HPLC法同時測定還少膠囊中4種成分的含量

周祥德 黃小蘭 陽文武 黎海靈 周濃 鄒隆瓊 王立

摘 要 目的：建立同時測定還少膠囊中莫諾苷、馬錢苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為中譜紅RD-C18，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫），檢測波長為240 nm（莫諾苷、馬錢苷）、330 nm（松果菊苷、毛蕊花糖苷），流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：莫諾苷、馬錢苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為5.29～105.80、4.49～89.88、16.26～325.25、16.31～326.25 μg/mL（r均為0.999 9）;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性、耐用性試驗的RSD均小于2.0%;加樣回收率分別為94.34%～96.23%（RSD=0.81%，n=6）、97.04%～98.89%（RSD=0.73%，n=6）、96.23%～98.08%（RSD=0.82%，n=6）、95.40%～98.47%（RSD=1.23%，n=6）。11批還少膠囊中上述4種成分的含量分別為0.190～0.704、0.439～0.857、2.723～4.475、0.589～1.035 mg/g。結(jié)論：所建方法專屬性強、精密度好，可用于還少膠囊中4種成分的含量測定。

關(guān)鍵詞 還少膠囊;高效液相色譜法;莫諾苷;馬錢苷;松果菊苷;毛蕊花糖苷;含量測定

中圖分類號 R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）20-2508-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.20.14

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of morroniside， loganin， echinacoside and acteoside in Huanshao capsules. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Zhongpuhong RD-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 240 nm （morroniside， loganin） and 330 nm （echinacoside， acteoside）. The column temperature was set at 35 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range were 5.29-105.80 μg/mL for morroniside， 4.49-89.88 mg/L for loganin， 16.26-325.25 mg/L for echinacoside and 16.31-326.25 mg/L for acteoside， r values were 0.999 9. RSDs of precision， stability （24 h）， reproducibility and durability tests were all lower than 2.0%. The recoveries were 94.34%-96.23%（RSD=0.81%，n=6）， 97.04%-98.89%（RSD=0.73%，n=6）， 96.23%-98.08%（RSD=0.82%，n=6）， 95.40%-98.47%（RSD=1.23%，n=6）， respectively. The contents of above 4 components in 11 batches of Huanshao Capsules were 0.190-0.704， 0.439-0.857， 2.723-4.475 and 0.589-1.035 mg/g， respectively. CONCLUSIONS： Established method is specific， precise and can be used for content determination of 4 components in Huanshao capsules.

KEYWORDS? ?Huanshao capsules; HPLC; Morroniside; Loganin; Echinacoside; Acteoside; Content determination

還少膠囊由熟地黃、山茱萸、肉蓯蓉、杜仲、五味子等15味中藥材組成，具有溫腎補脾、養(yǎng)血益精之功效，臨床主要用于治療脾腎虛損、腰膝酸痛、陽萎遺精、精血虧耗等癥[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，還少膠囊對勃起功能障礙、月經(jīng)不調(diào)、弱精子癥、早泄等癥的治療效果顯著[2-5]。熟地黃為方中君藥，具有補血滋陰、益精填髓之功效，而苯丙素苷類化合物是熟地黃的活性成分，以毛蕊花糖苷含量最高[6]，且2015年版《中國藥典》（一部）中規(guī)定“按熟地黃干燥品計，毛蕊花糖苷（以C29H36O15計）不得少于0.020%”[7]。山茱萸、肉蓯蓉為方中臣藥，前者具補益肝腎、收澀固脫之功，環(huán)烯醚萜糖苷類化合物是山茱萸的主要有效成分，并以莫諾苷和馬錢苷為代表[8-9];后者補腎陽、益精血，主要活性成分為松果菊苷和毛蕊花糖苷[10]，均在2015年版《中國藥典》（一部）中有記載[7]。

現(xiàn)行《國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)（試行）》中，僅規(guī)定還少膠囊“每粒含五味子以五味子甲素（C24H32O6）計，不得少于0.04 mg”[1]，而未對方中君/臣藥的有效成分進(jìn)行控制。由于中藥制劑成分復(fù)雜，對單一成分進(jìn)行檢測無法全面評價藥物的質(zhì)量，因此為了提高該藥的質(zhì)量、保證用藥的安全有效，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定了還少膠囊中莫諾苷、馬錢苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量，以期為全面評價該藥質(zhì)量、提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型 HPLC儀，包括LC-20AT型四元泵、SIL-20A型進(jìn)樣器、SPD-20A型檢測器、CTO-20A型柱溫箱（日本Shimadzu公司）;Agilent 1260型 HPLC儀，包括G1311C型四元泵、G1329B型進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1314F型檢測器（美國Agilent公司）;AB204A/S型萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;KH-2000DB型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;SCI- 20-D型超純水機（重慶科潤水處理設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

莫諾苷對照品（批號：MRS-106634，純度：100%）購自美國Stanford公司;馬錢苷對照品（批號：111640- 201707，純度：99.2%）、松果菊苷對照品（批號：111670- 200503，純度：100%）、毛蕊花糖苷對照品（批號：111530-201713，純度：92.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院;甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。11批還少膠囊（重慶三峽云海藥業(yè)股份有限公司，批號：170602No·058，規(guī)格：0.42 g/粒;批號：180601No·132，規(guī)格：0.38 g/粒;批號：181101No·004，規(guī)格：0.38 g/粒;批號：181205，規(guī)格：0.38 g/粒;批號：190101No·081，規(guī)格：0.38 g/粒;批號：190602No·035，規(guī)格：0.42 g/粒;批號：190802No·003，規(guī)格：0.38 g/粒;批號：190903No·101，規(guī)格：0.42 g/粒;批號：191005，規(guī)格：0.42 g/粒;批號：191006，規(guī)格：0.42 g/粒;批號：191007，規(guī)格：0.42 g/粒）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：中譜紅RD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%A;10～20 min，10%A→15%A;20～50 min，15%A）;檢測波長：240 nm（莫諾苷、馬錢苷）、330 nm（松果菊苷、毛蕊花糖苷）;流速：1.0 mL/min;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 稱取莫諾苷對照品0.010 58 g、馬錢苷對照品0.009 06 g，分別置于25 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，得莫諾苷、馬錢苷質(zhì)量濃度分別為0.423 2、0.359 5 mg/mL的單一對照品母液;另稱取松果菊苷對照品0.013 01 g、毛蕊花糖苷對照品0.014 11 g，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，得松果菊苷、毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為1.301、1.305 mg/mL的單一對照品母液。吸取上述各單一對照品母液5 mL，置于20 mL量瓶中，搖勻，即得莫諾苷、馬錢苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為105.80、89.88、325.25、326.25 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品10粒，研細(xì)，混合均勻，精密稱取粉末1.0 g，置于三角瓶中，用移液管加入50%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放至室溫后，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 參照還少膠囊的配方比例和制備工藝，制備缺山茱萸、熟地黃和肉蓯蓉的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性考察

分別精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1可知，各成分峰形較好且均能達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5;理論板數(shù)按莫諾苷峰計均不低于8 000;陰性樣品對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列線性工作溶液。取上述工作溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以各成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

2.5 精密度試驗

取“2.4”項下線性工作溶液（莫諾苷、馬錢苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷的質(zhì)量濃度分別為21.16、17.96、65.04、65.24 μg/mL）適量，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，莫諾苷、馬錢苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為0.46%、0.53%、0.62%、0.66%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：191006）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，莫諾苷、馬錢苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為0.82%、0.39%、0.48%、0.69%（n=7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取還少膠囊粉末（批號：191006）1.0 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品中4種成分的含量。結(jié)果，莫諾苷、馬錢苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷的平均含量分別為0.441、0.585、2.886、0.721 mg/g，RSD分別為0.52%、0.75%、0.49%、0.83%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量（含莫諾苷0.441 mg/g、馬錢苷0.585 mg/g、松果菊苷2.886 mg/g、毛蕊花糖苷0.721 mg/g）的還少膠囊粉末（批號：191006）0.5 g，共6份，精密加入“2.2.1”項下各單一對照品母液（莫諾苷0.50 mL、馬錢苷0.75 mL、松果菊苷1.00 mL、毛蕊花糖苷0.25 mL），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 耐用性試驗

精密稱取還少膠囊粉末（批號：191006）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件以不同色譜儀（Shimadzu LC-20AT和Agilent 1260）、不同色譜柱（中譜紅RD-C18、Waters C18）、不同流速（0.9、1.0 mL/min）、不同柱溫（30、35 ℃）進(jìn)樣測定，各條件平行操作3次，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品中4種成分的含量，結(jié)果見表3。結(jié)果，4種成分含量的RSD均小于2.0%（n=3），表明方法耐用性良好。

2.10 樣品含量測定

取11批還少膠囊樣品適量，研細(xì)，混合均勻，精密稱取1.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算樣品中4種成分的含量。每樣品平行操作3次，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本研究前期對不同色譜柱（中譜紅RD-C18、迪馬C18、塞分C18、Waters C18）、柱溫（30、35 ℃）、進(jìn)樣量（10、15、20 μL）、流速（0.9、1.0 mL/min）以及流動相體系（乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%醋酸水溶液、乙腈-0.3%磷酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液）進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用本研究中“2.1”項下色譜條件分析樣品時，各成分分離度良好且峰形對稱。同時，采用二極管列陣檢測器在190～800 nm全波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，莫諾苷、馬錢苷在240 nm波長附近有最大吸收，在330 nm波長處沒有吸收;松果菊苷、毛蕊花糖苷在330 nm波長附近有最大吸收，在240 nm波長處吸收較小，且毛蕊花糖苷峰高較低，基線噪音影響較大。為保證各待測成分能得到較好的響應(yīng)并減少干擾峰，最終確定莫諾苷、馬錢苷的檢測波長為240 nm，松果菊苷、毛蕊花糖苷的檢測波長為330 nm。

3.2 提取條件的確定

本研究前期對不同提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇）、浸泡時間（0、30、40、60 min）、提取方式（超聲、加熱回流）、超聲處理時間（20、30、40、50 min）、稱樣量（0.5、1.0、1.5 g）進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用本研究中“2.2.2”項下條件處理時的提取效果最好。

3.3 含量分析

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11批還少膠囊中4種成分平均含量的高低依次為松果菊苷>毛蕊花糖苷>馬錢苷>莫諾苷;且不同批次還少膠囊中各成分的含量差異較大。筆者推測，這可能與缺乏相關(guān)藥材的篩選指標(biāo)致藥材所含的有效成分含量存在差異[11]、所用藥材的品質(zhì)參差不齊[12]以及制備提取工藝不同[6，13]等因素有關(guān)。

綜上所述，所建方法專屬性強、精密度好，可用于還少膠囊中4種成分的含量測定。

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（收稿日期：2020-06-14 修回日期：2020-08-27）

（編輯：陳 宏）