GC-MS/MS法測定蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘留量的不確定度評定

譚錦萍，阮 征，陳羽中，黃小清

（1.華南理工大學(xué)，廣東廣州 510000；2.廣州市食品檢驗所，廣東廣州 510410）

苯醚甲環(huán)唑又名噁醚唑，是一種具有高效、廣譜、低毒和內(nèi)吸傳導(dǎo)性強的三唑類殺菌劑，對作物具有保護和治療作用，廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜等農(nóng)作物上[1]。通過抑制麥角甾醇的生物合成、破壞細胞膜結(jié)構(gòu)功能，從而達到殺菌目的，對蔬菜和瓜果的紋枯病、銹病、早疫病、葉斑病、黑星病、白粉病等具有較好的保護和治療作用。由于苯醚甲環(huán)唑具有持效期長、與其他殺菌劑無交互抗性、不污染農(nóng)產(chǎn)品、不殺傷天敵的優(yōu)點[2-3]，加上農(nóng)民合理使用農(nóng)藥的水平有限、誤用和濫用情況嚴重，容易造成一些病蟲害對其產(chǎn)生耐藥性。在農(nóng)產(chǎn)品的日常監(jiān)督抽檢中發(fā)現(xiàn)，265個蔬菜樣品中檢出苯醚甲環(huán)唑的陽性樣品有50個，檢出率高達18.87%?？梢?，苯醚甲環(huán)唑在蔬菜種植中比較常用。

標(biāo)準(zhǔn)[4]規(guī)定，某些蔬菜苯醚甲環(huán)唑的最高殘留限量 （Maximum residue limit，MRL） 為 0.2 mg/kg。在實際檢測中，當(dāng)苯醚甲環(huán)唑的檢出值在限量值附近時，實驗室出具的檢測結(jié)果直接關(guān)系到樣品是否合格的判定。因此，為確保結(jié)果的可信度，必須進行不確定度的評估[5]。

1 材料與方法

1.1 材料儀器與試劑

蔬菜，購于廣州某超市。

TSQ8000evo型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀、EI離子源，美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；BP221S型電子天平，美國賽多利斯公司產(chǎn)品；2-16KL型高速離心機，德國Sigma公司產(chǎn)品；HS501型數(shù)顯往復(fù)振蕩搖床，德國IKA儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

苯醚甲環(huán)唑（100 μg/mL），農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所提供；環(huán)氧七氯、乙腈（色譜純），美國Fisher公司提供；QuEChERS分散固相萃取鹽包（內(nèi)含4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g檸檬酸鈉、0.5 g三水合二檸檬酸二鈉）、QuEChERS分散固相萃取凈化管（150 mg PSA和900 mg MgSO4）、陶瓷均質(zhì)器，美國Agilent公司提供。

1.2 試驗條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：TR-PESTICIDEⅡ毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始柱溫40℃，保持1.5 min，以 25 min/℃升至90℃，保持1.5 min，以25 min/℃升至180℃，以5℃/min升至280℃，再以10 min/℃升至300℃，保持5 min；進樣口溫度270℃，進樣量1 μL，不分流；載氣為高純氦氣，1.2 mL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源溫度300℃，傳輸線溫度300℃，EI離子源70 eV。

定性、定量離子和碰撞能見表1。

表1 定性、定量離子和碰撞能

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取25 mg環(huán)氧七氯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用正己烷溶解并定容至25 mL，得到1 mg/mL的溶液，作為內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；準(zhǔn)確吸取200 μL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，正己烷定容至10 mL，得到20 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液。精確吸取苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，用乙腈溶解并定容至10 mL，得到10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確吸取 0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，準(zhǔn)確各加入50 μL的20 mg/L內(nèi)標(biāo)工作溶液，用蔬菜的基質(zhì)空白溶液定容。以苯醚甲環(huán)唑濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值（C苯醚甲環(huán)唑/C內(nèi)標(biāo)）為橫坐標(biāo)、苯醚甲環(huán)唑峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積（A苯醚甲環(huán)唑/A內(nèi)標(biāo)） 的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 前處理方法

（1） 提取。均勻取樣并準(zhǔn)確稱取樣品10 g（精確到0.01 g），置于50 mL離心管中， 加入20 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL，加入20 mL的乙腈，于組織搗碎機上提取2 min，置于-18℃冰箱中冷凍10 min后取出，加入QuEChERS萃取包、2粒均質(zhì)子，劇烈振搖1 min后，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心3 min。

（2） 凈化。分取上清液 5 mL于QuEChERS凈化管中，劇烈振搖1 min后，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心3 min，上清液過濾膜后，用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀測定。以保留時間和離子對豐度比定性，內(nèi)標(biāo)曲線法定量。

1.2.6 回收率的測定

準(zhǔn)確稱取各10.00 g空白蔬菜樣品6份，于50 mL離心管中，加入相同質(zhì)量濃度苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)，按1.2.5前處理方法同步進行，測定苯醚甲環(huán)唑的含量，并對其回收率和精密度進行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

從測定苯醚甲環(huán)唑的數(shù)學(xué)模型中，分析其不確定度的來源。就試驗而言，采用內(nèi)標(biāo)法計算樣品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的計算公式為：

式中：X——樣品中苯醚甲環(huán)唑的含量，mg/kg；

C——由A樣/A內(nèi)標(biāo)從曲線中得出的試樣中苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量濃度，mg/L；

V——提取液體積，mL；

m——稱量質(zhì)量，g；

frec——加標(biāo)試驗的回收率，%；

根據(jù)JJF 1059—1999[6]，由相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

2.2 試驗結(jié)果

取6個加標(biāo)的蔬菜樣品，按照1.2.5的處理方法對蔬菜樣品中苯醚甲環(huán)唑進行平行6次的試驗，對其含量進行測定。

測定結(jié)果見表1。

表1 測定結(jié)果

由表1可以計算出本次試驗測定的苯醚甲環(huán)唑含量為：

3 不確定度評定

3.1 不確定度的來源分析

根據(jù)內(nèi)標(biāo)法原理，被測樣品和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中加入的內(nèi)標(biāo)物相同，即內(nèi)標(biāo)物的濃度可約除，因此無需考慮內(nèi)標(biāo)物純度引起的不確定度，只考慮內(nèi)標(biāo)物加入的體積。縱觀整個檢測過程，對蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘量結(jié)果有影響的不確定度分量來源有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品、樣品前處理過程、儀器分析過程等。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的不確定度Urel(標(biāo))

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度引起的不確定度Urel(標(biāo)p)

苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所，根據(jù)證書信息，苯醚甲環(huán)唑的標(biāo)準(zhǔn)值為100 μg/mL，擴展不確定度為 0.19 μg/mL。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引起的不確定度Urel(標(biāo)v)

試驗的標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制過程使用了10 mL的容量瓶（A級），標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程使用了100 μL和1 mL移液器，按照JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[7]和JJG 646—2006《移液器》[8]檢定規(guī)程，玻璃器和移液器均有相應(yīng)的最大允許誤差，其不確定來源包括以下2個方面。

（1）容量瓶、移液器本身的不確定度。檢定證書指出10 mL容量瓶（A級）的最大允差為±0.020 mL，100 μL移液器的最大允差為±2.0%，1 mL移液器最大允差為±1.0%，由量具允差引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

（2）環(huán)境溫度引起的不確定度。實驗室的溫度一般控制在20±5℃，20℃時乙腈的膨脹系數(shù)是1.37×10-3℃，由環(huán)境溫度引起的相對不確定度公式為：

根據(jù)各分量合成標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程中引入的相對不確定度為：

玻璃器具和移液器的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2。

3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)校正曲線擬合的不確定度Urel(標(biāo)w)

試驗對6個不同濃度的苯醚甲環(huán)唑進行測定。內(nèi)標(biāo)校正曲線見表3。

表2 玻璃器具和移液器的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表3 內(nèi)標(biāo)校正曲線

以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中苯醚甲環(huán)唑與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度比值為橫坐標(biāo)，苯醚甲環(huán)唑與內(nèi)標(biāo)物豐度比值為縱坐標(biāo)，得到的回歸方程為Y=4.618X-0.193 1，R2=0.999 3。

計算標(biāo)準(zhǔn)溶液待測物質(zhì)信號殘差的標(biāo)準(zhǔn)差為：

對苯醚甲環(huán)唑為陰性的蔬菜樣品進行5次的添加回收試驗（添加量為0.2 mg/kg）。

樣品測定結(jié)果（n=5） 見表4。

表4 樣品測定結(jié)果（n=5）

校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中：S——標(biāo)準(zhǔn)溶液待測物質(zhì)信號殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，0.1；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，4.618；

P——試驗次數(shù)，5；

n——標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度點數(shù)，6；

C0——樣品中苯醚甲環(huán)唑的實際測定濃度，0.105 2；

cˉ——各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值，0.64；

Sn——所有校準(zhǔn)溶液濃度的離均差平方和。

則曲線擬合的引入的相對不確定度為Urel(標(biāo)w)=U(std)/1.052=0.084/1.052=0.079 8.

綜上分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)所引入的不確定度來源，計算由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度為：

3.3 儀器重復(fù)測量引入的不確定度Urel(儀)

儀器引入的不確定度是由儀器對被測組分的響應(yīng)值（峰面積）的重復(fù)性差異引起的，按A本類評定，可通過重復(fù)進樣來計算。通過將同一樣品溶液進行連續(xù)6次重復(fù)進樣，得到的重復(fù)進樣結(jié)果。

重復(fù)進樣測定結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)進樣測定結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[6]，在測定次數(shù)少的情況下，可采用極差法對不確定度進行評定，查表可得，當(dāng)n=6，C=2.53。即由重復(fù)性進樣引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.4 樣品前處理中引起的不確定度Urel(樣)

樣品處理過程不確定度的主要來源：一是樣品使用的稱量天平引起的不確定度；二是樣品提取、凈化、定容等過程中所使用的玻璃量器所引起的不確定度。

樣品用百分之一天平進行稱量，其校準(zhǔn)允差為±0.01g，試驗稱取樣品量為10 g，k按均勻分布計算，K?。粯悠穬艋?、定容過程中使用的是20 mL的移液管。

天平和玻璃量器引起的不確定度見表6。

由表6可知，樣品前處理過程所引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成為：

3.5 結(jié)果計算過程引入的不確定度Urel(frec)

回收率是結(jié)果計算中的一個重要的不確定度來源因子。取低、中、高3個水平進行苯醚甲環(huán)唑的添加回收試驗，每個水平進行6次試驗，按照2.2.5步驟進行處理上機。對18次的測定結(jié)果進行添加回收率計算。

表6 天平和玻璃量器引起的不確定度

回收率結(jié)果統(tǒng)計見表7。

表7 回收率結(jié)果統(tǒng)計

回收率按A類不確定度進行評定計算，當(dāng)n=18，

則，由回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4 不確定度的合成及擴展

4.1 各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的合成

各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量見表8。

表8 各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

苯醚甲環(huán)唑的相對合成不確定度為：

折算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2 擴展不確定度的評定

取置信水平為95%，k=2，計算擴展不確定度U(C)=u(C)×k=0.017×2=0.034。因此，樣品中苯醚甲環(huán)唑的殘留量表示為（0.2±0.0.034） mg/kg（k=2）。

5 結(jié)論

以苯醚甲環(huán)唑為主要研究對象，對蔬菜中苯醚甲環(huán)唑的不確定度評估進行了論述。當(dāng)取樣量為10 g，k=2（95%置信度） 測得的蔬菜中苯醚甲環(huán)唑的含量為（0.2±0.034） mg/kg。表明整體方法的準(zhǔn)確性較好，可用于蔬菜中苯醚甲環(huán)唑的測定和不確定評估。