模型組（M 組）。收集對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104·mL-1，每孔2 mL接種于12 孔板，2 組均設(shè)3 個復(fù)孔，邊緣孔用無菌PBS 填充，37 ℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)24 h，換用無血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換液，K 組每孔加入2 mL 培養(yǎng)基，M 組每孔加入2 mL 含TGF-β1（5 ng·mL-1）培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下拍照，見圖1。

1.4.3 Masson 染色 重復(fù)1.4.2 中分組及實(shí)驗(yàn)過程，獲取TGF-β1（5 ng·mL-1）干預(yù)48 h 后A549 細(xì)胞。0.01 mol·L-1無菌PBS 將K 組、M 組分別洗板3 次×2 min，4%的多聚甲醛室溫固定15 min，0.01 mol·L-1無菌PBS 將K 組、M 組分別洗板3 次×2 min，常規(guī)Masson 染色后，全景掃描儀記錄圖像，見圖2。

1.4.4 實(shí)驗(yàn)分組及cck8 法觀察各組細(xì)胞生長情況 選擇吡非尼酮作為陽性對照藥。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組（K組）、模型組（M 組）、西藥組（P 組）、模型+大黃?蟲丸含藥血清大劑量組（D 組）、模型+大黃?蟲丸含藥血清中劑量組（Z 組）、模型+大黃?蟲丸含藥血清小劑量組（X組）。收集對數(shù)生長期A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5×104·mL-1，每孔100 uL 接種于96 孔板，各組均設(shè)6 個復(fù)孔，邊緣孔用0.01 mol·L-1無菌PBS 填充，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h 后，換用無血清DMEM/F-12 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 uL 對應(yīng)的10%含藥血清及含5 ng·mL-1的TGF-β1培養(yǎng)基。分別于24 h、48 h、72 h 后，盡量吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，統(tǒng)一加入含10% cck-8無血清培養(yǎng)基100 uL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，酶標(biāo)儀450 nm 波長處檢測并記錄OD 值，計算各實(shí)驗(yàn)組增殖率，過程需注意避光。增殖率（%）=（給藥組-空白組）OD 值/空白組OD 值×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析，滿足正態(tài)分布且方差齊的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用LSD，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞模型的鑒定倒置顯微鏡下，M 組A549 細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)，形態(tài)逐漸由鵝卵石狀變?yōu)樯扉L的紡錘形或梭形，細(xì)胞圓形度降低，與成纖維細(xì)胞、肌纖維母細(xì)胞形態(tài)相似。圖1 為TGF-β1干預(yù)A549 細(xì)胞48 h 細(xì)胞形態(tài)。Masson 三色染色法是膠原纖維染色經(jīng)典而又權(quán)威的技術(shù)方法。該法染色原理與陰離子燃料分子的大小和組織的滲透有關(guān)，小分子量易穿透結(jié)構(gòu)致密、滲透性低的組織；而大分子量則只能進(jìn)入結(jié)構(gòu)疏松、滲透性高的組織。因此Masson染色后肌纖維呈紅色，膠原纖維呈綠色或藍(lán)色，胞核呈藍(lán)褐色。圖2 為TGF-β1干預(yù)A549 細(xì)胞48 h 后Masson 染色結(jié)果，結(jié)合圖1 說明發(fā)生EMT，即特發(fā)性肺纖維化細(xì)胞模型成功。

圖1 TGF-β1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞48 h（白光片，×400）

圖2 TGF-β1 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞48 h 后Masson 染色（全景掃描儀，×400）

2.2 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖率影響見表1。

表1 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖率影響（，n=6） %

表1 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖率影響（，n=6） %

注：與K 組比較，正值為促進(jìn)作用，負(fù)值為抑制作用

2.3 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖OD 值影響見表2。

表2 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖OD 值影響（，n=6）

表2 大黃?蟲丸含藥血清對TGF-β1 干預(yù)后A549 細(xì)胞的增殖OD 值影響（，n=6）

注：與P 組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與K 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與M 組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

3 討論

如表1、表2 中所示結(jié)果，24 h 時，K 組所得OD值最高，且與其他各組比較均有顯著性差異（P＜0.01），可能與經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后A549 細(xì)胞發(fā)生EMT，部分肺腺癌細(xì)胞變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞后，增殖能力降低有關(guān)；各組所得增殖率依次為Z 組、X 組、M 組、D 組、P 組，各組對比有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P≥0.05），提示TGF-β1干預(yù)24 h 后A549 細(xì)胞未發(fā)生EMT，可認(rèn)為是特發(fā)性肺纖維化發(fā)病早期。48 h 時，K 組所得OD值均高于其他各組，且與之相比均有顯著性差異（P＜0.01）；各組所得增殖率依次為M組、Z組、X組、P組、D 組，與M 組相比，除Z 組無統(tǒng)計學(xué)意義外，其他各組均有顯著性差異，提示TGF-β1干預(yù)48 h 后A549 細(xì)胞部分發(fā)生EMT[8]，可認(rèn)為是特發(fā)性肺纖維化發(fā)病中期，各藥物組對該期特發(fā)性肺纖維化保護(hù)作用較早期明顯。72 h 時，K 組所得OD 值仍最高，但與M 組無統(tǒng)計學(xué)差異，可能與A549 細(xì)胞生長過快，培養(yǎng)基消耗太多，影響其增殖有關(guān)；各組所得增殖率依次為M組、D 組、Z 組、P 組、X 組，與M 組相比，X 組、P組有顯著性差異，提示TGF-β1干預(yù)72 h 后的A549 細(xì)胞已全部發(fā)生EMT，可認(rèn)為是特發(fā)性肺纖維化發(fā)病晚期，各藥物組對本期特發(fā)性肺纖維化保護(hù)作用最明顯，且以X 組最優(yōu)。

24 h 時，K 組與其他組比較均有顯著性差異，且48 h、72 h 時，P 組、D 組、Z 組及X 組對TGF-β1干預(yù)后A549 細(xì)胞增殖率均不同程度高于M 組。提示各實(shí)驗(yàn)組不僅不同程度阻斷或逆轉(zhuǎn)了TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，對A549 細(xì)胞也具有一定殺傷作用，即吡非尼酮與大黃?蟲丸亦具有不同程度的抗腫瘤效用[9-10]，亦從實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證了中醫(yī)“一方多病”的科學(xué)[11-12]。原文方后注曰“上十二味，煉蜜和丸小豆大，酒飲服五丸，日三服”[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，為方便對大鼠進(jìn)行灌胃，由“丸”改“湯”，亦未用酒，得到大黃?蟲丸抗纖維化作用以中小劑量使用為佳的結(jié)果。臨床應(yīng)用本方時，用量選擇上自不能以此作為主要依據(jù)，仍需臨證綜合考量。

EMT 在多種病理過程中發(fā)揮著重要作用，它可能是致病間充質(zhì)細(xì)胞主要來源[14]。TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及ECM形成等生物活性[15-16]，被認(rèn)為是誘導(dǎo)包括肺在內(nèi)諸多臟器纖維化的“主開關(guān)”[17]。TGF-β1首先被描述為正常乳腺上皮細(xì)胞中發(fā)生EMT 的誘導(dǎo)劑[18]，之后的研究中，TGF-β1作為EMT 誘導(dǎo)劑在包括肝臟、腎近端小管、晶狀體等上皮細(xì)胞中亦被證實(shí)[19]。在特發(fā)性肺纖維化動物模型中，模型組TGF-β1分泌量顯著高于正常組，并加速了特發(fā)性肺纖維化的疾病進(jìn)程[20-21]，在體外可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，促進(jìn)EMT，保護(hù)成纖維細(xì)胞免于凋亡和促進(jìn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生[22]。

在特發(fā)性肺纖維化進(jìn)展過程中，肺泡及氣道上皮中均發(fā)現(xiàn)EMT 存在，其中，肺泡上皮（AEC）是肺纖維化的主要致病介質(zhì)[23-24]?？紤]到AEC 損傷在特發(fā)性肺纖維化過程中的重要作用及可塑性，前期關(guān)于體內(nèi)外發(fā)生EMT 潛力的相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，小鼠AEC 和AT2細(xì)胞系在含TGF-β1細(xì)胞培養(yǎng)基中均發(fā)生了EMT[25]。Yasuoka H 等[26]的研究表明，過表達(dá)IGFBP-5 小鼠纖維化模型的肺中AEC 共表達(dá)了E-cad 和a-SMA，提示存在EMT。特發(fā)性肺纖維化患者肺中活化AEC 可以合成分泌多種促凝血因子（如PAI-1/2）、促纖維化因子（如TGF-β、TNF-α、PDGF），這些細(xì)胞因子可以在AEC 和成纖維細(xì)胞之間相互傳遞信號，進(jìn)而影響到彼此的增殖和凋亡[27]。特發(fā)性肺纖維化患者肺活檢中，發(fā)現(xiàn)纖維母細(xì)胞灶80%以上增生上皮細(xì)胞中共表達(dá)上皮（Nkx2.1、促生蛋白B）和間充質(zhì)（a-SMA）標(biāo)志，提示EMT 是體內(nèi)發(fā)生特發(fā)性肺纖維化的重要病理過程，且指出該過程受ECM 調(diào)節(jié)[28]。此外，Ward 等[29]在研究中發(fā)現(xiàn)，取自臨床穩(wěn)定的肺移植受體氣道上皮細(xì)胞具有EMT 特征。

綜上所述，AEC 損傷與重塑及TGF-β1誘導(dǎo)EMT在特發(fā)性肺纖維化發(fā)病過程中起到至關(guān)重要的作用。特發(fā)性肺纖維化患者中位生存期約2.8 年，被稱為“類腫瘤疾病”，治療上除氧療和肺移植外，包括吡非尼酮及尼達(dá)尼布在內(nèi)，尚無具有確切療效的藥物，這一現(xiàn)狀急需改變[30]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃?蟲丸對特發(fā)性肺纖維化的保護(hù)機(jī)制可能與不同程度阻斷或逆轉(zhuǎn)了TGF-β1誘導(dǎo)的EMT 有關(guān)。這也為大黃?蟲丸可以作為特發(fā)性肺纖維化患者潛在有效治療藥物提供了更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。