新型鴨呼腸孤病毒分離鑒定及σC基因進(jìn)化分析

申翰欽

摘? 要：新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck orthoreovirus，NDRV）在番鴨和北京鴨上流行，引起番鴨的肝斑狀出血和北京鴨的脾壞死。本研究從廣東云浮某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生以肝臟出血為病變的番鴨中分離到一株NDRV，命名為GD-YF-202001。對(duì)GD-YF-202001株的σC基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序與序列分析。結(jié)果顯示，分離株σC基因與NDRV SDJN18毒株同源性最高，遺傳距離較近;分離株σC氨基酸序出現(xiàn)多個(gè)氨基酸位點(diǎn)突變，發(fā)生了較大的變異。

關(guān)鍵詞：新型鴨呼腸孤病毒;NDRV;分離鑒定;σC基因;進(jìn)化分析

新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck orthoreovirus，NDRV）屬于呼腸孤病毒科、正呼腸孤病毒屬成員，基因組由10個(gè)雙鏈RNA片段組成。NDRV感染番鴨主要引起肝臟斑狀出血和壞死，感染北京鴨主要引起脾壞死等癥狀[1，2]。NDRV感染能引起免疫器官，因此被認(rèn)為是鴨群重要的免疫抑制病，發(fā)病日齡在5～25 d左右，死亡率為5%～50%，且發(fā)病日齡越小，死亡率越高[2，3]。近年來(lái)，該病在山東、河南、河北、安徽、遼寧、福建、廣東等地均有發(fā)生，嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展[4，5]。

本研究于2020年從廣東云浮某養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)典型肝臟斑狀出血癥狀的番鴨病料中分離到一株NDRV，并對(duì)σC基因測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析，以探究分離株的生物學(xué)特性，以期為NDRV流行病學(xué)調(diào)查積累數(shù)據(jù)，為該病防控提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 臨床樣品采集與病毒分離? 發(fā)病番鴨群死淘率約20%，病死鴨剖檢可見(jiàn)肝斑狀出血。采集發(fā)病鴨只的肝臟和脾臟組織，剪碎，加入5倍量PBS以及2000 IU/mL的青霉素、鏈霉素研磨成糜狀，移入滅菌離心管中，在4 ℃的冰箱中放置3 h后，反復(fù)凍融3次，8000 rpm離心5 min，取上清接種Vero細(xì)胞和DEF細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)3～5 d，待超過(guò)50%細(xì)胞出現(xiàn)CPE后凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2? RT-PCR檢測(cè)? 取1.1中收集的細(xì)胞上清，按照HiPure Viral RNA/DNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA。使用TaKaRa公司PrimeScriptTM One-Step RT-PCR試劑盒進(jìn)行σC基因擴(kuò)增（上游引物：5′- GCATGCAATGGTGGTACAGTG -3′;下游引物：5′- CTTACTGCGTGACATGGACC -3′）[4]，反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min;94 ℃ 3 min;94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，回收目的片段，克隆至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至Dh5α感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3? σC基因測(cè)序與分析? 用DNAStar軟件對(duì)分離株與參考毒株σC基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。使用MEGA-7軟件鄰位相接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2? 結(jié)果

2.1? 病毒分離鑒定? 臨床病料分別接種Vero和DEF細(xì)胞，培養(yǎng)3～5 d，細(xì)胞出現(xiàn)融合、裂解等典型的CPE，見(jiàn)圖1。細(xì)胞上清液RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示NDRV陽(yáng)性。分離毒株命名為GD-YF-202001株。

2.2? σC基因測(cè)序與分析? 測(cè)序獲得σC基因長(zhǎng)966 bp的開(kāi)放性閱讀框，編碼321個(gè)氨基酸殘基。對(duì)獲得的序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示分離株與NDRV SDJN18株同源性最高，核苷酸和氨基酸同源性分別為96.3%和96.0%;與NDRV代表毒株TH11和091核苷酸同源性分別為94.1%和95.0%，氨基酸同源性分別為95.3%和95.0%，見(jiàn)表1。

2.3? 氨基酸序列變異分析? GD-YF-202001株σC氨基酸序列發(fā)生多個(gè)位點(diǎn)的突變，主要在第200（G→D）、207（I→T）、223（M→L）、255（M→L）、289 （S→T）、298（A→V）、300（V→I）、304（S→P）、310（Q→R）位氨基酸，見(jiàn)圖2。這些氨基位點(diǎn)的突變與獨(dú)立的相關(guān)性需要進(jìn)一步的研究。

2.3? 遺傳進(jìn)化分析? 遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，GD-YF-202001株與NDRV SDJN18株和SDHZYC株遺傳距離較近，但與SDJN18所在的Clade II分支仍有一定的遺傳距離，形成獨(dú)立的分支。NDRV代表毒株TH11和091屬于Clade I分支，由進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn)，GD-YF-202001株介于Clade I與Clade II之間，見(jiàn)圖3。

3? 討論

NDRV在國(guó)內(nèi)分布廣泛，番鴨、半番和白鴨均易感，能引起較高的死亡率，嚴(yán)重威脅我國(guó)水禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。目前尚未有商品化的疫苗用于該病的預(yù)防，做好生物安全措施是防控該病的重要手段，特別是做好孵化場(chǎng)消毒工作，避免鴨群從孵化場(chǎng)感染帶毒。NDRV感染可導(dǎo)致免疫抑制，容易引起細(xì)菌性疾病的繼發(fā)，且繼發(fā)感染后抗生素治療效果較差，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

本研究從廣東云浮某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生肝臟斑狀出血癥狀的番鴨群中分離到1株NDRV，該毒株感染Vero和DEF細(xì)胞引起典型的CPE[6]，在DEF細(xì)胞上毒價(jià)可達(dá)108 TCID50/mL，提示鴨呼腸孤病毒具有廣泛的細(xì)胞嗜性。σC基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該毒株處于Clade I和Clade II之間，氨基酸序列發(fā)生多個(gè)位點(diǎn)突變。這些突變位點(diǎn)位于病毒表面，集中在200～310位氨基酸之間，突變是否與毒力相關(guān)還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 張思遠(yuǎn)，盧秀嫻，云驁，等. 新型鴨呼腸孤病毒廣東分離株σC蛋白基因序列分析[J]. 中國(guó)獸藥雜志， 2019， 53（12）： 1-6.

[2]? 黃瑜，蘇敬良，施少華，等. 我國(guó)鴨呼腸孤病毒感染相關(guān)的疫病[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（07）：57-58.

[3]? Wang H， Gao B， Liu X， et al. Pathogenicity of a variant duck orthoreovirus strain in Cherry Valley Ducklings[J]. Veterinary Microbiology， 2020， 242： 108546.

[4]? Cao Y， Sun M， Wang J， et al.Phenotypic and genetic characterisation of an emerging reovirus from Pekin ducks in China[J].Scientific Reports， 2019， 9（1）：478-484.

[5]? Wang H， Gao B， Chen H，et al.Isolation and characterization of a variant duck orthoreovirus causing spleen necrosis in Peking ducks， China[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2019，66（5）：2033-2044.

[6]? 羅丹，高立，孟照潔，等. 新型鴨呼腸孤病毒的分離鑒定及其σC基因遺傳進(jìn)化分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2020，42（05）：445-450.