苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

洪霞，錢瀅文，馮玉升，王懂帥，何海寧，汪永松，高志瑩，張彥軍，*

（1.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司，甘肅蘭州730010；2.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗檢測有限公司，甘肅蘭州730010）

苯醚甲環(huán)唑（difenoconazole）又名噁醚唑，化學(xué)名稱為順，反-3-氯-4-[4-甲基-2-（1H-1，2，4-三唑-1-基甲基）-1，3-二噁戊烷-2-基]苯基4-氯苯基醚，分子式 為 C19H17Cl2N3O3， 分 子 量 為 406.27，CAS號 為119446-68-3，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 苯醚甲環(huán)唑結(jié)構(gòu)式Fig.1 The molecular structure of difenoconazole

苯醚甲環(huán)唑于1989年研發(fā)成功上市，銷售0.45億美元，2003年進(jìn)入億美元產(chǎn)品之列，2013年銷售3.1億多美元。1999年我國第一次登記了10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑產(chǎn)品，此后國內(nèi)廠家競相開發(fā)，截至2015年，已登記含苯醚甲環(huán)唑的產(chǎn)品有540個，銷售3千多萬美元，是一種較好的殺菌劑品種[1]。苯醚甲環(huán)唑?qū)偃蝾悮⒕鷦?，是甾醇脫甲基化抑制劑，具有高效、廣譜、低毒、用量低的特點，其內(nèi)吸性極強，通過抑制麥角甾醇（構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分，對細(xì)胞膜的滲透性起重要作用）的生物合成，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能，從而達(dá)到殺菌目的，對蔬菜和瓜果的紋枯病、銹病、早疫病、葉斑病、黑星病、白粉病等具有很好的保護(hù)和治療作用，具有持效期長，與其他殺菌劑無交互抗性，不污染農(nóng)產(chǎn)品，不殺傷天敵的優(yōu)點[2-3]。

由于常規(guī)化學(xué)殺菌劑的長期使用及濫用，造成絕大多數(shù)病害對其產(chǎn)生抗性，致使其對靶標(biāo)病害的防效大幅下降，只有大劑量使用時才有效，加大防治成本?；诒矫鸭篆h(huán)唑用量低、畝使用成本小、有持效期長等的優(yōu)點，使得苯醚甲環(huán)唑大量使用，用來提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對苯醚甲環(huán)唑的毒性、前處理方法和分析技術(shù)進(jìn)行總結(jié)，為今后分析檢測各類樣品基質(zhì)中苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留提供參考和依據(jù)。

1 苯醚甲環(huán)唑的毒性

由于苯醚甲環(huán)唑直接噴施在水果和蔬菜上，其留于蔬菜中通過食用進(jìn)入人體，累積后可能會危害人體健康，對此，王筱芬等[4]對苯醚甲環(huán)唑毒性及致突變性進(jìn)行了試驗研究，結(jié)果表明，雌性大鼠急性經(jīng)口LD502 000 mg/kg，雄性大鼠為1 710 mg/kg，對兔皮膚和眼睛有刺激作用，對小鼠生殖細(xì)胞和體細(xì)胞無明顯旳遺傳損傷，對豚鼠無皮膚過敏，對蜜蜂無毒，屬于低毒類物質(zhì)。劉綱華等[5]研究了10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑施用于黃瓜地后，其有效成分苯醚甲環(huán)唑在黃瓜和黃瓜地土壤中的消解速率較快，消解半衰期均低于10 d；在最后一次施藥后7 d時，苯醚甲環(huán)唑在黃瓜中的最終殘留量均低于0.1 mg/kg，這說明苯醚甲環(huán)唑在黃瓜地中屬較易降解的農(nóng)藥。綜上所述，苯醚甲環(huán)唑是一種安全，低毒，低污染環(huán)境和農(nóng)副產(chǎn)品的殺菌劑。

2 苯醚甲環(huán)唑殘留的最大殘留限量

施用苯醚甲環(huán)唑為農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)提供了保證，但是不可避免地對環(huán)境造成污染，對人體和環(huán)境造成危害，殘留問題備受關(guān)注。因此，我國制定了不同基質(zhì)中苯醚甲環(huán)唑的檢測方法（見表1），并且GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[6]對其殘留限量作了嚴(yán)格的規(guī)定，GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》明確規(guī)定了苯醚甲環(huán)唑在谷物、油料、油脂、蔬菜、水果、堅果、糖料、飲料和藥用植物中的最大殘留限量。苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的檢測標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的檢測標(biāo)準(zhǔn)Table 1 National standards of difenoconazole pesticide residues

續(xù)表1 苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的檢測標(biāo)準(zhǔn)Continue table 1 National standards of difenoconazole pesticide residues

由表1可知，苯醚甲環(huán)唑檢測適用范圍未全面覆蓋食品領(lǐng)域，且GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》不能完全滿足苯醚甲環(huán)唑檢測標(biāo)準(zhǔn)的判定，對于蜂蜜、果汁、果酒、桑枝、金銀花、枸杞子、荷葉、食用菌、牛奶和奶粉的最大殘留限量沒有制定判定標(biāo)準(zhǔn)。因此，制定更全面的苯醚甲環(huán)唑檢測標(biāo)準(zhǔn)和不斷完善GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》，對我國農(nóng)產(chǎn)品中苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的限量做出更嚴(yán)格的規(guī)定，形成基本覆蓋主要農(nóng)產(chǎn)品的完善配套的農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)體系十分有必要。

3 苯醚甲環(huán)唑殘留檢測技術(shù)

3.1 樣品前處理技術(shù)

現(xiàn)行用于苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留樣品前處理的方法有液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）、液相微萃?。╨iquid phase microextraction，LPME）、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）、固相微萃?。╯olid phase microextraction extraction，SPME）、分子印跡固相萃?。╩olecular imprinting solid phase extractio，MISPE）和分散固相萃?。╠ispersive solid-phase extraction，DSPE；又稱QuEChERS）等[16-18]，這些方法能夠很好地減少基質(zhì)干擾，具有操作簡單、萃取效率高、省時省力、使用溶劑量少、對環(huán)境污染小等優(yōu)點，在苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留分析樣品前處理中的應(yīng)用最為廣泛。吸附材料是決定這些技術(shù)選擇性和靈敏性的關(guān)鍵因素，常見傳統(tǒng)的吸附材料有乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（graphitized carbon blacks，GCB）、 弗 羅 里 硅 土（Florisil）、氧化鋁（Al2O3）、活性炭、硅膠及氨基填料（NH2）等。由于納米材料的開發(fā)與應(yīng)用成為前處理領(lǐng)域的研究熱點和發(fā)展趨勢，基于納米材料在吸附容量、吸附速度、吸附選擇性和使用成本等方面的優(yōu)勢，目前其在苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用已引起越來越多的關(guān)注和重視。課題組[19]制備了多壁碳納米管（multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）固相萃取柱，提取液以MWCNTs固相萃取柱凈化后用氣相色譜法質(zhì)譜檢測，苯醚甲環(huán)唑檢出限為0.001 mg/kg。方法選擇性好，抗干擾能力強，適合蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘留量的定性確證分析和定量分析。Chen等[20]合成了離子液體功能化的Fe3O4碳納米管磁性分散固相萃取吸附材料，結(jié)合氣相色譜法質(zhì)譜分析了水中苯醚甲環(huán)唑。結(jié)果顯示，該方法操作簡單快速，靈敏度高，環(huán)境友好，檢出限為0.16 ng/mL。

3.2 檢測技術(shù)

3.2.1 氣相色譜法

氣相色譜（gas chromatograph，GC）利用被分析物質(zhì)的沸點、極性和吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離。該方法將樣品提取、凈化、濃縮后的苯醚甲環(huán)唑注入氣相色譜柱，苯醚甲環(huán)唑在固定相中分離，經(jīng)檢測器掃描出色譜圖，通過保留時間來定性，通過峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量。該方法操作簡單、分析速度快、分離效能高、選擇性好等特點[21]。張春東等[22]建立了辣椒和土壤樣品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的快速檢測方法，樣品于分液漏斗中用正己烷萃取，振蕩提取3次，濃縮后正己烷定容，GC檢測，線性范圍為0.01 mg/L～1.00 mg/L，檢出限為0.002 5 mg/kg。結(jié)果表明，正己烷提取辣椒和土壤中苯醚甲環(huán)唑效果較好，前處理過程不用過SPE小柱或?qū)游鲋葍艋僮?，它具有高效率、低成本、高靈敏度、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點。毛久浪等[23]建立了QuECh－ERS聯(lián)合GC測定毛豆樣品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的方法，用該法檢測了68個批次樣品，其中20個毛豆仁樣品苯醚甲環(huán)唑殘留量均低于最大殘留限量0.02 mg/kg，48個帶莢毛豆樣品中有13個樣品中的苯醚甲環(huán)唑殘留量大于0.02 mg/kg，證明苯醚甲環(huán)唑主要殘留在毛豆莢中，去莢可降低毛豆仁苯醚甲環(huán)唑殘留的風(fēng)險，降低食用毛豆時暴露于苯醚甲環(huán)唑的風(fēng)險。表2列舉了應(yīng)用GC進(jìn)行苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留檢測的實例，由表2可知GC測定苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留主要使用電子捕獲檢測器（electroncapture detector，ECD）檢測器。

表2 苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的GC檢測實例Table 2 Examples of GC for determination of difenoconazole pesticide residues

3.2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）主要適用于高沸點、熱穩(wěn)定差、不易氣化或受熱易分解的農(nóng)藥殘留的定量測定。由于氣相色譜方法需要較高的氣化溫度，而苯醚甲環(huán)唑存在異構(gòu)體，在進(jìn)樣后的氣化過程中立體結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化，高效液相色譜法可避免立體結(jié)構(gòu)的變化而用于苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留分析檢測。紫外吸收檢測器（ultraviolet absorption detector，UV）不僅靈敏度高、噪聲低、線性范圍寬、有較好的選擇性，而且對環(huán)境溫度、流動相組成變化和流速波動不太敏感，既可用于等度洗脫，也可用于梯度洗脫，因此，HPLC-UV可應(yīng)用于苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的分析檢測。Li等[28]報道了一種簡單可靠的QuEChERS聯(lián)合HPLC方法檢測土壤和蔬菜中的苯醚甲環(huán)唑，苯醚甲環(huán)唑在 0.5 μg/mL～50 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.1 μg/mL。該方法特異性強，精密度高，重現(xiàn)性好，不僅用于苯醚甲環(huán)唑及其代謝物的分析，而且成功檢測了土壤、番茄和黃瓜中苯醚甲環(huán)唑的6種對映異構(gòu)體。表3列舉了應(yīng)用HPLC進(jìn)行苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留檢測的實例。

表3 苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的HPLC檢測實例Table 3 Examples of HPLC for determination of difenoconazole pesticide residues

由表2和表3可知，與GC法相比，HPLC不需要考慮樣品的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性，但是溶劑消耗大，檢出限高，分析時間長，UV檢測器沒有ECD檢測器靈敏度高，而且對樣品的凈化程度要求很高，但由于儀器價格便宜，普通檢測實驗室易于配備和使用，且操作維護(hù)簡單，在苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的檢測中得到應(yīng)用。

3.2.3 質(zhì)譜法

質(zhì)譜是稱量離子的“天平”，其基本原理采用多種離子化技術(shù)將待測物質(zhì)離子化，再經(jīng)過質(zhì)量分析器和檢測器將這些離子按質(zhì)荷比大小分離并排列成譜，然后通過標(biāo)準(zhǔn)品對照和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并結(jié)合特征離子的豐度值實現(xiàn)各組分的定性分析和定量分析。質(zhì)譜以及色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用，使樣品的分離、定性和定量分析成為連續(xù)過程，與色譜的傳統(tǒng)檢測器相比，靈敏度更高，所需樣品的用量更少、分析速度更快、應(yīng)用范圍更廣，目前以質(zhì)譜作為檢測手段的農(nóng)藥殘留分析方法已成為農(nóng)藥殘留分析的主導(dǎo)技術(shù)和未來發(fā)展趨勢。在各種色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)中，氣相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）已在農(nóng)藥殘留分析中得到廣泛應(yīng)用。

應(yīng)用GC-MS和LC-MS檢測苯醚甲環(huán)唑定性能力強，結(jié)果準(zhǔn)確，分析速度快，但在復(fù)雜樣品中存在嚴(yán)重基質(zhì)干擾物及共流出物時，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。GC-MS/MS和LC-MS/MS利用獲得的離子豐富的結(jié)構(gòu)信息，對苯醚甲環(huán)唑的結(jié)構(gòu)加以確證，通過選擇離子模式，可以使樣品背景和噪音大大降低，在苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的鑒定和定量分析中更具有優(yōu)勢。李潔等[32]在茶葉中采用丙酮提取，經(jīng)TPP-固相萃取小柱凈化后，用GC-MS/MS檢測。試驗結(jié)果表明，GC-MS/MS降低了苯醚甲環(huán)唑在實際檢測中的假陽性和誤判率，該方法的靈敏度較高、選擇性較好、抗干擾能力較強，可用于茶葉中苯醚甲環(huán)唑殘留的準(zhǔn)確定量和定性分析。Chen等[16]比較了LPME聯(lián)合HPLC法和QuEChERS聯(lián)合LC-MS/MS法檢測豇豆中苯醚甲環(huán)唑的方法。結(jié)果表明，LPME具有操作簡單，環(huán)境友好的優(yōu)點，QuECh－ERS具有凈化效果好，重現(xiàn)性高的優(yōu)點，LC-MS/MS比HPLC線性范圍寬，靈敏度好，兩種方法都得到滿意的結(jié)果。質(zhì)譜法分析苯醚甲環(huán)唑速度快，檢出限低，可獲得準(zhǔn)確的定性和定量結(jié)果。但是，質(zhì)譜儀價格昂貴，運行成本高，需要嚴(yán)格的操作技能，限制了它的應(yīng)用，沒有單純用GC、HPLC普及。表4列舉了應(yīng)用MS進(jìn)行苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留檢測的實例。

3.2.4 其他方法

表面增強拉曼光譜（surface-enhanced raman spec－troscopy，SERS）指被檢測物在一些特殊制備的金屬導(dǎo)體（如金、銀等）表面或溶膠中，拉曼散射信號比普通拉曼散射信號強度增加104倍～106倍的現(xiàn)象。SERS具有檢測速度快、所需樣本量小和操作簡單等優(yōu)點，在農(nóng)藥殘留檢測方面具有很大的應(yīng)用潛力[43-44]。熊俊飛等[45]采用表面增強拉曼光譜技術(shù)結(jié)合快速溶劑前處理方法快速分析芹菜中苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留。利用乙腈提取芹菜汁，采用PSA、C18和GCB去除芹菜汁中的脂肪酸、蠟質(zhì)、色素和固醇等熒光物質(zhì)，樣本的基底采用OTR202和OTR103金納米顆粒作為表面增強試劑。結(jié)果表明，1192cm-1特征峰強度與以芹菜汁為基質(zhì)的苯醚甲環(huán)唑溶液濃度在1 mg/L～10 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.962 2，最低檢測濃度1 mg/L，回收率為 92.4%～113.2%，RSD在8.83%～12.4%之間。該方法操作簡單，單個樣本檢測時間在20 min內(nèi)完成，基本滿足國家規(guī)定的殘留限量要求。

表4 苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的MS檢測實例Table 4 Examples of MS for determination of difenoconazole pesticide residues

續(xù)表4 苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的MS檢測實例Continue table 4 Examples of MS for determination of difenoconazole pesticide residues

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用洗滌法將液相中的游離成分除去后再進(jìn)行定量測定。目前ELISA技術(shù)已被應(yīng)用于諸多的食品檢測領(lǐng)域，具有儀器成本低、方便、快捷、靈敏度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等眾多優(yōu)勢。同時存在難以分析多種成分，對某些結(jié)構(gòu)類似物的分析檢測仍會出現(xiàn)交叉反應(yīng)影響檢測結(jié)果，過度依賴試劑的選擇等缺點[46-47]。劉冰等[48]研究了通過苯醚甲環(huán)唑半抗原的設(shè)計及合成，人工抗原的制備，多克隆抗體的制備及純化，最終建立了苯醚甲環(huán)唑的直接競爭ELISA方法，其靈敏度 IC50為（67.96±2.73）μg/L，檢測限 IC15為（8.86±0.34）μg/L，選取10種果蔬類樣品，經(jīng)正己烷提取，磷酸鹽緩沖液稀釋后，回收率為89.01%～103.43%，變異系數(shù)小于14.33%，檢出限為0.443 mg/kg。本研究所建立的直接競爭ELISA方法，靈敏度和特異性較高，樣品處理簡單，為農(nóng)產(chǎn)品中苯醚甲環(huán)唑殘留的有效監(jiān)管提供了一種高效的檢測工具。

4 結(jié)論與展望

首先，目前苯醚甲環(huán)唑殘留檢測方法主要采用質(zhì)譜法，但是質(zhì)譜法對于復(fù)雜基質(zhì)會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。從當(dāng)前的發(fā)展趨勢看，采用串聯(lián)質(zhì)譜法建立苯醚甲環(huán)唑殘留檢測方法，開展苯醚甲環(huán)唑殘留精準(zhǔn)篩查已成為研究的重點，以及其在食品中的代謝規(guī)律研究將成為新的研究熱點。其次，伴隨生物傳感技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的發(fā)展，今后開發(fā)具有操作簡捷、成本低廉、高效靈敏的苯醚甲環(huán)唑殘留快速檢測方法，滿足食品中苯醚甲環(huán)唑殘留的現(xiàn)場快速檢測是關(guān)鍵。再次，不斷完善苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)，使其更全面覆蓋我國食品領(lǐng)域。制定既符合我國又能與國際接軌的更細(xì)致的苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，確保食品安全。最后，對于苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留是“產(chǎn)”出來的，而不是“檢”出來的。因而，加強苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥使用的源頭管理，樹立科學(xué)的施藥觀念，提倡少用、不用和安全用藥，從源頭上消除苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留，提高農(nóng)產(chǎn)品的安全水平，促進(jìn)我國農(nóng)產(chǎn)品的持續(xù)健康發(fā)展。