高效液相色譜法分析45%苯醚甲環(huán)唑·異菌脲懸浮劑

王 進(jìn)，張青華，廖文斌，林本厚，楊圣雙

（浙江禾本科技股份有限公司，浙江 溫州 325008）

苯醚甲環(huán)唑是新型廣譜三唑類殺菌劑[1]，內(nèi)吸性極強(qiáng)，可有效抑制病菌細(xì)胞膜中麥角甾醇的合成，抑制真菌的正常發(fā)育，主要用于谷物、葡萄、馬鈴薯、香蕉、觀賞植物和多種蔬菜作物，可防治黑星菌屬、白粉菌、銹病菌科、鏈格孢菌、球腔菌等多種病菌導(dǎo)致的病害[2-5]。異菌脲屬于廣譜二酰亞胺類殺菌劑，可有效抑制孢子和菌絲生長(zhǎng)，主要用于谷物、果樹(shù)、蔬菜、棉花、油菜、向日葵等，防治紋枯病菌、黑星粉菌、葡萄孢菌、伏革菌等病菌引起的病害[6-7]。

45%苯醚甲環(huán)唑·異菌脲懸浮劑由苯醚甲環(huán)唑和異菌脲復(fù)配而成，能有效防治瓜果和蔬菜的多種真菌類病害[8]。目前，已有關(guān)于苯醚甲環(huán)唑和異菌脲單劑的分析方法，但二者復(fù)配制劑的分析方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用反相色譜法，使用C18柱和可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，對(duì)苯醚甲環(huán)唑和異菌脲進(jìn)行分析和定量。此方法適用于單一成分的苯醚甲環(huán)唑、異菌脲原藥以及復(fù)配制劑的分析，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，速度快，重復(fù)性好。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，G7115A型DAD檢測(cè)器，色譜柱：Shimadzu VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm×5μm）。CPA225D型分析天平（精度0.00001g），PMI-300TD型超聲波清洗器，有機(jī)微孔濾膜（孔徑0.45μm）。

試劑：甲醇（CR）、乙腈（CR）、磷酸（AR）、新制超純水、溶樣溶液（甲醇∶0.1%磷酸溶液=60∶40）、苯醚甲環(huán)唑標(biāo)樣（含量99.4%，白色固體）、異菌脲標(biāo)樣（含量98.9%，白色固體）、45%苯醚甲環(huán)唑·異菌脲懸浮劑。

1.2 色譜工作條件

流動(dòng)相：等度洗脫，V（甲醇）∶V(乙腈）∶V（0.1%磷酸溶液）=50∶20∶30；流動(dòng)相流速1.0mL· min-1，柱溫35℃（溫差不大于2℃）；測(cè)定波長(zhǎng)230 nm，進(jìn)樣量5 μL；保留時(shí)間：異菌脲約6.8 min，順式苯醚甲環(huán)唑約11.7 min，反式苯醚甲環(huán)唑約12.1 min。

上述操作條件可根據(jù)儀器進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。苯醚甲環(huán)唑、異菌脲標(biāo)樣的液相色譜圖見(jiàn)圖1，試樣的液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 45%苯醚甲環(huán)唑·異菌脲懸浮劑試樣的液相色譜圖Fig. 2 Liquid chromatogram of 45% difenoconazole and iprodione SC sample

1.3 測(cè)定步驟

1.3.1 標(biāo)樣溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.02g苯醚甲環(huán)唑標(biāo)樣（精確至0.00001g）和0.03g異菌脲標(biāo)樣（精確至0.00001g）于同一50 mL容量瓶中，加入30mL溶樣溶液溶解，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，再用溶樣溶液稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾備用。

1.3.2 試樣溶液的配制

稱取45%苯醚甲環(huán)唑·異菌脲懸浮劑試樣約0.2g（精確至0.00001g）于50mL容量瓶中，加入1mL水，超聲使其分散，再加入30mL溶樣溶液溶解，超聲波振蕩3min，冷卻至室溫，用溶樣溶液稀釋至刻度，搖勻，使用前用0.45μm有機(jī)膜過(guò)濾。

1.3.3 測(cè)定

在上述色譜工作條件下，待基線平穩(wěn)后，連續(xù)進(jìn)樣數(shù)針標(biāo)樣溶液（其中苯醚甲環(huán)唑的峰面積為順式苯醚甲環(huán)唑和反式苯醚甲環(huán)唑的面積之和），直至相鄰兩針的峰面積差小于1.5%。按標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序依次進(jìn)行分析。

1.3.4 計(jì)算

測(cè)定完成后，將測(cè)得的同一試樣溶液的前后兩針苯醚甲環(huán)唑（或異菌脲）的峰面積，及前后兩針標(biāo)樣溶液的苯醚甲環(huán)唑（或異菌脲）的峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中苯醚甲環(huán)唑（或異菌脲）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)W（%）按式（1）計(jì)算：

其中，A1是標(biāo)樣溶液中苯醚甲環(huán)唑峰面積（或異菌脲峰面積）的平均值；A2是試樣溶液中苯醚甲環(huán)唑峰面積（或異菌脲峰面積）的平均值；m1是苯醚甲環(huán)唑（或異菌脲）標(biāo)樣的質(zhì)量，g；m2是試樣的質(zhì)量，g；w是苯醚甲環(huán)唑（或異菌脲）標(biāo)樣的純度，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的選擇

苯醚甲環(huán)唑和異菌脲的紫外光譜圖見(jiàn)圖3、圖4。由圖3和圖4可知，苯醚甲環(huán)唑和異菌脲分別在202nm和212nm有最大吸收，但受到溶劑和試樣中雜質(zhì)的干擾明顯，且響應(yīng)值過(guò)大，易超過(guò)最大響應(yīng)值。兩者在230nm處均有較強(qiáng)的吸收，靈敏度較高，能避免溶劑和試樣雜質(zhì)吸收的干擾，滿足實(shí)驗(yàn)要求，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

圖3 苯醚甲環(huán)唑的紫外吸收光譜Fig. 3 UV absorption of difenoconazole

圖4 異菌脲的紫外吸收光譜Fig.4 UV absorption of iprodione

大量實(shí)驗(yàn)證明，異菌脲在中性和堿性條件下非常不穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)采用甲醇+0.1%磷酸溶液作為溶樣溶液，可以確保苯醚甲環(huán)唑和異菌脲的穩(wěn)定性。

色譜柱選用最常用的C18柱（4.6mm×150mm ×5μm），分離效果好，分析時(shí)間短，重現(xiàn)性好。為確保苯醚甲環(huán)唑和異菌脲能完全分離，經(jīng)調(diào)試，以甲醇、乙腈和0.1%磷酸為流動(dòng)相，最終確定比例為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(0.1%磷酸)=50∶20∶30，流速為1.0 mL·min-1。在該條件下，苯醚甲環(huán)唑和異菌脲的分離效果好，峰形較好，峰純度符合要求。

2.2 分析方法的線性關(guān)系測(cè)定試驗(yàn)

按照1.3試樣溶液的制備方法，分別稱取6個(gè)不同質(zhì)量的苯醚甲環(huán)唑和異菌脲標(biāo)樣，配成質(zhì)量濃度不同的苯醚甲環(huán)唑和異菌脲標(biāo)樣溶液，以苯醚甲環(huán)唑（或異菌脲）的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到兩者的線性相關(guān)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。苯醚甲環(huán)唑的線性方程為：y=12904.2530x-23.1570，相關(guān)系數(shù)r==，r＞0.99。異菌脲的線性相關(guān)方程為：y=9563.3386x+70.9366，相 關(guān) 系 數(shù)r=1.0000，r＞0.99。兩者的相關(guān)系數(shù)均在線性范圍內(nèi)，符合定量分析要求。

圖5 苯醚甲環(huán)唑的線性關(guān)系圖Fig. 5 Linear relationship of difenoconazole

圖6 異菌脲的線性關(guān)系圖Fig. 6 Linear relationship of iprodione

2.3 方法的精密度

按照1.2的色譜條件，對(duì)同一批次的45%苯醚甲環(huán)唑·異菌懸浮劑試樣進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.082%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.46%，重復(fù)性測(cè)定結(jié)果小于0.67×2(1-0.5×logC)（修訂后Horwits公式值 為1.74）；異菌脲的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.132%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.50%，重復(fù)性測(cè)定結(jié)果小于0.67×2(1-0.5×logC)（修訂后Horwits公式值為1.69）。結(jié)果表明同一批次的45%苯醚甲環(huán)唑·異菌脲懸浮劑試樣的檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性良好，符合測(cè)定要求。

表1 分析方法的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Precision test results of analytical method

2.4 方法的準(zhǔn)確度

稱取0.03g苯醚甲環(huán)唑標(biāo)樣（精確至0.00001g）和0.02g異菌脲標(biāo)樣（精確至0.00001g）于同一個(gè)50mL容量瓶中，分別加入空白制劑0.06g，用溶樣溶液超聲溶解，定容、搖勻，于測(cè)定前過(guò)濾。在相同條件下，配制5個(gè)加標(biāo)溶液，在1.2的色譜條件下進(jìn)樣分析，分別測(cè)定合成樣品中苯醚甲環(huán)唑和異菌脲的總質(zhì)量，根據(jù)實(shí)測(cè)的添加量與理論添加量的比值，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，苯醚甲環(huán)唑和異菌脲的平均回收率分別為100.0%和99.8%，均在回收率的標(biāo)準(zhǔn)范圍98%～102%內(nèi)。

表2 分析方法的準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果Table 2 Accuracy test results of analytical method

3 結(jié)論

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用高效液相色譜方法測(cè)定45%苯醚甲環(huán)唑·異菌脲懸浮劑中的有效成分含量，分離效果好，干擾少，方法簡(jiǎn)便快速，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度和回收率滿足測(cè)定要求，是一種可行的分析方法。