腰痛康膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

徐倩+邱慧

[摘要]目的 建立腰痛康膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法（TLC）對處方中續(xù)斷、獨活、狗脊等藥材進行薄層鑒別；反相高效液相色譜法（HPLC）測定腰痛康膠囊中淫羊藿苷的含量。結(jié)果 TLC中斑點清晰、分離良好；HPLC測定淫羊藿苷進樣量在0.21～2.1 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9984），平均加樣回收率（n=5）為99.2%，RSD（n=5）為0.25%。結(jié)論 本方法操作簡便、專屬性強、準(zhǔn)確度高、精密度和重復(fù)性好，可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

[關(guān)鍵詞]質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；腰痛康膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜法

[中圖分類號] R927.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）10（b）-0007-05

[Abstract]Objective To establish the quality standards of Yaotongkang Capsules.Methods Radix dipsaci，angelica wolfberry，rhizoma etc. medicinal materials in the prescription were identified by using thin layer chromatography （TLC）；content of epimedium glycoside in Yaotongkang Capsules was detected by reverse phase high performance liquid chromatography （HPLC） method.Results TLC spots were clear and well separated；HPLC for sample size of epimedium glycoside in the range of 0.21-2.1 μg was good （r=0.998 4），average recovering rate was 99.2% （n=5），RSD was 0.25% （n=5）.Conclusion The method has the advantages of simple operation，strong specificity，high accuracy，good precision and repeatability，and can be used as the quality control standard of the preparation.

[Key words]Quality standards；Yaotongkang Capsules；Thin layer chromatography；High performance liquid chromatography

腰痛康膠囊為南昌市洪都中醫(yī)院自制制劑，處方來源于該院骨傷科名老中醫(yī)根據(jù)祖國傳統(tǒng)中醫(yī)理論，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗總結(jié)而成的，處方由淫羊藿、桑寄生、續(xù)斷、狗脊、鹿角霜、牛膝、獨活、生姜等15味中藥組成，具有補肝益腎、理氣通絡(luò)、活血止痛的功效，用于肝腎虧虛、寒濕遇阻所致的急慢性腰痛、腰腿疼痛等癥。為全面地控制藥品質(zhì)量，本文首次對腰痛康膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行了研究。淫羊藿為處方中君藥，味辛甘性溫，走肝腎二經(jīng)，為補命門、強筋骨、益精氣、溫腎壯陽之要藥[1]。淫羊藿苷作為淫羊藿的重要活性成分[2]，其含量測定多采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[3-5]。本研究選擇淫羊藿苷為研究目標(biāo)進行腰痛康膠囊的含量測定試驗。

1儀器與試劑

Shimadzu LC-20AT系列高效液相色譜儀（日本島津公司）；Sartorius BS224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Mettler-Toledo XS105 DualRange電子天平（梅特勒-托倫多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）；UV-2550紫外可見光分光光度計（日本島津公司）；KQ-300DB型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；DKS-12電熱恒溫水浴鍋（沈蕩中新電器廠）；202-2-S電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

腰痛康膠囊7批，均由南昌市洪都中醫(yī)院制劑中心提供，陰性樣品按處方自制。淫羊藿苷對照品（批號：110737-200415）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（批號：111685-200401）、蛇床子素對照品（110822-200406）、原兒茶酸對照品（110809-201205），均購自中國食品藥品檢驗檢定研究院。D101型大孔樹脂（上海藍季，中國）、聚酰胺粉（上海譜振生物科技有限公司）、硅膠G（青島海洋化工有限公司）、硅膠H（青島海洋化工有限公司）。乙腈（色譜純，Merck公司），水為超純水（Purifier DZG-303A超純水系統(tǒng)，博科公司），其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1淫羊藿的薄層鑒別

取本品內(nèi)容物5 g，研細，加水30 ml使溶解，用乙醚提取3次，每次20 ml，水層揮盡乙醚，用乙酸乙酯提取2次，每次20 ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加水20 ml使溶解，加至已處理好的聚酰胺柱（內(nèi)徑約1 cm，2 g，干法上柱）上，用乙酸乙酯50 ml洗脫，收集洗脫液并蒸干，殘渣用1 ml甲醇溶解，作為供試品溶液。再取淫羊藿苷對照品，用甲醇溶解制成每1毫升含1 mg的溶液作為對照品溶液。為增加鑒別的專屬性，取去除淫羊藿的模擬處方制成陰性樣品，再按上述供試品溶液的制備方法依法制成缺淫羊藿的陰性樣品溶液。按照薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）《中國藥典》2015年版一部附錄Ⅵ B試驗，分別吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各15～20 μl以及對照品溶液5 μl，點于同一硅膠H薄層板上，展開劑為乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶1∶1∶1），展開后取出，晾干并噴三氯化鋁試液，于105℃烘干3～5 min，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜與對照品色譜在相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點（圖1）。

2.2續(xù)斷的薄層鑒別

取本品內(nèi)容物4.5 g，研細，置具塞錐形瓶中，移入甲醇25 ml，超聲處理（300 W，25 kHz）30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次25 ml，合并正丁醇提取液，正丁醇提取液繼續(xù)用氨試液洗滌2次，每次15 ml，棄去氨試液，再用水洗滌3次，每次30 ml，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘渣加水5 ml使溶解，上樣于D101型大孔樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長12 cm），依次用水、30%乙醇各50 ml進行洗脫，棄去洗脫液，再用70%乙醇50 ml洗脫，收集洗脫液后蒸干，用甲醇1 ml溶解殘渣作為供試品溶液。再取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品，加甲醇溶解制成1 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。為增加鑒別的專屬性，取去除續(xù)斷的模擬處方制成陰性樣品，再按上述供試品溶液的制備方法依法制成缺續(xù)斷的陰性樣品溶液。照薄層色譜法《中國藥典》2015年版一部附錄Ⅵ B試驗，分別吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各15～20 μl以及對照品溶液5 μl，點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）在10℃以下放置過夜的下層溶液，展開后取出晾干，并噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點清晰顯色。結(jié)果顯示，供試品色譜與對照品色譜在相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點（圖2）。

2.3獨活的薄層鑒別

取本品內(nèi)容物5 g，研細，加水30 ml使溶解，再用乙醚振搖提取3次，每次25 ml，合并上層乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 ml溶解作為供試品溶液。再取蛇床子素對照品，用甲醇溶解制成1 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。為增加鑒別的專屬性，取去除獨活的模擬處方制成陰性樣品，再按上述供試品溶液的制備方法依法制成缺獨活的陰性樣品溶液。按照薄層色譜法《中國藥典》2015年版一部附錄Ⅵ B試驗，分別吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各15～20 μl以及對照品溶液5 μl，點于同一硅膠G薄層板上，正己烷-醋酸乙酯（9∶3）作為展開劑，展開后取出晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜與對照品色譜在相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點（圖3）。

2.4狗脊的薄層鑒別

取本品內(nèi)容物5 g，加水30 ml使溶解，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，用乙醚振搖提取3次，每次25 ml，合并上層乙醚液，蒸干，殘渣用1 ml甲醇溶解作為供試品溶液。再取原兒茶酸對照品，加甲醇溶解制成1 mg/ml的溶液作為對照品溶液。為增加鑒別的專屬性，取去除狗脊的模擬處方制成陰性樣品，再按上述供試品溶液的制備方法依法制成缺狗脊的陰性樣品溶液。按照薄層色譜法《中國藥典》2015年版一部附錄Ⅵ B試驗，分別吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各15～20 μl以及對照品溶液5 μl，點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸（6.0∶1.0∶0.2），展開后取出晾干，再噴5%三氯化鐵乙醇溶液，于105℃加熱至斑點清晰顯色。結(jié)果顯示，供試品色譜與對照品色譜在相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點（圖4）。

2.5色譜條件與溶液制備

2.5.1色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3反相色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（28∶72）；流速：1 ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：270 nm；進樣量：20 μl。理論板數(shù)以淫羊藿苷色譜峰計應(yīng)≤1000。在此條件下，分別得到對照品和樣品的分離色譜圖（圖5）。

2.5.2對照品溶液的制備 精密稱取適量淫羊藿苷對照品，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解制成濃度為52.5 μg/ml的溶液，即得。

2.5.3供試品溶液的制備 取裝量差異下的本品內(nèi)容物，研細，精密稱定2.0 g，置具塞錐形瓶中，精密移取70%乙醇25 ml，稱定重量，靜置過夜，超聲處理（功率250 W，頻率35 kHz）30 min，冷卻至室溫，稱定重量，再用甲醇補足減失的重量，搖勻濾過，取續(xù)濾液，即得[6-8]。

2.6方法學(xué)考察

2.6.1專屬性試驗 用固定閾值為990的方法來檢測樣品中淫羊藿苷的色譜峰純度，得出峰的純度因子為1000，在閾值之上，說明樣品中的淫羊藿苷色譜峰為單一物質(zhì)峰（圖6）。

2.6.2線性關(guān)系考察 精密吸取淫羊藿苷對照品溶液4、12、20、28、40 μl，分別注入高效液相色譜儀，以進樣量（0.21、0.63、1.05、1.47、2.10 μg）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測得線性回歸方程為：Y=4×106X+192 488，r=0.998 4，線性范圍為0.21～2.1 μg（表1）。

2.6.3精密度試驗 取“2.5.3”項下的對照品溶液，按“2.5.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，測定淫羊藿苷的峰面積。結(jié)果淫羊藿苷峰面積的RSD為0.68%（n=6），表明該方法的儀器精密度良好。

2.6.4穩(wěn)定性試驗 取“2.5.3”項下的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h后進樣，測定供試品溶液中淫羊藿苷色譜峰峰面積，計算RSD為0.25%（n=7），表明供試品溶液在制備后的24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.5重復(fù)性試驗 取同一批腰痛康膠囊樣品6份，每份約2.0 g，精密稱定，按“2.5.3”項下的方法制備供試品溶液并按“2.5.1”項下的色譜條件測定含量。結(jié)果淫羊藿苷的平均含量為0.3700 mg/g，RSD為0.89%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.6加樣回收率試驗 分別稱取同一批次的腰痛康膠囊樣品（淫羊藿苷含量為0.37 mg/g）5份，每份約1.0 g，精密稱定，分別置于已加標(biāo)并經(jīng)氮氣吹干的5個錐形瓶中（105 μg/ml的淫羊藿苷對照品溶液各5 ml），精密加入70%乙醇20 ml，再按“2.5.3”項下的方法制備；分別精密吸取20 μl，注入液相色譜儀，測定淫羊藿苷色譜峰面積，計算回收率，結(jié)果淫羊藿苷的平均回收率為99.2%，RSD為0.25%（n=5），表明該方法的準(zhǔn)確性良好（表2）。

2.7樣品測定

取7批腰痛康膠囊樣品，分別按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.5.1”項色譜條件進行測定，每批樣品各測3次，以外標(biāo)法計算各指標(biāo)成分含量，（表3）。

3討論

本文考察了不同濃度的乙醇或甲醇溶液與不同的超聲提取時間對淫羊藿苷的提取效果的影響，結(jié)果表明70%的乙醇超聲30 min的效果較為合適，提取充分且效果穩(wěn)定；此外本實驗還考察了先用乙醚進行提取，繼而棄去乙醚液，然后再采用乙酸乙酯提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回收率明顯偏低，且操作復(fù)雜。在色譜條件摸索過程中，大量研究采用乙腈-水（30∶70）作為流動相，但試驗所得的對照品色譜峰有拖尾現(xiàn)象，故考慮加酸以改善其峰形[9-11]。因此，選擇常用的0.1%磷酸水溶液替代純水溶液[12-13]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照品峰形有所改善。文獻報道，淫羊藿苷檢測波長為270 nm[14-17]。本試驗采用UV-2550紫外分光光度計，在200～400 nm波長范圍內(nèi)對淫羊藿苷對照品溶液進行光譜掃描，測得在270 nm處有最大吸收，與文獻報道相同。

腰痛康膠囊作為南昌市洪都中醫(yī)院協(xié)定處方制劑，在我院臨床應(yīng)用范圍廣，治愈率高，對于急慢性腰痛、腰腿疼痛等有顯著的療效。因此，建立腰痛康膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要的臨床價值。上述實驗結(jié)果表明，本試驗所建立的方法可操作性強，簡便易行，同時專屬性較強，具有較好的重現(xiàn)性，方法穩(wěn)定且回收率高，可為腰痛康膠囊的質(zhì)量控制提供可靠的依據(jù)。

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